大鼠睾丸Leydig细胞的培养和鉴定

目的:研究体外培养大鼠睾丸Leyd ig细胞的有效方法。方法:原代培养大鼠睾丸Leyd ig细胞,用4 U/m l人绒毛膜促性腺激素(hCG)作用细胞,对照组未用hCG,放射免疫法测定培养液中睾酮浓度,3β羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫组化染色观察睾丸Leyd ig细胞形态和生物学特性。结果:培养细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高。接种72 h后大鼠睾丸Leyd ig细胞纯度达95%。接种后24 h内,hCG刺激组较对照组睾酮分泌量明显提高(P<0.05)。结论:体外培养的睾丸Leyd ig细胞可分泌高浓度的睾酮;睾丸Leyd ig细胞的纯化和培养方法的建立,可为中老年男性雄激素部分缺乏综合征睾酮替代治疗的基础和临床研究提供一条可行的思路。     

重组人凝血因子Ⅶa在肝脏移植中的应用进展

肝移植患者术前出现不同程度的凝血功能障碍,如何减少肝脏移植术中失血成为肝脏移植领域关注的热点问题之一.重组人凝血因子Ⅶa的临床应用为减少肝脏移植术中失血提供了新方案.本文综述近年来重组人凝血因子Ⅶa在肝移植术中应用的有效性、安全性及给药剂量与时机的进展.     

重组人凝血因子Ⅶa在肝脏移植中的应用进展

肝移植患者术前出现不同程度的凝血功能障碍,如何减少肝脏移植术中失血成为肝脏移植领域关注的热点问题之一。重组人凝血因子Ⅶa的临床应用为减少肝脏移植术中失血提供了新方案。本文综述近年来重组人凝血因子Ⅶa在肝移植术中应用的有效性、安全性及给药剂量与时机的进展。     

特异性阻断诱导培养的大鼠破骨样细胞Atp6i基因的表达

目的 筛选具有高效、高特异性地阻断体外诱导培养的大鼠破骨样细胞（osteoclast-like cells,OCL）Atp6i基因转录产物mRNA翻译过程的siRNA序列.方法 根据大鼠Atp6i基因序列设计2对siRNAs（Ⅰ、Ⅱ）序列,转染到各组体外培养第6天的OCL细胞内,转染组（Ⅰ或者ⅡsiRNA）T1组、阴性对照转染组（ⅢsiRNA）T2组、转染试剂转染组T3组以及空白对照组T4组;转染第24小时后,RT-PCR分析Atp6i mRNA的表达情况.结果Ⅰ号siRNA转染后,T1组中Atp6i基因RT-CR扩增产物密度值较其他组减少,差异明显（P＜0.01）,相对密度值较其他组也明显减少（P＜0.01）.结论 Ⅰ号siRNA片段特异性的抑制大鼠OCL Atp6i mRNA表达.     

重组人凝血因子Ⅶa在小儿先天性心脏病手术中的应用

背景 难治性出血是小儿先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)围手术期的严重并发症之一,其发生对患者的预后有很大的影响.重组人凝血因子Ⅶa(recombinant human coagulation factorⅦa,rFⅦa)是治疗围手术期难治性出血的可选药物之一,但目前仍属于超说明书用药,没有明确的随机对照试验和用药指南指导临床用药,对于其用药指征、剂量、疗效及副作用发生率,各中心仍然没有统一的观点. 目的 阐述目前rFⅦa的使用方法,为临床用药提供参考. 内容 综述目前rFⅦa在小儿CHD手术中的用药指征、剂量、疗效以及副作用. 趋向 随着多中心研究的开展,rFⅦa在小儿CHD围手术期难治性出血中的应用将会变得更加规范,其有效性和安全性也将有所提升.     

Ces5a基因在大鼠睾丸中的表达

目的:分析羧酸酯酶5a (Ces5a)基因在大鼠睾丸发育过程中的表达情况。方法:选取3组不同窝别出生后2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 d 21个时间点的大鼠,采用RT-PCR、Western印迹、免疫组化、HE染色分别检测大鼠睾丸组织中Ces5a基因在mRNA转录水平和蛋白表达量及定位。结果:①Ces5a mRNA在大鼠出生后的第2～65天均有表达,大鼠出生后2～12 d Ces5a mRNA的表达量较低;与2～12 d相比,14～16 d的表达量下降至最低水平(P0.05);与14～16 d相比,20～35 d该表达量有显著升高(P0.05);与20～35 d相比,40～65 d的表达量有显著升高,达到高峰(P0.05)。②Ces5a蛋白在大鼠出生后第2～65天均有表达,在大鼠出生后2～12 d Ces5a蛋白的表达量较低;与2～12 d相比,14～16 d Ces5a蛋白的表达量无显著变化(P0.05);与14～16 d相比,20～35 d的表达量有显著升高(P0.05);与20～35 d相比,40～65 d的表达量无显著变化(P0.05)。③Ces5a蛋白表达于精原细胞、精母细胞及圆形精子细胞。结论:①Ces5a基因可能参与了大鼠精原细胞增殖过程及减数分裂过程;②Ces5a基因可能在圆形精子发生和精子变形过程中发挥特殊的作用。     

Cox7a2和ATP50在原代培养小鼠Leydig细胞和人体不同器官的表达研究

目的 研究线粒体呼吸链相关基因Cox7a2,ATP50在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞和人体各器官组织中的表达特征.方法 原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并鉴定,利用RT-PCR方法 研究Cox7a2,ATP50在Leydig细胞中的表达.利用PCR方法 研究Leydig在人体各重要脏器组织的表达谱.结果 Cox7a2,ATP50在原代小鼠睾丸Leydig细胞中表达,Cox7a2和ATP50在各个脏器旱现出不同的表达特征.结论 Cox7a2,ATP50表达在原代小鼠睾丸Leydig细胞中,研究Cox7a2,ATP50在人体各器官的表达特点,为基因的功能研究奠定了前期基础.     

Fas／FasL在大鼠急性胰腺炎肺组织中的表达

目的探讨Fas/FasL在大鼠急性胰腺炎肺组织中的表达。方法大鼠胰胆管逆行注射3．5％牛磺胆酸钠，制作大鼠重症急性胰腺炎并发肺损伤模型。将实验大鼠分为正常对照组、胰腺炎1、4、8、12、24h组。分别对胰腺损伤、肺损伤程度进行病理评分，测定血清脂肪酶水平，并测定肺组织湿／干重比；免疫组化方法检测大鼠肺组织内Fas／FasL蛋白的表达水平。结果造模后1h，大鼠即出现较明显的胰腺损伤，伴有血清脂肪酶升高，随着时间的延长，胰腺损伤逐渐加重，以12h为重。造模后1h，即出现肺组织损伤，此后，肺损伤程度逐渐增加，以24h为重；光镜下主要表现为肺组织炎性细胞浸润、肺泡间隔增宽、肺泡腔内渗出液、肺泡腔塌陷等。造模1h后，大鼠肺组织内Fas、FasL表达增加，至24h达最高水平。结论Fas／FasL可能参与了胰腺炎肺损伤的病理过程，Fas／FasL系统及其介导的细胞凋亡在胰腺炎肺损伤中的确切作用有待于进一步研究。     

Egr在高浓度皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡中的表达及作用

目的 观察在高浓度皮质酮处理的大鼠Leydig细胞中Egr mRNA的表达量,并评价Egr在高浓度皮质酮诱导的Leydig细胞凋亡的作用.方法 采用RT-PCR方法检测经高浓度皮质酮以及高浓度皮质酮加环孢菌素A (CsA)处理的Leydig细胞中早期生长反应因子(early growth response factor,Egr) Egr-2及Egr-3的mRNA表达水平:用Annexin-V -FITC和Pl双标法检测Egr-2和Egr-3表达载体对经高浓度皮质酮诱导的Leydig细胞凋亡率的影响.结果 经高浓度皮质酮处理的Leydig细胞其Egr-2及Egr-3mRNA的表达量均显著升高,而皮质酮的这一作用能被钙调神经磷酸酶(CaN)的抑制剂环孢菌素A(CsA)所抑制.Leydig细胞中过量表达的Egr-2及Egr-3均可促进皮质酮诱导细胞凋亡,并以Egr-3的作用较为显著.结论 高浓度的皮质酮可能通过活化CaN来诱导Leydig细胞中Egr-2和Egr-3的表达,由此促进了Leydig细胞的凋亡过程.     

ABCG2/Bcrpl基因在大鼠肝脏卵圆细胞中的表达

目的探讨ABCG2／Bcrp1基因在大鼠肝脏卵圆细胞中的表达及意义。方法建立大鼠2-乙酰氨基芴／三分之二肝切除模型，二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心分离大鼠肝脏卵圆细胞，采用荧光定量PCR技术检测ABCG2／Bcrp1基因在大鼠肝脏卵圆细胞和肝细胞中的表达水平，免疫组织化学、免疫荧光双标染色和Westernblot方法检测该转运蛋白的表达。结果大鼠肝卵圆细胞中ABCG2／Bcrp1基因的表达水平是肝细胞的13．8倍，ABCG2／Bcrp1蛋白相对分子质量大小为72000，定位于卵圆细胞膜。其表达位于门脉区周围，并向肝小叶延伸。免疫荧光双标染色显示与OV-6共表达。结论大鼠肝卵圆细胞表达高水平的ABCG2／Bcrp1，后者参与肝干细胞免受外源性化学物质损伤的自我保护机制。     

大鼠脊髓损伤后胶质细胞生长因子的mRNA表达变化

目的：探讨胶质细胞牛长凼子（glial growth factor，GGF）在大鼠脊髓损伤后的表达变化及意义。方法：采川改良Allen’s脊髓损伤打击模型，用逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测胚胎大鼠脊髓内、正常成年大鼠脊髓内以及脊髓损伤后不同时间点伤段脊髓组织中GGF的mRNA表达结果：GGF在成年大鼠正常脊髓内低水平表达，在胚胎脊髓中高水平表达。大鼠脊髓损伤后GGF的mRNA表达持续降低，在脊髓损伤后5d达到最低峰，之后GGF的mRNA表达可逐渐恢复。结论：GGF在脊髓乍长发育中起重要作用：大鼠脊髓损伤后GGF的表达降低可能与脊髓损伤后少突胶质细胞大量死亡或凋亡有关．与脊髓损伤后轴突无法再生、脱髓鞘的髓鞘再生困难有关。     

胰腺腺泡细胞凋亡和Fas/Fas配体表达在大鼠胰腺移植急性排斥反应中的作用

目的探讨大鼠胰腺移植后细胞凋亡的变化、Fas/Fas配体(FasL)的表达及其与急性排斥反应的关系。方法实验分为同基因移植组和异基因移植组。分别于术后第3、5、7天处死受体,取移植胰腺,应用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,计算凋亡指数(AI),应用免疫组织化学及Westernblot检测Fas/FasL的表达。结果细胞凋亡主要发生在胰腺腺泡细胞,同基因移植组有散在的腺泡细胞凋亡,AI在术后无明显变化,Fas/FasL表达阴性;异基因移植组在术后第3、5、7天胰腺腺泡细胞凋亡发生率逐渐增加(28.40±3.75,39.40±5.59,57.30±8.53,P<0.01),Fas/FasL表达逐渐增强,AI与急性排斥反应程度呈显著正相关(rs=0.932,P<0.01)。结论胰腺腺泡细胞凋亡和Fas/FasL表达在胰腺移植急性排斥反应中发挥重要作用,凋亡指数对胰腺移植急性排斥反应的诊断有一定的参考价值。     

Cox7a2荧光载体构建及其在小鼠睾丸Leydig细胞表达和定位研究

目的构建Cox7a2的荧光表达载体,研究其在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达和定位。方法原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并利用3β-HSD染色法鉴定,应用PCR方法研究Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达。利用BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点把Cox7a2克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜技术观察YFP-Cox7a2定位。结果Cox7a2表达在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中。绿色荧光的YFP-Cox7a2和红色荧光的线粒体标记物- Mitotracker有完全的共定位。结论Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞表达,成功构建Cox7a2真核荧光蛋白表达载体,明确YFP-Cox7a2定位在Leydig细胞的线粒体。这些结果将对老年男性睾丸间质细胞合成功能障碍的研究提供重要的信息。     

大鼠胰岛细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨胰岛细胞的分离、培养与鉴定。方法 从实验室中挑选出30只成年雄性大鼠,将胶原酶注入大鼠的胰腺导管,聚蔗糖梯度离心法分离胰岛细胞,并培养与鉴定胰岛细胞。培养1周后用双硫腙（DTZ）行胰岛细胞鉴定。用丫啶橙（AO）、碘丙啶（PI）检测胰岛细胞活性。结果 经过分离与纯化,大鼠胰岛细胞的获得率较高且较稳定;分离后的胰岛细胞在适宜环境中生长,生长状态较佳,在培养后的12~24 h可贴壁,在培养后4~5 d细胞生长状态达到顶峰,细胞完好,且折光性能优异。利用免疫组化法鉴定胰岛细胞,分离的细胞SMA及PDGFR表达呈阳性,少数细胞vWF表达呈阳性。结论 我科此次分离纯化大鼠胰岛细胞的方法为逆行灌注胶原酶+原位消化+Ficoll液梯度分离法,实验结果显著,能在一定程度上获取纯度较高的大鼠胰岛细胞。分离后的胰岛细胞在培养4~5 d后达到最佳状态,适用于作为实验室胰岛细胞功能深入研究的实验材料。     

ATP50荧光表达载体构建及其在TM3小鼠睾丸Leydig细胞定位研究

目的:构建ATP50的荧光表达载体,研究其在原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中的表达和在TM3小鼠睾丸Leyd ig细胞中的定位。方法:原代培养小鼠睾丸Leyd ig细胞并利用3β-HSD染色法鉴定,应用PCR方法研究ATP50在小鼠睾丸Leyd ig细胞中的表达。利用BamH I和EcoR I酶切位点把ATP50克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜技术观察YFP-ATP50在TM3小鼠睾丸Leydig细胞的定位。结果:ATP50表达在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中。TM3小鼠睾丸Leydig细胞中,绿色荧光的YFP-ATP50和红色荧光的线粒体标记物M ito-tracker有完全的共定位。结论:ATP50在小鼠睾丸Leydig细胞表达,成功构建了ATP50真核荧光蛋白表达载体,明确YFP-ATP50定位在Leydig细胞的线粒体。这些结果将对老年男性睾丸间质细胞睾酮合成功能障碍的研究提供重要的信息,有利于进一步深入研究。     

非酶糖基化终末产物抑制大鼠睾丸Leydig细胞睾酮的生成

目的:研究非酶糖基化终末产物受体(RAGE)在大鼠睾丸Leydig细胞上的表达及非酶糖基化终末产物(AGEs)对大鼠睾丸Leydig细胞睾酮合成的抑制作用。方法:原代培养大鼠睾丸Leydig细胞,RT-PCR和免疫荧光技术检测RACE在大鼠Leydig细胞上表达,不同浓度AGEs处理Leydig细胞(25、50、100、200μg/ml),ELISA法测定睾酮分泌量。结果:RT-PCR和免疫荧光结果表明RAGE在大鼠睾丸Leydig细胞上表达,不同浓度AGEs处理后,人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导的Leydig细胞睾酮合成量呈剂量浓度依赖性下降,与对照组相比,50、100、200μg/ml AGEs处理组差异显著(P0.01)。结论:大鼠Leydig细胞上存在RAGE受体,AGEs显著抑制原代培养大鼠Leydig细胞睾酮的分泌。     

重组活化凝血因子Ⅶ和抑肽酶在肝移植术中的应用

目的 前瞻性地观察使用重组活化凝血因子Ⅶ（rFⅦa）和抑肽酶对减少肝移植术中出血的有效性和安全性。方法 将中山大学附属第三医院2003—2004年欲行肝移植60例病人术前随机分为3组，第1组为rFⅦa组，第2组为抑肽酶组，第3组为对照组。对3组病人各个时间点的凝血指标、凝血弹性图（TEG）指标进行观察，比较3组术中出血量、输血量、住院时间、住院费用和血管并发症。结果 使用rFⅦa后凝血酶原时间（PT）、TEG中的反应时间（R）和最大幅度（MA）与对照组差异有显著性（P〈0.05）。而部分凝血酶原时间（APTT）、纤维蛋白原水平（FIB）、血小板计数（PLT）和TEG中的血凝块减少速率（LY30）与对照组的差异无显著性（P〉0.05）。抑肽酶组与对照组MA和LY30的差异有显著性（P〈0.05），其他指标无明显改善。rFⅦa组和抑肽酶组术中出血量、输血量均较对照组明显减少（P〈0．05）。结论 rFⅦa能迅速改善外源性凝血系统功能，抑肽酶能改善新肝期的纤溶亢进，未见增加术后血管并发症。     

大鼠肝星状细胞的原代分离、培养与鉴定

目的:介绍一种合理、实用、便捷的肝星状细胞(HSCs)原代培养方法.方法:对SD大鼠进行肝脏原位灌注、酶消化,并进行间质细胞密度梯度离心.使用20%、35%和50%三层Percoll密度梯度分离纯化HSCs,分析其纯度、活力,并根据原代和传代HSCs的特征进行鉴定.结果:每只鼠肝HSCs原代培养得率为(1.5~2)×107个细胞,纯度为(97±2)%,细胞活力为(98±0.6)%.原代和传代HSCs都表达Desmin,只有传代7 d的HSCs表达α-SMA.电镜见细胞浆内大量脂滴.结论:本方法简单、实用、方便,所得结果优于其他方法.     

人脐带间充质干细胞在大鼠睾丸间质内向Leydig细胞分化的实验研究

目的:研究人脐带间充质干细胞(HUMSCs)在大鼠睾丸间质内向Leydig细胞分化的可行性。方法:贴壁法获得HUMSCs,分别通过流式细胞表面抗原染色与三系分化验证其纯度与多向分化能力,用CM-Dil标记HUMSCs后将其移植入大鼠睾丸间质内,并在移植后4周与8周对大鼠睾丸进行免疫荧光染色观察HUMSCs的存活与分化情况,移植后8周获得大鼠睾丸细胞悬液,通过流式细胞染色检测HUMSCs表达Leydig细胞标志物3β-HSD判断细胞分化的效率,通过流式细胞分选获得悬液内CM-Dil标记的在睾丸内分化后的HUMSCs,并对其进行培养,培养3 d后收集培养液,检测其睾酮水平。结果:Leydig细胞标志物CYP11a1在HUMSCs移植8周后有表达,而在移植4周后未见表达。3β-HSD流式染色显示其分化效率约为14.5%,流式细胞分选后细胞可存活,且其培养液内能检测出睾酮。结论:HUMSCs在大鼠睾丸间质内可向Leydig细胞分化。     

干细胞微囊对大鼠Leydig细胞急性氧化应激损伤的保护机制研究

目的:揭示干细胞微囊改善Leydig细胞急性氧化应激损伤的机制。方法:实验组采用单侧睾丸切除的SD大鼠5例建立睾丸缺血-再灌注损伤模型,经尾静脉注射干细胞微囊进行干预。对照组采用单侧睾丸切除的SD大鼠5例经尾静脉注射等量PBS。再灌注2 h后HE染色检测睾丸组织中中性粒细胞浸润程度,TUNEL和caspase 3免疫组化染色检测Leydig细胞凋亡,Ki67免疫组化染色检测Leydig细胞增殖。结果:实验组大鼠睾丸间质血管中中性粒细胞黏附明显少于对照组,且TUNEL及caspase 3免疫组化结果显示Leydig细胞的凋亡数量明显少于对照组,Ki67免疫组化结果显示实验组Leydig细胞增殖数量多于对照组。结论:干细胞微囊可减少中性粒细胞在急性期的黏附,通过减少活性氧自由基的来源改善Leydig细胞的急性氧化应激损伤。