HSV-TK和IL-12联合基因对宫颈癌的杀伤作用

目的观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统联合IL-12基因对人宫颈癌hela细胞系体外杀伤作用。方法采用脂质体转染法将HSV-TK及IL-12联合基因转染hela细胞,并将其用于体外实验,观察GCV对转染联合基因的Hela的杀伤作用及旁观者效应等。结果加入GCV后体外培养联合基因转染的Hela细胞,24 h后细胞明显发生形态上改变,正常对照组细胞生长旺盛;随着GCV剂量的加大,转染联合基因的Hela细胞的存活率呈逐渐下降的趋势,GCV对转染细胞的杀伤作用较对正常细胞的杀伤作用明显增强。并观察到自杀基因系统具有明显的旁观者效应。结论脂质体可介导HSV-TK及IL-12联合基因转入人宫颈癌hela细胞并获得稳定表达,GCV对HSV-TK及IL-12联合基因转染的hela细胞具有明显的杀伤作用。     

转染血管内皮细胞生长因子受体基因的K562细胞在裸鼠体内生长的实验研究

目的 观察人白血病细胞转染可溶性内皮细胞生长因子受体基因（sFlt-1)后,对其在裸鼠体内生长的影响。方法 ①将内皮细胞生长因子受体－1（Flt-1)的配体结合区基因片断与免疫球蛋白重链的恒定区基因片断重组成Flt-Ig融合基因,插入到pcDNA3质粒;②采用电穿方法转染K562细胞,经过筛选、克隆,用RT－PCR检测Flt-1 mRNA的表达;③将表达Flt-Ig基因的细胞和转染对照载体的细胞分别给裸鼠移植,动态观察肿瘤的生长。结果 Flt-Ig融合基因转染K562细胞后,获得5株Flt-Ig mRNA表达阳性的细胞株,取一株扩增后移植给6只裸鼠,移植后第14,21和28天实验组肿瘤的体积约为对照组的1／2,明显小于对照组。结论 转染Flt-Ig融合基因的K562细胞,在裸鼠体内生长受到明显抑制,这可能与转染后的肿瘤细胞表达可溶性Flt-Ig蛋白,中和了肿瘤细胞分泌的内皮细胞生长因子,抑制肿瘤血管新生有关。     

端粒酶催化亚单位基因转染对人胚胎成纤维细胞表型及寿命的影响

目的 探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位（hTERT)基因转染对人胚胎成纤维(hEFs)寿命的影响以及基因转染后细胞是否存在恶性表型。方法 应用脂质体法将pIRES2-EGFP-hTERT正义重组质粒及pIRES2-EGFP空载质粒分别导入原代培养hEFs,Western blot检测hTERT蛋白及I，Ⅲ 原表达。染色体核,裸鼠皮下致瘤性实验，DNA倍体实验以及形态学观察分析转染细胞是否存在恶性表型。结果 外源性hTERT基因转染的胚胎成纤维细胞hTERT蛋白格I，Ⅲ型胶原表达增加，体外传代次数增加，传至75供仍保持以2d的倍增周期生长，并且染以体仍为23对，均为正常二倍体细胞；裸鼠皮下不具有成瘤的能力；而hEFs和空载转染细胞传至60代左右平均五六天传代1次，出现生长停滞现象。结论 外源性hTERT基因转染使胎儿成纤维2细胞增殖旺,成因延长，且不具有恶性表现。     

端粒酶催化亚单位基因转染对人胚胎成纤维细胞表型及寿命的影响

目的探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞(hEFs)寿命的影响以及基因转染后细胞是否存在恶性表型。方法应用脂质体法将pIRES2-EGFP-hTERT正义重组质粒及pIRES2-EGFP空载质粒分别导入原代培养hEFs,Westernblot检测hTERT蛋白及I、III型胶原表达。染色体核型分析、裸鼠皮下致瘤性实验、DNA倍体实验以及形态学观察分析转染细胞是否存在恶性表型。结果外源性hTERT基因转染的胚胎成纤维细胞hTERT蛋白和I、III型胶原表达增加,体外传代次数增加,传至75代仍保持以2d的倍增周期生长,并且染色体仍为23对,均为正常二倍体细胞;裸鼠皮下不具有成瘤的能力;而hEFs和空载转染细胞传至60代左右平均五六天传代1次,出现生长停滞现象。结论外源性hTERT基因转染使胎儿成纤维细胞增殖旺盛,寿命延长,且不具有恶性表型。     

肿瘤细胞培养上清对CIK细胞活性影响的研究

目的 探讨两种血液肿瘤细胞K562和HL－60培养上清液对脐带血CIK细胞的影响作用。方法 在细胞因子诱导的脐带杀伤细胞（CIKs）形成的过程中，加入肿瘤细胞培养上清，观察CIK细胞为主的异质性细胞群体。随培养时间延长，CD3^＋CD56^＋细胞比例明显升高。K562和HL－60培养上清液能明显抑制CIK的增殖率和杀伤活性，免疫表型亦有显著的变化(P＜0．05）。结论 K562和HL－60培养上清液能抑制脐带血CIK细胞的活性，这可能是肿瘤细胞免疫逃避和耐受的原因。     

转mdr1基因诱导CIK细胞耐药并保持肿瘤杀伤活性

目的　将多药耐药基因 (mdr1)转入细胞因子诱导的杀伤 (cytokine inducedkiller,CIK)细胞 ,观察其是否产生耐药性并且保持肿瘤杀伤活性。方法　用IFN γ ,CD3单抗 ,IL 2 ,IL 1等细胞因子体外诱导外周血单个核细胞获得CIK细胞。采用电穿孔方法将mdr1基因表达质粒pHamdr转入CIK细胞。转染后 72h提取细胞总RNA ,DNA酶消化残留质粒DNA后进行RT PCR ,鉴定mdr1基因表达 ;流式细胞仪检测细胞膜耐药蛋白 (P gp)表达。四唑蓝比色法 (MTT)检测转基因后CIK细胞对阿霉素和秋水仙碱的耐药性 ;同时检测转染前后CIK细胞对MCF7细胞 (人类乳腺癌细胞系 )的杀伤活性变化。结果　转染mdr1后的CIK细胞mdr1mRNA阳性 ,P gp阳性的CIK细胞为 2 1%～ 37% (平均 2 7% )。转染后CIK细胞获得了多药耐药性 ,对阿霉素的IC50 值较转染前升高了 2 2 .3～ 4 5 .8倍 ,对秋水仙碱的IC50 值升高了 6 .7～ 11.35倍。转染前后CIK细胞对MCF7肿瘤细胞的杀伤活性无明显变化 (P >0 0 5 )。结论　CIK细胞转入mdr1基因后获得了多药耐药性 ,转染后的CIK细胞仍然保持原有的肿瘤细胞杀伤活性。     

树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞增殖和抗白血病作用影响的研究

目的探讨树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平以及抗白血病细胞作用的影响。方法健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)的水平。结果DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05);DC、CIK细胞共培养后,CD3 CD8 、CD3 CD56 双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05);共培养3d,DC-CIK细胞上清液中IL-12I、NF-γ分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01,P<0.05);在5∶1~40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关。结论DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性。可作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略。     

p21WAF1/GIP1基因转染人宫颈癌Hela细胞对顺铂敏感性的影响

目的 探讨转染p21^WAF1／GIP1基因（p21基因），对宫颈癌Hela细胞生长抑制作用及p21基因转染Hela细胞对顺铂敏感性的影响。方法 应用脂质体转染技术，将质粒peDNA3转入人宫颈癌Hela细胞中，经G418筛选，转染阳性克隆细胞连续传代培养，并采用中性红摄入法测定顺铂对p21基因转染人宫颈癌Hela细胞增殖抑制作用，流式细胞仪（FCM）检测细胞周期变化。结果 经G418筛选，Hela细胞全部死亡，转染质粒peDNA3的Hela细胞存活，并可连续传代。p21基因转染后，细胞生长明显受到抑制，细胞周期停滞于G1期，与对照组相比，细胞周期G1期比例明显增加。同时p2l表达阳性的Hela细胞对顺铂敏感性增强。结论 p2l基因转染能使Hela细胞出现生长抑制并对顺铂化疗作用敏感性明显增强。     

CD—CIK细胞对急性白血病细胞体外杀伤作用的研究

目的 探讨树突状细胞(DC) 对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平以及抗白血病细胞作用的影响.方法 健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照.用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素γ(IFN-γ) 、白细胞介素12(IL-12) 的水平.结果 DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05);DC,CIK细胞共培养后,CD3+CD8+,CD3+CD56+双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05);共培养3 d,DC-CIK细胞上清液中IL-12,INF-γ分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01,P<0.05);在5∶1～40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关.结论 DC-CIK细胞增殖能力和抗白血病活性显著高于CIK细胞,DC-CIK细胞可作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略.     

脐血DC-CIK细胞增殖及其对淋巴瘤细胞细胞毒作用的研究

目的研究脐血DC-CIK细胞增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对淋巴瘤细胞的细胞毒作用。方法采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1：5的比例混合培养,以脐血CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤淋巴瘤细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF—α）、白细胞介素-12（IL-12）的水平。结果脐血DC—CIK细胞增殖能力显著高于单纯CIK细胞（P〈0．05）;DC,CIK细胞共培养后,CD3^＋CD8^＋和CD3^＋CD56^＋细胞比例较同条件下CIK细胞明显增多（P〈0．05）;混合培养3d,脐血DC—CIK细胞上清液中IL-12,IFN-γ,TNF—α含量均比CIK细胞单独培养分泌量高（P〈0．01,P〈0．05,P〈0．05）;在2．5：1～20：1效靶范围内,脐血DC—CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤率明显高于CIK细胞（P〈0．05）,且对HL和NHL细胞杀伤活性无显著差异。结论脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗淋巴瘤效应。因脐血来源丰富,且输注不易引起严重的移植物排斥反应,其DC—CIK细胞在免疫治疗方面应有更广泛的临床应用前景。     

脐血DC—CIK细胞增殖及其对淋巴瘤细胞细胞毒作用的研究

目的研究脐血DC-CIK细胞增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对淋巴瘤细胞的细胞毒作用。方法采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1：5的比例混合培养,以脐血CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤淋巴瘤细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF—α）、白细胞介素-12（IL-12）的水平。结果脐血DC—CIK细胞增殖能力显著高于单纯CIK细胞（P〈0．05）;DC,CIK细胞共培养后,CD3^＋CD8^＋和CD3^＋CD56^＋细胞比例较同条件下CIK细胞明显增多（P〈0．05）;混合培养3d,脐血DC—CIK细胞上清液中IL-12,IFN-γ,TNF—α含量均比CIK细胞单独培养分泌量高（P〈0．01,P〈0．05,P〈0．05）;在2．5：1～20：1效靶范围内,脐血DC—CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤率明显高于CIK细胞（P〈0．05）,且对HL和NHL细胞杀伤活性无显著差异。结论脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗淋巴瘤效应。因脐血来源丰富,且输注不易引起严重的移植物排斥反应,其DC—CIK细胞在免疫治疗方面应有更广泛的临床应用前景。     

抑制Smac基因表达对胰腺癌裸鼠移植瘤生长影响的研究

[目的]探讨Smac基因对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.[方法]于裸鼠腋下接种200 μL 107/mL的PANC-1细胞悬液,建立人胰腺癌裸鼠移植瘤模型,将其分为三组：注射PBS液（A组）、转染空载体（B组）、转染Smac基因（C组）,比较三组移植瘤的大小、移植瘤细胞的凋亡率,移植瘤中Smac蛋白表达和微血管密度（MVD）.[结果]与A、B组比较,C组裸鼠移植瘤体积、质量和MVD显著减小;移植瘤细胞的凋亡指数和Smac蛋白的表达率均明显增高,其差异均有统计学意义（P〈0.05）.[结论]脂质体转染Smac基因能抑制人胰腺癌裸鼠移植瘤的生长,可能与该基因诱导胰腺癌细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成有关.     

细胞因子诱导杀伤细胞抗淋巴瘤细胞作用的研究

目的:探讨体外细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用.方法:采集健康人外周血单个核细胞(PBMC),经IL-2、CD3Mc-Ab、IL-1、IFN-γ诱导,制备CIK细胞,同时以淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)作为对照,流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型,LDH释放法检测其对淋巴瘤细胞株的杀伤活性.结果:CIK细胞与LAK细胞增殖在前期无明显差异,CIK细胞在培养14d后大量增殖,21d后扩增能力显著高于LAK细胞(P＜0.05);表型分析表明CIK细胞主要由CD3+和CD56+双阳性细胞构成;同一效靶比时,CIK细胞对淋巴瘤细胞株的杀伤活性明显高于LAK细胞(P＜0.05).结论:CIK细胞对淋巴瘤细胞株的杀伤作用强于LAK细胞,具有较强的抗淋巴瘤细胞活性,是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞.     

树突状细胞介导CIK细胞抗恶性肿瘤效应的实验研究

目的 研究人脐血来源树突状细胞（DC）和同源细胞因子激活的杀伤细胞（CIK）,共孵育后,获得的DC CIK细胞对恶性肿瘤细胞的杀伤效应.方法 获取脐血单个核细胞,用不同细胞因子分别诱导DC及CIK细胞.按1：5比例将DC和CIK细胞一起培养.且以单独培养的脐血CIK细胞为对照.采用流式细胞技术分析检测细胞免疫表型,细胞扩增倍数用台酚蓝染色方法计算,杀伤率测定采用MTT法,细胞因子IL 12,IFN γ,TNF-α用ELISA方法检测.结果 来源于脐血CIK细胞扩增倍数低于同源DC CIK细胞（P＜0.05）;混合培养物DC CIK细胞中,CD3 CD8,CD3＋ CD56＋双阳性免疫细胞数量较单纯CIK细胞明显增高（P＜0.05）;脐血DC,CIK细胞共培养3天,其上清液中细胞因子（IL 12,IFN γ及TNF-d）含量比CIK细胞上清液中高（P＜0.01,＜0.05,＜0.05）;当效靶比为2.5∶1-20∶1时,DC-CIK细胞对HL60,K562白血病细胞、U266多发性骨髓瘤细胞株及SMMC 7721肝癌细胞杀伤率均高于CIK细胞（均P＜0.05）.结论 脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗肿瘤效应.该研究为脐血DC CIK细胞的免疫治疗提供了实验和理论依据.     

DC-CIK细胞的生物学活性及体外抗白血病作用的研究

本研究探讨树突状细胞（DC）对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平及抗白血病细胞的作用。健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK，将DC与CIK共培养，以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数，MTT法测定杀伤活性，流式细胞术分析免疫表型，ELISA双抗体夹心法测定干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL—12）的水平。结果表明：DC—CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0．05）；DC、CIK细胞共培养后，CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比率较相同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0．05）；共培养3天，DC—CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ水平均比CIK细胞单独培养的水平高（P〈0．01，P〈0．05）；在5：1—40：1的效靶比范围内，DC—CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0．05），且杀伤率与效靶比呈正相关。结论：DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性，有可能作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗手段。     

阳离子脂质体介导体内基因转染对脏器及血生化影响

目的：研究作为体内基因转染载体的阳离子脂质体（Lipofeetamine）载体在介导nm23质粒体内转染腺样囊性癌细胞时对脏器及血生化的影响。方法：随机选取50只8周龄雄性裸鼠,分为5组,其中A、B、C、D组在颌面部腺样囊性癌皮下移植瘤内分别直接注入质粒量相同而脂质体含量梯度为5出、10出、15出、20出的质粒一脂质体复合物,E组作为正常对照。1周后进行血生化及脏器组织病理检查。结果：阳离子脂质体（Lipofeefamine）的剂量〉15μl时,裸鼠心、肺无明显器质性变化,但有脾瘀血性肿大、肝细胞内水肿等反应。血细胞数,肌苷、尿素氮等无明显异常,AKP、GPT升高约为正常值的两倍。结论：阳离子脂质体（Lipofeclamine）可能导致脏器的器质性病变,可能并不适于体内基因转染。     

CD147-shRNA重组质粒对裸鼠肝癌细胞SMMC-7721皮下移植瘤的抑制作用

目的研究CD147-shRNA重组质粒对裸鼠肝癌细胞SMMC-7721皮下移植瘤生长的抑制作用。方法将SMM@7721细胞、转染空载质粒的SMMC7721／pBS／U6以及转染本室前期构建的靶向肝癌细胞CD147的重组质粒的肝癌细胞SMMC-7721／pBS／U6／CD147-shRNA3接种到裸鼠皮下,观察移植肿瘤的生长情况。结果转染CD147-shRNA重组质粒的肝癌细胞移植瘤生长速度明显减慢;瘤块平均体积减小,重量减小,移植瘤生长明显减缓,抑瘤率为64．8％。结论转染CD147-shRNA重组质粒的SMMC-7721细胞致瘤性明显降低。     

超声微泡介导野生型p53基因转染Y79细胞的实验研究

目的研究超声微泡介导wtp53（wild type p53）基因转染视网膜母细胞瘤（Y79）细胞的效率及作用效果。方法以一定能量的超声介导wtp53转染Y79细胞,分为（1）质粒＋微泡＋超声照射组;（2）质粒＋脂质体组;（3）质粒＋超声照射组;（4）空白对照组。RT-PCR检测wtp53mRNA,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果超声微泡介导的wtp53基因对Y79细胞的转染效率明显高于其他实验组,检测到的细胞凋亡率也明显高于其他组。结论超声微泡可达到高效的基因转染目的,wtp53对Y79细胞有明显抑制生长的作用。     

脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件

背景:近年来阳离子脂质体成为基因转移较为常用的载体,但应用脂质体对mIMCD-3细胞株进行转染的相关报道较少。目的:探讨脂质体法转染mIMCD-3细胞株的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得mIMCD-3的最佳转染条件。方法:以绿色荧光蛋白作为报告基因,采用脂质体LipofectamineTM2000包裹pIRES2-EGFP质粒转染mIMCD-3细胞,分别按照细胞接种密度、DNA用量、DNA与脂质体的比例、不同的质粒抽提方法、血清有无设定分组,观察以上因素对mIMCD-3细胞转染效率的影响。结果与结论:采用脂质体LipofectamineTM 2000转染mIMCD-3细胞,在2×108L-1细胞接种浓度、1μgDNA用量、1:3的DNA与脂质体比例时,转染效率最高。采用美国OMEGA公司生产的E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit抽提的质粒能获得更高的转染效率。转染前漂洗细胞后换入无血清培养基比有血清组转染效率高(P<0.01),而转染后6h加入血清不影响转染效率。结果显示,脂质体法转染mIMCD-3细胞株是可行的,通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得了mIMCD-3的最佳转染条件,可作为有关研究或应用的参考。     

脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件

背景：近年来阳离子脂质体成为基因转移较为常用的载体,但应用脂质体对mIMCD-3细胞株进行转染的相关报道较少。目的：探讨脂质体法转染mIMCD-3细胞株的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得mIMCD-3的最佳转染条件。方法：以绿色荧光蛋白作为报告基因,采用脂质体Lipofectamine^TM2000包裹pIRES2-EGFP质粒转染mIMCD-3细胞,分别按照细胞接种密度、DNA用量、DNA与脂质体的比例、不同的质粒抽提方法、血清有无设定分组,观察以上因素对mIMCD-3细胞转染效率的影响。结果与结论：采用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染mIMCD-3细胞,在2×10^8L^-1细胞接种浓度、1μgDNA用量、1：3的DNA与脂质体比例时,转染效率最高。采用美国OMEGA公司生产的E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit抽提的质粒能获得更高的转染效率。转染前漂洗细胞后换入无血清培养基比有血清组转染效率高（P〈0.01）,而转染后6h加入血清不影响转染效率。结果显示,脂质体法转染mIMCD-3细胞株是可行的,通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得了mIMCD-3的最佳转染条件,可作为有关研究或应用的参考。