微生物聚集体形态对多重耐药质粒接合转移的影响

目的研究水污染控制系统中微生物聚集体形态对多重耐药质粒接合转移的影响,为控制耐药基因在水环境中的传播提供科学依据。方法向运行稳定的颗粒污泥序批式反应器(granular sequencing batch reactor,GSBR)中投加具有利福平抗性且携带RP4质粒的大肠杆菌K12〔E.coli K12(RP4)Rif〕,将系统中的污泥按照粒径划分为4个区间,分别用定量PCR方法对污泥中总细菌16S r DNA和耐药质粒RP4进行定量,从而得到不同粒径区间的接合转移比例;同时监测GSBR中NH4+-N、CODCr的去除效率和污泥浓度(MLSS),以评价GSBR运行效能。结果投加供体菌后,系统中的供体菌所占比例在2 d内出现急剧下降,此后3~5 d,RP4所占比例一直稳定在10-7~10-6。从投加供体菌的第7天开始,粒径大于0.9 mm的微生物聚集体中无法检测出RP4;粒径范围在0.18~0.45 mm、0.46~0.9 mm的微生物聚集体中的RP4质粒在投加后的第11天消失;而粒径小于0.18 mm的絮状污泥中的RP4在投加供体菌后第19天消失。RP4在不同粒径微生物聚集体中的接合转移率明显不同,随着粒径的增大而降低。系统中投加供体菌后CODCr、NH4+-N的去除率均明显下降;污泥浓度(MLSS)从4855 mg/L降至3168 mg/L。结论实验过程中微生物聚集体的形态对耐药质粒RP4的接合转移有明显影响,粒径越大其接合转移率越低;且在投加供体菌初期,反应器NH4+-N、CODCr的去除能力下降明显,供体菌的投加也使污泥浓度的MLSS下降。     

多重耐药菌E.coli K12(RP4)对颗粒污泥生物处理系统氨氧化细菌的影响

目的研究多重耐药菌对颗粒污泥生物处理系统硝化过程中氨氧化细菌的影响,为降低耐药基因对生物处理系统的风险提供理论依据。方法向正常运行的颗粒污泥序批式反应器(GSBR)中投加携带多重耐药质粒RP4的E.coli K12(RP4),监测GSBR氨氮去除效率,利用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和实时荧光定量PCR技术对不同粒径颗粒污泥中氨氧化细菌的菌群结构和丰度进行分析比较,以探讨多重耐药菌对氨氧化细菌的影响。结果接种E.coli K12(RP4)后,GSBR氨氮去除率从94.7%降低至32.8%,恢复12 d后,去除率达95%以上。颗粒污泥中,粒径越大,氨氧化细菌菌群结构越稳定。在各粒径污泥中,亚硝化单孢菌均占据优势地位,是降解氨氮的主要菌群。反应初期,氨氧化细菌的丰度并未因E.coli K12(RP4)的投加而发生较大变化,直至运行后期絮状污泥和小粒径颗粒污泥新生氨氧化细菌丰度呈现明显上升趋势,其与氨氮去除效果恢复呈现相关性。结论耐药菌E.coli K12(RP4)影响了氨氧化细菌的代谢活性,从而导致污水生物处理系统硝化效果下降。     

HORIZONTAL TRANSFER OF ANTIBIOTIC-MULTIRESISTANT PLASMID RP4 IN MEMBRANE BIO-REACTOR

目的 研究多重耐药质粒RP4在膜生物反应器(MBR)中水平转移情况,进而预测MBR处理含有耐药基因污水的生态风险.方法 向正常运行的MBR中接种E.coli K12(RP4)Rif,利用含有不同抗生素的营养琼脂培养基选择性平板计数,得出可培养接合子数量和接合转移率;并利用实时定量PCR方法检测污泥中耐药质粒RP4;同时监测MBR对NH4+ -N、CODCr的去除效率和污泥浓度(MLSS),以评价MBR运行效能.结果 接种供体菌后,可培养接合子数量、转移频率由0逐渐升高,接种供体菌后第9d,接合子数量增加到3.38×104 cfu/ml、接合转移率达1.70×10-3/cell;随后,可培养接合子数量、接合转移率都呈现波动下降(于第23天分别下降至2.55×102 cfu/ml、3.20 × 10-5/cell);与实时定量PCR检测结果基本一致.供体菌的引入对MBR去除NH4+ -N、CODCr的效率都有一定影响,即先降低后逐渐升高,污泥浓度由2200 mg/L逐渐降低至约1100 mg/L.结论 实验过程中,RP4质粒在反应器中发生了较高频率的接合转移,并对反应器NH4+ -N、CODCr的去除效率都产生影响.     

多重耐药质粒RP4在膜生物反应器中的水平转移

目的研究多重耐药质粒RP4在膜生物反应器(MBR)中水平转移情况,进而预测MBR处理含有耐药基因污水的生态风险。方法向正常运行的MBR中接种E.coli K12(RP4)Rif,利用含有不同抗生素的营养琼脂培养基选择性平板计数,得出可培养接合子数量和接合转移率;并利用实时定量PCR方法检测污泥中耐药质粒RP4;同时监测MBR对NH4+-N、CODCr的去除效率和污泥浓度(MLSS),以评价MBR运行效能。结果接种供体菌后,可培养接合子数量、转移频率由0逐渐升高,接种供体菌后第9 d,接合子数量增加到3.38×104cfu/ml、接合转移率达1.70×10-3/cell;随后,可培养接合子数量、接合转移率都呈现波动下降(于第23天分别下降至2.55×102cfu/ml、3.20×10-5/cell);与实时定量PCR检测结果基本一致。供体菌的引入对MBR去除NH4+-N、CODCr的效率都有一定影响,即先降低后逐渐升高,污泥浓度由2200 mg/L逐渐降低至约1100 mg/L。结论实验过程中,RP4质粒在反应器中发生了较高频率的接合转移,并对反应器NH4+-N、CODCr的去除效率都产生影响。     

荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染方法的建立

目的 建立Taqman探针法荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法.方法 针对肺炎链球菌自溶素基因设计引物及探针,建立荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链球菌感染.采用肺炎链球菌标准株,构建质粒,用质粒构建标准品,扩增标准品,绘制标准曲线并检验新建荧光定量PCR的敏感性,采用本实验冻存其他菌DNA样本,检测其特异性;采集2015年9月至2015年12月份北京地区家5家医院儿童门诊或病房,诊断为呼吸道感染患儿的咽拭子标本133例,对新建荧光定量PCR法进行临床样本的验证.结果 绘制了荧光定量PCR Taqman探针法检测肺炎链菌感染的标准曲线;新建荧光定量PCR可检测的肺炎链球菌最低拷贝数为10copies/μL;新建荧光定量PCR可成功区分几种病原体DNA,具有较好特异性;采用新建荧光定量PCR检测临床样本132例,其中肺炎链球菌阳性25例,阳性率为18.94%.结论 新建立的荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染的实验室诊断方法具有较高的敏感性和特异性,可用于临床样本的检验.     

李斯特菌属荧光定量PCR检测方法的建立

目的采用荧光定量PCR技术,建立可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌的快速检测方法。方法选取单增李斯特菌hlyM基因和李斯特菌属23Sr DNA基因为靶基因,分别设计引物和探针,在构建二者的阳性重组质粒基础上,对李斯特菌属和单增李斯特菌进行荧光定量PCR的检测。结果建立的李斯特菌属和单增李斯特菌单重荧光定量PCR检测方法与双重荧光定量PCR的检测方法敏感度一致,分别为18.6拷贝/μl和23.2拷贝/μl。结论建立的双重荧光定量PCR方法可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌。     

泰泽氏菌TaqManMGB探针荧光定量PCR方法的—立及应用

目的 建立泰泽氏菌的TaqMan小沟结合物(MGB)探针荧光定量PCR检测方法.方法 针对泰泽氏菌16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年采集的1156份临床样本进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 泰泽氏菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肝螺杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌之间无交叉反应,检测灵敏度达2.2 copy/μl.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.204,PCR效率为100％.对1156份临床样本进行检测,荧光定量PCR检出101份泰泽氏菌阳性样本,而普通PCR则仅检出44份.荧光定量PCR方法从临床样本中检出泰泽氏菌DNA仅需2h.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定性,适于泰泽氏菌的快速检测.     

纳米氧化铝促进多重耐药质粒RP4接合转移机制的初步研究

目的 探讨纳米氧化铝(Al<,2>O<,3>)对细菌抗氧化系统和接合基因转录活性的影响,阐明纳米Al<,2>O<,3>促进多重耐药质粒RP4接合转移的机制.方法 接合供体菌为E.coli HB101(RP4),受体菌为沙门菌50312(Salmonella aberdeenKauffmann 50312 str<'R>...     

Taqman MGB探针实时荧光定量PCR检测布鲁菌病的研究

目的 建立血液标本布鲁菌DNA荧光定量检测方法,探讨其临床应用价值.方法 用PUCm-T载体和PCR纯化产物连接,转染DH5a菌,筛选阳性菌落,提取质粒,制作外标准品；在布鲁菌基因组IS711序列设计一对引物和TaqMan MGB探针,严格优化反应物的组成和扩增条件,并对该方法进行评价.结果 建立的布鲁菌DNA荧光定量PCR方法最低检出率为400拷贝/ml；批内误差为1.8％～6.5％,批间误差为2.6％～9.1％；在4.0×102～4.0×108拷贝/ml之间与Ct值具有很好的线性(Ct =-1.391 1 Ln (x) +41.65,r=-0.995 8)；具有较好的稳定性.在布鲁菌临床监测中发现,157份血液标本,用荧光定量PCR检测与临床检查结果(临床阳性、慢性期患者、症状可疑、阳性畜周围人群与重点职业人群(重点人群)的阳性率和阴性对照的符合率分别为90.3％、40％、6.7％、12.2％和100％.结论 建立的荧光定量PCR检测方法能鉴定布鲁菌种属,具有良好的特异性、灵敏度和稳定性.在临床布鲁菌基因诊断方面具有重要意义.     

荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定中的应用

[目的 ]　用taqman技术建立沙门菌荧光定量聚合酶链反应 (PCR)检测方法 ,尝试快速、准确地鉴定沙门菌。　 [方法 ]　根据沙门菌GenBankAccessionNOU2 5 3 5 2基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的沙门菌基因片段克隆导入载体 ,构建的重组质粒经筛选、鉴定后 ,作为阳性模板 ,用于标准曲线的制定。利用荧光定量聚合酶链反应 (PCR)技术进行各类菌株的定性鉴定。　 [结果 ]　应用重组质粒制作的定量曲线 ,其循环阈值与模板浓度的对数值具有良好的线性关系 ,相关系数为 0 .999。检测各类菌株 ,其中沙门菌 41株、H抗原丢失的沙门菌 16株均阳性 ;非沙门菌 10 9株均阴性。　 [结论 ]　建立了鉴定沙门菌的荧光定量PCR方法 ,该方法简便、快速、准确 ,有很好的应用前景和研究价值     

复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的建立用复合探针荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法研究根据鼠疫耶尔森氏菌pla基因的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,用于鼠疫的筛选和诊断。结果该检测方法的特异性为100%,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101~1×106拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×102cfu/ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定3次及同一时间5次重复实验结果Cv值均<5%。结论本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,可对鼠疫耶尔森氏菌进行快速检测、准确辨别和早期诊断,对鼠疫的早期快速诊断具有重要意义。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprI基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprI基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量。方法以铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中。用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性。根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量。结果铜绿假单胞菌oprI基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增。结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌。     

用于耐药基因体内转移研究的双荧光标记供体菌的构建

目的构建红色荧光基因标记基因组、绿色荧光基因标记RK2质粒的双荧光标记供体菌,以实现对耐药质粒在动物体内接合转移的可视化观察。方法利用RED重组技术,以Td-Tomato基因作为表达红色荧光蛋白(RFP)的基因,将Td-Tomato基因插入asl基因中间,并敲入到大肠杆菌K12基因组中制备成K12Td-tomato细菌。同时构建带有EGFP基因标记的RK2质粒EGFP-RK2,并电转K12Td-tomato细菌感受态细胞,实现双荧光标记供体菌的构建。结果构建的K12Tdtomato:RK2 (EGFP)供体菌能够稳定的同时发出绿色和红色荧光,并且荧光的表达是自发的,不需要底物的诱导。结论利用基因组技术可以构建双荧光标记的供体菌,为对耐药基因在生物体内的转移扩散研究提供了可行性。     

非洲型寨卡病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立

目的 建立非洲型寨卡病毒（ZIKV）实时荧光定量PCR检测技术。方法 人工合成非洲型ZIKV E基因上引物为5’ - TCAAAGATGATGTTGGAGCT - 3’、下游引物5’ - CCTCTCACAGTGGCYTCA - 3’、探针5’FAM - CCACCATTTGGGGATTCTTACATTGTC - BQ1 - 3’,采用实时荧光定量PCR检测其特异性、灵敏度及重复性。结果 非洲型ZIKV质粒标准品浓度为76.61 ng/μl;以非洲型ZIKV质粒标准品制作标准曲线,在2.47×（108～102） copies/μl之间有较好线性关系,Rsq为1;能特异检测出非洲型ZIKV质粒标准品,与登革病毒1～4、亚洲型ZIKV质粒标准品、HCV - 1b病人血清RNA无交叉反应,检测限为2.47×101copies/μl。结论 本研究建立了可用于非洲型ZIKV实验室检测的实时荧光定量PCR技术。     

致病性大肠埃希菌毒素基因的Allglo探针技术鉴定

目的：基于Allglo探针技术结合多重荧光PCR，建立快速、简便鉴定致病性大肠埃希菌相关毒素基因的方法。方法选取致病性大肠埃希菌的紧密黏附素基因（ eae）、志贺样毒素Ⅰ基因（ stx I）、志贺样毒素II基因（ stx II）和转录激活因子基因（ aggR）作为靶点。通过设计引物和Allglo探针，建立多重荧光PCR反应体系。同时，构建了4种毒素基因标准质粒，进而评价方法的特异性、灵敏性和重复性。结果基于Allglo探针技术的多重荧光PCR方法可同时准确、特异地鉴定致病性大肠埃希菌所携带的4种毒素相关基因，eae基因和aggR基因的灵敏度为10 copies/μL，stx I基因和stx II基因的灵敏度为1 copies/μL；定量检测的批间和批内变异系数均小于5%。对356份腹泻粪便样本进行评价，结果显示检出39份基因阳性。39份阳性样本中，eae基因阳性为53.85%，stxⅠ基因和stx II基因阳性为23.08%，aggR基因阳性为46.15%。通过直接测序方法进行鉴定，符合率达到100.00%。结论本实验建立的基于Allglo探针技术结合多重荧光PCR方法具有操作简便、特异性好和灵敏度高等特点，为致病性大肠埃希菌鉴定提供了一种快速、可靠的检测方法。     

鼠疫耶尔森氏菌三色荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种三色荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法根据鼠疫耶尔森氏菌pPCP1质粒上的pla基因、编码F1抗原在pMT1质粒上的ca f1基因以及菌体染色体上的3a基因序列,设计特异性的引物和不同荧光标记的Taqman荧光探针,优化反应体系和扩增条件,考察该方法检测的敏感度、特异性、重复性和稳定性,最终建立三色荧光定量PCR检测方法。结果本研究所建立的方法对鼠疫耶尔森氏菌DNA的扩增效率高,最低检出限为1×102copies/ml,特异性高,重复性的变异系数在合理范围内,稳定性好。结论建立了一种同时检测鼠疫耶尔森氏菌pla、ca f1和3a基因的三色荧光定量PCR方法,该方法敏感度和特异性高,能够实现快速检测的目的。     

自身淬灭探针荧光定量PCR检测BK多瘤病毒方法的建立与评价

目的 利用自身淬灭探针技术建立一种敏感、特异、快速、价廉的BK多瘤病毒(BKV)荧光定量PCR检测方法.方法 构建重组质粒pGEM-11Zf-BK作为标准品,自行设计自身淬灭探针,优化定量PCR体系,并进行方法学评价及初步临床应用.结果 成功构建了重组质粒pGEM-11Zf-BK,建立自身淬灭探针荧光定量PCR方法,其线性检测范围为103～109拷贝/ml2;灵敏度为1000拷贝/ml;重复性:高拷贝样品的天间CV为3.06%,批内CV为1.49%,批问CV为3.27%;低拷贝样品的天间CV为2.55%,批内CV为0.65%,批间CV为3.36%,特异性为100.00 oA;用该方法检测52例肾移植受者的血、尿标本,结果发现肾移植受者血、尿BKV DNA的阳性率明显高于健康对照者,分别为15.38%、32.69%,尿BKV DNA的载量明显高于血BKV DNA的载量(P＜0.05).结论 首次建立了以自身淬灭探针技术为平台的BKV荧光定量PCR检测方法,该方法灵敏、特异,快速;该研究对应用自身淬灭探针技术开发其他病原体检测试剂有一定的参考价值.     

实时荧光定量PCR检测沙门菌方法的实验研究

目的:建立沙门菌实时荧光定量PCR快速检测方法,探讨沙门菌在食源性感染快速诊断中的应用价值。方法:采用沙门菌fimY基因序列设计特异引物和探针,建立实时荧光实时定量PCR技术检测沙门菌的检测方法。通过特异性、敏感性、稳定性和重复性,以验证方法的可行性。结果:成功构建了沙门菌重组质粒标准品,为方法学建立奠定基础;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性,最低检测限为103拷贝/ml,相当于100 cfu/ml的菌细胞,并有良好的稳定性和重复性。结论:沙门菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本检测。     

空气中颗粒物对耐药基因接合转移的影响

目的 研究空气中颗粒物对耐药基因体外接合转移的影响.方法 供体菌为大肠埃希菌(携带RP4质粒),受体菌为具有美罗培南抗性的肺炎克雷伯菌,在不同粒径、不同浓度颗粒物作用条件下,接合一段时间后,利用含有不同抗生素的LB琼脂固体培养基平板计数,计算接合子数量和接合转移频率.结果 PM0.1、PM2.5、PM10、1648a都...     

志贺菌耐多药相关基因水平转移研究

目的 验证志贺菌耐多药相关基因水平转移及对该基因的位置进行初步判定.方法 培养已筛选出的包含耐多药差异基因片段阳性克隆,提取其质粒,PCR扩增其耐多药差异基因片段、纯化、制备探针,与志贺菌敏感株Z23、耐多药大肠埃希菌E.667、转移株的基因组DNA、质粒进行斑点杂交.结果 该耐多药差异基因片段制备的探针与耐多药大肠埃希菌、敏感株、转移株的基因组DNA、质粒进行杂交后,转移株、耐多药大肠埃希菌的全基因组及质粒均有杂交信号,与Z23的全基因组、质粒均没有杂交信号.结论 此耐多药相关基因片段在液体结合实验中由耐多药大肠埃希菌水平转移给志贺菌敏感株,根据斑点杂交结果可判断其存在于耐多药大肠埃希菌和转移株的质粒中.