血管内皮钙黏蛋白对实验性角膜新生血管的作用及机制

目的 探讨血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）在实验性角膜新生血管发生过程中的作用及机制。方法 动物实验研究。以碱烧伤诱导构建小鼠角膜新生血管模型;RT-PCR法检测VE-cadherin在碱烧伤角膜组织中的表达;碱烧伤1周后角膜局部应用阻断性抗小鼠VE-cadherin抗体进行干预,碱烧伤3周后大体观察角膜新生血管的发生情况以及全角膜铺片CD31荧光组织化学法检测角膜组织新生血管的面积;RT-PCR检测烧伤角膜组织内caspase-3 mRNA的表达;流式细胞术检测角膜组织血管内皮细胞凋亡数目;体外实验进一步验证VE-cadherin对血管内皮细胞（HREC）血管网形成的影响。采用成组t检验方法处理数据。结果 碱烧伤3周后,VE-cadherin抗体干预组角膜新生血管数目较对照组明显减少。RT-PCR结果显示VE-cadherin抗体干预组caspase-3基因水平表达增高;进一步流式细胞术检测结果显示VE-cadherin抗体干预后,角膜组织内凋亡的血管内皮细胞明显增多。体外实验证实VE-cadherin抗体明显抑制HREC细胞系血管网的形成。结论 VE-cadherin钙黏蛋白能通过维护细胞间黏附以及抑制细胞的凋亡等作用保护实验性角膜新生血管内皮细胞的生长,从而维持新生血管的发生发展。     

SDF-1和CXCR4在鼠角膜碱烧伤新生血管中的表达

目的 探讨大鼠角膜碱烧伤后基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)及其CXC受体4(CXC chemo-kine receptor 4,CXCR4)在角膜组织中的表达变化规律,以及CXCR4特异性桔抗剂AMD3100对角膜新生血管的影响.方法 采用1 mol·L-1氢氧化钠溶液建立SD大鼠角膜碱烧伤模型,用RT-PCR和Western blot检测大鼠角膜碱烧伤后不同时间点SDF-1和CXCR4的mRNA和蛋白的表达,用免疫组织化学SP法检测大鼠角膜碱烧伤后SDF-1和CXCR4在角膜组织中的阳性表达.另设碱烧伤对照组和碱烧伤治疗组,碱烧伤后分别给予0.1 mL生理盐水和AMD3100球结膜下注射,比较2组大鼠角膜新生血管面积和角膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的含量.结果 碱烧伤后SDF-1阳性表达于浅层角膜基质细胞、角膜上皮细胞和炎性浸润细胞,CXCR4阳性表达于炎性浸润细胞、角膜上皮细胞和血管内皮细胞.正常大鼠角膜组织中可检出微量SDF-1和CXCR4 mRNA和蛋白表达;碱烧伤后2 d,SDF-1 mRNA和蛋白水平明显升高,7d、10 d分别是正常水平的3.8倍和21.0倍;CXCR4 mRNA和蛋白水平在碱烧伤后2 d明显升高,7 d、10 d分别是正常水平的1.9倍和17.5倍.碱烧伤治疗组碱烧伤后7 d、10 d、14 d时新生血管面积均小于碱烧伤对照组,差异均有统计学意义(均为P<0.05).碱烧伤治疗组碱烧伤后2 d、5 d、7 d、10 d、14 d角膜组织中VEGF蛋白的含量均稍低于对照组,差异均无统计学意义(均为P>0.05).结论 SDF-1与其受体CXCR4的相互作用可能参与了碱烧伤诱导的角膜新生血管形成,AMD3100能有效抑制角膜新生血管的形成,有可能成为治疗角膜新生血管的方法之一.     

兔角膜碱烧伤的共焦显微镜及病理观察

目的采用角膜共焦显微镜活体动态观察兔角膜碱烧伤的病理改变,组织化学方法观察角膜组织病理学变化。方法NaOH造成兔角膜碱烧伤模型,烧伤后4d、20d、36d行角膜共焦显微镜检查及组织病理学检查。结果碱烧伤后4d,角膜即有炎性细胞浸润,出现少许CD4+、CD8+细胞;碱烧伤后20d,角膜基质中炎性细胞浸润明显,CD4+、CD8+细胞增多,瘢痕及新生血管形成;碱烧伤后36d,炎性细胞浸润减少,CD4+、CD8+细胞消失,仍可见瘢痕及新生血管。结论角膜共焦显微镜活体观察碱烧伤后角膜的创伤修复,反映角膜的病理状态,有助于指导临床治疗。     

甘草甜素对小鼠角膜急性碱烧伤后新生血管的抑制作用

目的：研究甘草甜素(Gly)对小鼠角膜急性碱烧伤后角膜新生血管(CNV)的抑制作用。

方法：采用碱烧伤法制备小鼠碱烧伤模型60只,随机平均分为Gly组和PBS组,分别隔天结膜下注射2g/L Gly溶液或PBS溶液,共14d。裂隙灯显微镜下观察角膜炎症反应和CNV。实验结束后取角膜行HE染色法和免疫组织化学法CD34及髓过氧化物酶(MPO)染色并计算角膜微血管密度(MVD)及中性粒细胞数。

结果：造模后第7、14d Gly组CNV面积分别是4.16±0.00、7.33±0.13mm²,显著低于PBS组(7.58±0.20、9.24±0.08mm²,均P<0.05)。HE病理染色显示正常小鼠角膜结构完整,未见新生血管形成及炎症细胞浸润; Gly组角膜新生血管数量及炎症细胞浸润较少,胶原排列较规则,而PBS组角膜基质中可见大量炎症细胞浸润及新生血管。免疫组织化学CD34染色结果显示Gly组MVD为11.13±1.46条/mm²,显著低于PBS组(34.08±2.46条/mm²,P<0.001); 免疫组织化学MPO染色结果显示Gly组中性粒细胞计数为每200倍视野17.50±1.98个,明显少于PBS组(59.56±4.79个,P<0.001)。

结论：Gly能减轻小鼠角膜急性碱烧伤模型中的角膜炎症反应,并抑制角膜新生血管形成,这为临床上有效防治角膜新生血管类疾病提供了一种新的思路。     

大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜中的表达

目的:研究大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜组织中的表达。方法:采用角膜碱烧伤法对60只Wistar大鼠制作角膜新生血管模型。裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管生长情况,免疫组化法检测碱烧伤后不同时间角膜组织中CD105的表达。结果:大鼠角膜碱烧伤后2d角膜新生血管开始形成,3～7d生长旺盛,新生血管面积达到最大,10～14d角膜新生血管生长停滞。在新生血管化角膜组织中,CD105于3～7d表达最明显,14d后表达微弱。结论:大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜组织中有明显表达。     

大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜中的表达

目的：研究大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜组织中的表达。方法：采用角膜碱烧伤法对60只Wistar大鼠制作角膜新生血管模型。裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管生长情况,免疫组化法检测碱烧伤后不同时间角膜组织中CD105的表达。结果：大鼠角膜碱烧伤后2d角膜新生血管开始形成,3～7d生长旺盛,新生血管面积达到最大,10～14d角膜新生血管生长停滞。在新生血管化角膜组织中,CD105于3～7d表达最明显,14d后表达微弱。结论：大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜组织中有明显表达。     

MiR-497对角膜新生血管的抑制作用及其靶向STAT3调控机制

目的探讨miR-497在碱烧伤诱导的角膜新生血管(CNV)形成过程中的作用及其机制。方法选用健康清洁级6～8周龄野生型(WT)C57BL/6小鼠42只以及成功鉴定为CRISPR/Cas9介导的miR-497敲除(KO)和过表达转基因(TG)小鼠各42只, 分别作为WT组、KO组和TG组。构建角膜碱烧伤模型, 分别于造模后第3、7、14、21天行裂隙灯显微镜检查并进行角膜上皮损伤评分和角膜基质混浊评分, 测量CNV面积;采用组织病理染色法观察角膜结构变化和炎症细胞的表达;采用免疫组织化学染色法检测角膜组织中CD31的表达;采用荧光素酶报告基因检测miR-497与信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)之间的靶向结合关系;采用实时荧光定量PCR法检测各时间点小鼠角膜组织中miR-497以及血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1 mRNA的相对表达量变化;采用Western blot法检测各组造模后14 d角膜组织中STAT3、p-STAT3蛋白的表达。结果小鼠角膜碱烧伤后出现角膜损伤和炎症细胞浸润, 同...     

雷帕霉素滴眼液对碱烧伤角膜新生血管的影响

目的探讨雷帕霉素（Rapamycin）滴眼液对兔碱烧伤后角膜新生血管的抑制作用。方法48只新西兰白兔右眼碱烧伤制成新生血管模型,随机分成A组（0．1％雷帕霉素滴眼液组）,B组（0．5％雷帕霉素滴眼液组）,C组（1％雷帕霉素滴眼液组）,D组（赋形剂对照组）。烧伤后每天滴眼4次。观测角膜浑浊、融解情况和新生血管生长并测量长度。角膜组织HE染色观察病理改变,炎性细胞计数,免疫组化检测角膜内皮生长因子（VEGF）的表达。结果碱烧伤后各组角膜均出现不同程度的角膜浑浊、融解,随时间延长,对照组角膜浑浊、融解明显,角膜基质内大量炎性细胞浸润和粗大新生血管形成。治疗组的角膜浑浊、融解减轻,伤后7d、14dB、C组炎症细胞计数、角膜新生血管面积及VEGF表达均小于对照组（P〈0．05）。各组角膜新生血管面积与角膜炎性细胞数及VEGF表达呈正相关。结论0．5％及1％雷帕霉素滴眼液可有效抑制碱烧伤引起的角膜免疫炎症反应,抑制角膜新生血管的生长,为眼碱烧伤后角膜新生血管的治疗提供了新的选择。     

结膜下注射AMD3100对小鼠角膜碱烧伤血管新生的治疗作用

目的探讨结膜下注射AMD3100对小鼠角膜碱烧伤血管新生的治疗作用及其机制。方法采用碱烧伤法诱导小鼠角膜血管新生（CNV）形成。在碱烧伤后当天,治疗组和对照组分别在球结膜下注射AMD31005μg（10μL）和生理盐水（10μL）,每日1次,连续用药7d。裂隙灯显微镜下观察不同时间点角膜炎症指数。病理组织学检查观察炎症细胞数量,并采用免疫组化检测角膜组织微血管密度。结果实验组在碱烧伤后不同时间点的炎症指数、炎症细胞数量和微血管密度均明显少于对照组（P〈0．05）。结论AMD3100可有效抑制CNV,可能与减轻碱烧伤后炎症反应有关。     

苦参碱对大鼠角膜新生血管的抑制作用

目的观察苦参碱对大鼠角膜烧伤后新生血管生成的抑制作用。方法选取Wistar大鼠32只,建立碱烧伤角膜新生血管模型,随机分成对照组和3个不同剂量的苦参碱实验组,每组8只(16眼)。模型建立后,实验组大鼠在结膜下注射不同剂量的苦参碱(0.2mg、0.4mg、0.8mg),对照组注射生理盐水,在裂隙灯下动态观察大鼠角膜新生血管生长情况并计算角膜新生血管的面积,观察周期为21d。于造模后4d、7d、14d、21d取不同剂量的苦参碱实验组大鼠角膜进行组织病理学检测,采集各组大鼠的角膜标本,用免疫组化法检测角膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,计算其平均光密度值;采用RT-PCR方法检测各组大鼠角膜组织中VEGF mRNA的表达。结果碱烧伤后4d、7d、14d、21d,与对照组相比,各实验组大鼠新生血管面积明显减少,差异均有显著统计学意义(P<0.01);造模后14d时,不同剂量的苦参碱实验组新生血管密度计数(17.83±2.32、11.00±2.37、10.87±2.41)明显低于对照组(21.11±2.14)(P<0.05);各实验组角膜VEGF的平均光密度值均小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);各实验组VEGF mRNA水平与对照组相比也显著下降(P<0.05)。结论结膜下注射苦参碱对大鼠角膜碱烧伤后的新生血管生长有抑制作用。     

角膜碱烧伤中PMNs与MMP-9的关系

目的：研究角膜碱烧伤后基质损伤修复病程中多形核中性白细胞(PMNs)的浸润和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达的关系。

方法：建立25只家兔角膜碱烧伤模型,分别于伤后3、7、14、21、28d随机处死5只兔,裂隙灯下观察角膜病理修复情况,摘除角膜做病理切片,测定PMNs的浸润量值。免疫组化法测定MMP-9的表达。

结果：PMNs和MMP-9在角膜碱烧伤后的3d开始升高,14d上升达到最大峰值,之后逐渐降低,碱烧伤后角膜基质在第14d溃疡面积及深度最为严重。

结论：角膜碱烧伤病灶中PMNs和MMP-9的量值呈正相关,且角膜的病理损伤与PMNs的浸润和MMP-9的表达密切相关。     

自体血清与小牛血去蛋白眼用凝胶治疗兔角膜碱烧伤的比较

目的:通过建立兔角膜碱烧伤模型,比较自体血清与小牛血去蛋白眼用凝胶在兔角膜碱烧伤治疗中的效果。方法:制作兔右眼角膜碱烧伤模型30眼,造模后碱烧伤分度全部为Ⅲ度烧伤,将其随机分为三组,分别采用生理盐水、小牛血去蛋白眼用凝胶及自体血清滴眼液4次/d,各组滴阿托品眼用凝胶1次/晚,氧氟沙星眼用凝胶1次/晚,连续2wk。治疗7、14d后观察角膜新生血管形态并计算面积;第14d处死各组实验动物后,摘除双眼角膜,其中左眼为正常对照,右眼为实验眼,分别进行常规组织病理学检查,角膜组织匀浆内CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF浓度测定。结果:治疗7、14d后小牛血去蛋白眼用凝胶组角膜新生血管面积(29.48±2.27、34.19±2.67mm2)与自体血清组(34.19±2.67、33.89±2.74mm2)无差异(P>0.05)。治疗14d角膜组织匀浆测定:小牛血去蛋白眼用凝胶组(0.56±0.04ng/mL)和自体血清组(0.54±0.05ng/mL)CD45含量均小于生理盐水组(1.27±0.07ng/mL)(P<0.05);自体血清组(452.49±11.40pg/mL)和小牛血去蛋白眼用凝胶组(332.49±13.67pg/mL)IL-10含量均大于生理盐水组(111.05±6.95pg/mL)(P<0.05);小牛血去蛋白眼用凝胶组(23.20±2.89pg/mL)和自体血清组(22.61±2.72pg/mL)IFN-γ含量均小于生理盐水组(41.77±4.26pg/mL)(P<0.05);小牛血去蛋白眼用凝胶组(151.14±18.21pg/mL)和自体血清组浓度(149.11±14.75pg/mL)VEGF含量均小于生理盐水组(391.35±28.59pg/mL)(P<0.05)。结论:兔角膜碱烧伤后抑制炎症因子CD45、IFN-γ及VEGF释放及抑制角膜新生血管形成方面,自体血清与小牛血去蛋白眼用凝胶作用相当;在促进抗炎因子IL-10释放、抑制炎症细胞浸润方面,自体血清作用强,小牛血去蛋白眼用凝胶次之。     

水通道蛋白1在大鼠角膜碱烧伤新生血管形成中的表达

目的检测大鼠角膜碱烧伤后新生血管形成过程中水通道蛋白1（AQP1）的表达变化,探讨其在角膜新生血管（CNV）形成中的作用。方法碱烧伤诱导CNV模型,将25只sD大鼠按处死的时间点不同分成5组,每组5只。每日裂隙灯下观察CNV的生长情况,并采用免疫组织化学法和RT-PCR法检测AQP1及VEGF在大鼠CNV形成中的表达。结果在正常大鼠角膜组织中,AQP1和VEGF不表达或弱表达。碱烧伤后1d,AQP1表达开始增强,第7天表达最强,14d下降,21d时仍有弱表达。RT—PCR检测显示碱烧伤后AQP1表达增强,在伤后第7天表达最明显,21d后呈弱表达（t1d=3．491,t4d=10．690,t7d=12．936,t14d=10．767,t21d=8．594,P〈0．05）。免疫组织化学检测结果表明,VEGF与AQP1的表达分布相似,强度较弱,统计学分析表明二者的表达水平呈正相关（r=0．834,P〈0．05）。结论AQP1在碱烧伤后角膜巾的表达水平与新生血管的形成明显相关。     

高危角膜移植排斥兔模型的建立及对比研究

背景 理想的角膜移植排斥动物模型是研究高危角膜移植免疫排斥机制的基础,具有重要的意义. 目的 比较各种建立兔高危角膜移植排斥模型方法的临床特点,探索合适的角膜移植排斥动物模型的建立方法.方法 45只新西兰白兔作为角膜移植受体,并按照造模方法的不同按随机数字表法随机分为缝线组、碱烧伤组和异种移植组,每组15只.分别用在角膜4个象限各间断缝1根5-0丝线法和1 mol/LNaOH碱烧伤法诱导角膜新生血管(CNV),再建立兔同种异体角膜移植;另一组以猫角膜为供体,建立猫-兔异种角膜移植模型.于第2周和第4周观察植片的组织学情况,对3个组角膜植片裂隙灯下观察植片排斥反应、炎症和新生血管,对植片水肿程度及炎症指数(IF)进行评分,根据角膜混浊、水肿及新生血管合计值计算排斥指数(RI).用免疫组织化学法检测CD4+T细胞和CD8+T细胞在植片组织中的表达. 结果 缝线组、碱烧伤组和异种移植组分别有14、15、15只兔完成穿透角膜移植术.术后2周,3个组IF中位数分别为0.556、0.778、0.222,差异有统计学意义(H=25.736,P=0.000),异种移植组IF值低于缝线组和碱烧伤组,差异均有统计学意义(Z=3.841、3.993,P=0.000),缝线组IF值低于碱烧伤组,差异有统计学意义(Z=3.568,P=0.000).术后2周,3个组RI中位数分别为2、6、3,差异有统计学意义(H=22.432,P=0.000),异种移植组RI高于缝线组而低于碱烧伤组,差异均有统计学意义(Z=2.373,P=0.018;Z=3.936,P=0.000),缝线组RI低于碱烧伤组,差异有统计学意义(Z=3.729,P=0.000).3个组植片存活时间分别为(17.9±2.0)、(13.4±2.4)、(15.5±2.0)d,差异有统计学意义(F=9.474,P=0.001).异种移植组的新生血管面积均低于缝线组和碱烧伤组(P＜0.05).术后2周和4周,组织病理学检查可见异种移植组植片中的炎性细胞少于缝线组和碱烧伤组,3个组植片中均出现以CD4+T细胞为主的细胞浸润. 结论 猫-兔异种角膜移植模型较缝线和碱烧伤法制作的角膜移植模型炎症反应轻、新生血管少,角膜免疫排斥反应稳定、适度,是理想的高危角膜移植动物模型.     

米诺环素对碱烧伤大鼠角膜新生血管生成的影响及其作用机制

目的 探讨米诺环素对碱烧伤大鼠角膜新生血管生成的影响及其作用机制.方法 选取SPF级健康SD 大鼠72 只(取右眼为实验眼),从中随机选取24 只(24 眼)作为空白对照组(不做任何干预),其余48 只采用1 mol.L-1 NaOH 浸润过的实验滤纸建立角膜碱烧伤模型,然后随机分为溶剂对照组和米诺环素组,每组24 只...     

人羊膜作为载体体外培养兔角膜上皮细胞移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的观察培养生长于人羊膜的兔角膜上皮细胞使其扩增并移植治疗角膜碱烧伤的效果。为培养角膜上皮细胞移植技术及应用于临床实践提供最佳的理论和实验依据。方法新西兰白兔30只（30眼）,随机分为3组（n=10）,右眼制成碱烧伤模型。A组：角膜上皮细胞羊膜移植组;B组单纯羊膜移植组;C组为对照组（碱烧伤后不作任何移植）。术后观察角膜透明度、角膜新生血管及上皮修复情况,裂隙灯显微镜照相记录。3组均于术后1周、2周、1个月及3个月时各取1眼角膜标本行病理组织检查。结果A组除1眼移植片在第7天脱落外,所有移植片在术后3d水肿消退,角膜逐渐透明。B组移植片持续水肿,眼前段炎性反应稍重,但较碱烧伤对照组轻。C组角结膜高度水肿浑浊,烧伤后观察3个月未发现角膜恢复透明现象。病理组织检查显示：A组角膜及周边上皮细胞为多层结构,角膜新生血管消失,基质的炎性细胞浸润减退;B组覆盖上皮细胞表现为完整上皮细胞型,C组角膜浑浊,新生血管及肉芽组织形成。结论人羊膜作载体体外培养兔角膜上皮细胞移植重建角膜基底膜和角膜上皮结构治疗兔碱烧伤后的角结膜损伤是一种合理有效的方法。     

PXN-pY31、PXN-pY118在小鼠角膜新生血管形成中的表达变化

目的　探讨Paxillin（PXN）-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸在小鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管形成过程中的表达变化。方法　取健康6~8周龄雄性C57BL6小鼠36只,均右眼建立角膜碱烧伤模型为实验组,左眼不作任何处理为对照组,观察碱烧伤后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d 角膜新生血管情况,并行免疫组织化学染色;Western blot 检测实验组碱烧伤后1 d、3 d、5 d、7 d时PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸在角膜中的表达变化。结果　对照组角膜无新生血管生成,PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸在角膜中未见表达。实验组角膜新生血管长度、钟点数及面积随着碱烧伤后时间的延长均呈曲线样改变。免疫组织化学染色检测结果显示,实验组角膜中PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸的表达均较对照组增强,其动态过程与角膜新生血管的发展进程一致。Western blot检测结果示,实验组碱烧伤后3 d PXN-pY³¹,PXN-pY¹¹⁸的表达显著升高;碱烧伤后5 d,PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸的表达达到高峰;碱烧伤后7 d,PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸表达开始下降。碱烧伤后3 d、5 d、7 d时PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸的表达与碱烧伤后1 d相比,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸在角膜损伤的病理机制中发挥作用,其表达变化与角膜新生血管的生长情况相关。