实时荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核杆菌DNA的临床应用

结核病是严重危机全球公共卫生的问题之一。结核病的病原学检测是发现传染源的主要手段,是确定结核病的依据,在结核病的预防和治疗工作中起着不可或缺的重要作用^[1]。近年来随着结核分子生物学诊断技术的快速发展,其快速、敏感、特异性高等的优点使其在临床逐渐得到应用。其中实时荧光定量聚合酶链反应（FQPCR）阳性结果可作为结核病诊断的重要临床依据。     

实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义

目的用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者HBV—DNA结果进行分析,以探讨其临床诊疗意义。方法对850例临床标本用时间分辨荧光免疫技术定量测定乙肝病毒血清学指标,用荧光定量PCR法检测血标本中的HBV—DNA,并依据乙肝两对半结果进行归类分组。结果302份HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、HBcAb（＋）标本中有261份HBV—DNA为阳性,阳性率为86．4％,其PCR定量拷贝数为（2．21±0．76）×10^7／ml;321份HBsAg（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）标本有96份HBV—DNA阳性,阳性率达到29．91％,PCR定量拷贝数为（1．69±0．98）×10^6／ml;32份HBsAg（＋）、HBcAb（＋）标本中有9份HBV—DNA为阳性,阳性率为28．13％,28份HBeAb（＋）、HBcAb（＋）标本有4份PCRHBV—DNA阳性,阳性率14．29％;11份HBcAb（＋）标本有6份PCRHBV—DNA阳性,阳性率为42．9％;74份HBsAb（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）标本有5份HBV—DNA阳性,阳性率6．75％;13份HBsAb（＋）、HBeAb（＋）阳性标本有2份PCRHBV—DNA阳性,阳性率为14．3％;12份HBsAb（＋）、HBcAb（＋）标本有1份HBV—DNA阳性,阳性率7．69％;4份HBsAb（＋）的标本HBV—DNA均为阴性,PCR定量拷贝数为〈1．00E×103;24份HBsAg（＋）、HBsAb（＋）、HBeAg（＋）、HBcAb（＋）标本中有21份HBV—DNA为阳性,阳性率为87．50％;1份HBsAg（＋）标本HBV—DNA均为阳性,阳性率为100％;10份HBsAg（＋）、HBsAb（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）标本有3份HBV—DNA均为阳性,阳性率30．00％,其余38例全阴性结果和各少见模式基本见有HBV—DNA的检出。结论PCR定量测定HBV—DNA可以真实反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况,更有利于临床治疗和疗效观察。     

应用荧光定量PCR检测乙型肝炎DNA的临床分析

目前,乙肝诊断试验多选用ELISA法检测HBsAg。由于免疫法HBsAg检测敏感性较低,如果血清标志物出现在窗口期,或者乙型肝炎病毒存在低水平的复制,此时HBsAg滴度较低而用免疫法不易测出。同时,因为目前各医院广泛采用一步法进行检测及高滴度时易出现的HOOK效应,导致检测结果同临床不符合。而在乙型肝炎尤其是慢性乙型肝炎的诊断和治疗过程中,必须了解病毒在体内的复制状态。肝穿刺病理结合临床是目前乙肝防治规范中判断乙肝病毒复制对肝脏损害的最确切的方法,但该项实验有危险性。而HBV—DNA的检测可以克服其不足,已用于乙肝的临床诊断和治疗效果监测、流行病学调查、发病机制研究、     

实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初步临床应用

目的 评价实时荧光定量PCR技术检测血浆（或血清）结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）DNA的技术。方法 建立实时荧光定期量PCR方法测定血浆MTB DNA,分别检测临床确诊的55例结核病患者血清43份,血浆25份以及非结核肺部疾病患者血清18份,健康体检血清18份和健康体检者血浆11份的MTB DNA含量。结果 18例非结板肺疾病患者血清、18例健康体检者血清以及11例健康体检者血浆MTB DNA全部阴性。55例初诊结核患者中10例（18．2％）治疗前血浆（或血清）MTB DNA阳性。在痰涂片阴性的18例结核患者中,血浆（或血清）MTB DNA阳性检出率为27．8％（5／18）,其特异性达100％。结论 本研究证实了结核患者血浆（或血清）循环MTB DNA的存在,其定量检测对痰涂片阴性及无痰患者的结核病诊断有重要参考价值。     

实时荧光定量PCR检测曲霉DNA技术的建立与临床应用

目的 利用LightCycler建立一种简便、特异的实时荧光定量PCR检测方法,用于系统性曲霉感染的快速检测.方法 用自行设计的高效率引物对标准菌株和临床疑为系统性曲霉感染患者血标本进行实时荧光定量PCR检测,对方法的敏感度和特异度进行评价,并与半乳甘露聚糖抗原检测比较.结果 琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物分子量与预期分子量一致,熔解曲线峰值单一,对应温度值与预期值相同.检测97例可疑曲霉感染血标本,27例阳性,其中一次阳性7例,间断阳性14例,连续阳性6例,与临床诊断符合率为90%.结论 荧光定量PCR可敏感、特异地检测曲霉感染,有一定的临床应用前景.     

实时荧光PCR方法与痰涂片法检测结核杆菌的价值分析

目的比较实时荧光PCR法和痰涂片法检测结核杆菌的价值。方法选取2017年1月至2019年2月某中心结核门诊接诊的疑似肺结核患者95例,采集晨痰标本,分别予以痰涂片检测、PCR检测、MGIT960液体分离培养,观察比较三种检测方法的结核杆菌阳性检出率,以MGIT960液体分离培养法为金标准,对比实时荧光PCR法和痰涂片法的检测准确性、敏感度、特异度以及与MGIT960液体分离培养法检测结果的一致性。结果痰涂片法结核杆菌阳性检出率为29.47%(28/95),实时荧光PCR法检出率为37.89%(36/95),MGIT960液体分离培养法检出率为38.95%(37/95),三种检测方法结核杆菌阳性检出率比较差异无统计学意义(χ~2=2.239,P=0.3260.05)。痰涂片法检测结果与MGIT960液体分离培养法结果对比差异无统计学意义(P0.05),与MGIT960液体分离培养法结果一致性中等(K=0.467)。实时荧光PCR法检测结果与MGIT960液体分离培养法结果对比差异无统计学意义(P0.05),与MGIT960液体分离培养法结果一致性较好(K=0.933)。实时荧光PCR法检测准确率、敏感度均高于痰涂片法,对比差异有统计学意义(P 0.05),但两种检测方法特异度比较差异无统计学意义(P0.05)。结论实时荧光PCR法检测结核杆菌,能够提升结核杆菌阳性检出率,检测准确率、敏感度较高,与MGIT960液体分离培养法检测结果一致性较好,应用价值优于痰涂片检测。     

436例PCR检测结核杆菌DNA结果分析

结核病是长期以来危害人类生命健康的严重疾病。为了加强结核病的防治工作，国家卫生部位近将原是丙类传染病的肺结核废增列为乙类传染病管理。从全球和全国结核疫情看，防治形势相当严峻。我国现患肺结核病人约600万，每年病死约25万人。此外，骨结核、肾结核、淋巴结核也有所上升。近几年来，随着医学科学技术的不断发展，目前有条件的医院都将先进的分子生物学（如PCR）运用到结核病的诊断中，克服了过去结核菌难培养或阳性率低以及所需长时间才能出报告的弊端，确实具有快速、灵敏、简便、特异的特点；所以，越来越被人们广泛的接受和…     

实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的应用评价

目的探讨实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌核酸DNA浓度的检测范围和检测健康人全血中核酸DNA的Ct本底值。方法采用试剂盒提取纯菌、健康人和临床患者血液中的核酸DNA,应用实时荧光定量PCR进行检测。结果经检测,40份健康人群血液标本Ct值平均值为37.0,标准差为1.9,Ct值95%置信区间为33.0~38.8。将布鲁氏菌核酸DNA标准品倍比稀释(56.2 ng^0.026 5 fg),实时荧光定量PCR检测灵敏度为6.7fg。结论实时荧光定量PCR检测纯菌核酸DNA的灵敏度相当于2个基因组DNA拷贝数,但用于检测血液标本尚待进一步研究。     

HBV-DNA实时荧光定量PCR检测试剂盒性能验证

目的基于ISO15189:2012要求,对一种国产HBV-DNA实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒的性能参数进行验证,以评价其是否可应用于临床检测。方法依据《医学实验室质量和能力认可准则》相关文件对试剂盒的正确度、精密度、检测下限、线性范围、特异度和抗干扰能力进行性能验证。结果试剂盒正确度符合要求(靶值对数值±0.4)。低值和高值的批内精密度CV为4%、0.65%,标准差(s)为0.19、0.04;低值和高值的中间精密度CV为4.75%、1.33%,s为0.17、0.09。HBV-DNA定量的检测下限定为100IU/mL。线性范围为1.00×102~5.00×108 IU/mL。特异度符合要求。血红蛋白浓度不大于28g/dL、总胆红素浓度不大于30mg/dL、三酰甘油浓度不大于3 200mg/dL,对检测结果没有影响(靶值对数值±0.4)。结论试剂盒的性能参数符合厂家声明,可以应用于临床检测工作。     

PCR技术检测结核杆菌的临床应用

结核病是长期以来危害人类生命健康的严重疾患，在发展中国家结核病迄今仍是常见病，我国近年来发病率也有所上升，随着基因工程在医学科学中的应用，一些大、中型医院都将更先进的分子生物学，运用到结核病的诊断中。但仍有多数结核病的确诊主要还是依靠痰涂片，染色镜检抗酸杆菌和结核杆菌的培养与鉴定，痰涂片阳性率低，且不能明确诊断，     

实时荧光定量PCR在人血液循环DNA检测中的应用

循环DNA主要存在于人血浆和血清等体液中，在多种人类疾病中含量升高，具有临床诊断意义和预后判断价值。本研究以人工重组质粒DNA为内参照物，建立双重实时荧光定量PCR检测方法，对健康人血浆和血清DNA含量进行定量测定。[第一段]     

实时荧光定量PCR在EB病毒DNA检测中的应用

目的探讨实时荧光定量PCR技术在检测患者外周血单个核细胞(PBMC)中EB病毒(EBV)DNA定量的临床应用,比较实时荧光定量PCR在检测血浆和PBMC中EBV DNA含量的差别,并研究EBV阳性患者的病种分布特点。方法应用罗氏Light Cycler荧光定量PCR仪检测375例患者PBMC中EBV DNA含量,所有阳性患者均用血浆进行复查,比较其差别,并回顾性分析患者临床特点。结果检测PBMC中EB阳性标本35例,阳性率为9.3%。阳性患者中鼻炎13例,鼻咽癌4例,鼻息肉4例,肺炎7例,急性淋巴细胞性白血病1例,传染性单核细胞增多症6例。取阳性标本检测其血浆游离EB DNA,33例阳性,其拷贝数低于相应标本中PBMC中的拷贝数。结论实时荧光定量PCR技术检测PBMC和血浆中EB DNA准确,快速,在确诊EBV感染相关性疾病中具有重要的作用,且检测PBMC中EB DNA可能更优于检测血浆中EB DNA。     

实时荧光定量PCR在肺炎支原体DNA检测中的应用

支原体（Mycoplasma）是1898年Nocard等发现的一种类似细菌但不具胞壁的原核微生物。支原体种类繁多,对人致病的有肺炎支原体、人型支原体、解脲脲原体等。肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）引起的主要疾病有原发性非典型肺炎、咽炎和气管支气管炎。MP是儿科患者呼吸道感染的常见病原体之一。     

荧光定量PCR技术在结核杆菌检测中的应用

目的：建立结核病荧光定量PCR快速检测方法。方法：建立检测结核杆菌的荧光定量PCR方法并进行特异性、敏感性、重复性实验，对临床样品进行检测分析。结果：该方法的敏感性达到了1Pg，且特异性高．重复性好。应用荧光定量PCR法及抗酸染色、结核杆菌培养法，对332例活动性肺结核患者晨痰、215例活动性肺结核患者外周血、187例结核性胸膜炎患者胸水进行检测．荧光定量PCR技术阳性率分别为53．0％（176／332）、34．4％（74／215）、36．9％（69／187），经统计学比较分析，3种方法检测率差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：荧光定量PCR技术具有简便、快速、防污染、敏感性与特异性高等优点，是结核病诊断的有效方法之一。[著者文摘]     

实时荧光定量 PCR 检测 HBV DNA 的线性范围与最低检出限的验证

目的：试用实时荧光定量 PCR 定量检测乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）,求出其线性范围与最低检出限,从而对本实验室检测 HBV DNA 的主要性能进行验证。方法参照相关的文件,通过系列稀释高浓度标本得到超过厂家申明线性范围的系列浓度标本,进行线性范围的验证;通过系列稀释低浓度标本得到超过厂家申明最低检出限的系列浓度标本,进行最低检出限的验证。结果 HBV DNA 检测的线性范围为8．58＆#215;102～8．41＆#215;107 IU/mL,最低检出限为4．07＆#215;102 IU/mL。结论实时荧光定量 PCR 检测 HBV DNA 的线性范围与最低检出限达到预期要求,检测方法和验证方案简便、可行。     

实时荧光定量PCR检测HBV DNA的线性范围与最低检出限的验证

目的 试用实时荧光定量PCR定量检测乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA),求出其线性范围与最低检出限,从而对本实验室检测HBV DNA的主要性能进行验证。方法 参照相关的文件,通过系列稀释高浓度标本得到超过厂家申明线性范围的系列浓度标本,进行线性范围的验证;通过系列稀释低浓度标本得到超过厂家申明最低检出限的系列浓度标本,进行最低检出限的验证。结果 HBV DNA检测的线性范围为8.58×102~8.41×107 IU/mL,最低检出限为4.07×102 IU/mL。结论 实时荧光定量PCR检测HBV DNA的线性范围与最低检出限达到预期要求,检测方法和验证方案简便、可行。     

荧光定量PCR检测结核杆菌DNA与涂片抗酸染色结果的比较

目的:探讨荧光定量PCR检测结核杆菌DNA的拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度的相关性.方法:对可疑结核病患者的124份痰样本同时进行荧光定量PCR检测和涂片抗酸染色镜检,按涂片抗酸染色镜检结果阴性(-)、可疑(±)、1+、2+、3+、4+分类,对荧光定量PCR检测结核杆菌DNA的拷贝数进行统计分析.结果:98例涂片阴性痰样本中,24例样本荧光定量PCR检测阳性,结核杆菌DNA拷贝数多为102～103数量级;26例痰涂片阳性样本中,24例样本荧光定量PCR检测阳性,2例检测阴性,结核杆菌DNA拷贝数多为103～104数量级,和涂片阳性程度基本呈正相关.结论:荧光定量PCR检测结核杆菌DNA与涂片抗酸染色镜检阳性程度有较好的相关性,可以作为临床诊疗较为可靠的实验方法.     

实时荧光PCR与DNA测序技术检测手足口病病毒结果分析

目的探讨实时荧光PCR与DNA测序技术检测手足口病病原体的临床价值。方法前瞻性选取2017年03月～2019年06月诊治的126例疑似感染手足口病患儿进行研究,经病毒分离培养确诊为手足口病共92例,且予以实时荧光PCR与DNA测序技术检测,对比检测后的阳性预测值、阴性预测值,以及EV、EV-71、CA-16检出率,评估实时荧光PCR与DNA测序技术诊断手足口病病毒的AUC值、敏感度、特异度及约登指数。结果 126例疑似感染手足口病患儿经病毒分离培养确诊为手足口病共92例、百分比为73.02%;其中检出EV病毒48例、占52.17%,检出EV-71病毒32例、占34.78%,检出CA-16病毒16例、占17.39%;经实时荧光PCR检测后阳性例数为90例、阳性预测值为96.77%,检出EV病毒47例、占52.22%,检出EV-71病毒31例、占34.44%,检出CA-16病毒12例、占13.33%;与金标准相比,差异无统计学意义(P均0.05)。经DNA测序技术检测后阳性例数为71例、阳性预测值为83.53%,检出EV病毒38例、占53.52%,检出EV-71病毒20例、占28.17%,检出CA-16病毒13例、占18.31%;低于金标准(P均0.05);且实时荧光PCR的准确率均高于DNA测序技术,而误诊率、漏诊率低于DNA测序技术(P均0.05)。ROC曲线分析显示,实时荧光PCR、DNA测序技术诊断手足口病的AUC分别为(0.945、0.680,P0.05),敏感度分别为97.80%、77.20%,特异度分别为91.20%、58.80%。结论实时荧光PCR与DNA测序技术在手足口病病毒检测结果中,前者更加快捷,灵敏度、特异度更高。     

实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清miR-375,并进行临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-375的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-375表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copy/μL范围内有良好的线性关系(r2=0.997),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于健康体检者,差异有统计学意义(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR能敏感、特异地检测血清中miR-375的表达水平,为下一步临床应用研究奠定了方法学基础。