人眼虹膜色素上皮细胞体外培养、冻存与复苏

目的：建立人眼虹膜色素上皮细胞体外培养并对其进行冻存与复苏。方法：直接刮取虹膜色素上皮细胞组织碎屑进行培养,光镜观察生长特性及形态特点,透射电镜观察其超微结构。根据慢冻速融的细胞冻存原则,定期收集细胞进行液氮冻存,至少2个月后进行复苏。结果：人眼虹膜色素上皮细胞体外培养成功,原代细胞在光镜下呈多角形单层生长,胞浆内有丰富的色素颗粒;电镜下见胞浆富含色素、细胞器丰富、细胞膜有明显微绒毛、微丝、相监细胞之间可见桥粒连接。共冻存6批细胞,进行4次复苏实验均成功,每镒复苏细胞存活为90％。结论：人眼虹膜色素上皮细胞体外培养的建立及冻存、复苏的成功,为研究某些疾病提供有利的基础。     

培养人视网膜色素上皮细胞中β-半乳糖苷酶活性研究

目的　观察培养人视网膜色素上皮 (RPE)细胞中复制衰老相关的 β 半乳糖苷酶活性。 方法　在培养的RPE细胞中 ,以传代次数 ( 5、10、2 0 )和取材供体的年龄 ( 2 6、44、5 7岁 )分组 ,进行标准化的 β 半乳糖苷酶活性和细胞增殖能力检测。结果　培养RPE细胞中 β 半乳糖苷酶活性阳性细胞数量随传代次数的增加而增加 ,在 2 0代的细胞中 ,阳性细胞的数量为 87%± 1 2 % ,明显高于第 5代和第 10代细胞 (P <0 0 5 )。而细胞的增殖能力明显下降 (P <0 0 5 )。结论　培养RPE细胞复制衰老的发生与细胞传代次数和取材年龄相关 ,其相关研究可能对了解年龄相关性视网膜疾病的发病机制有帮助     

层黏连蛋白体外对人虹膜色素上皮细胞的影响

目的:研究不同浓度的层黏连蛋白对体外培养的人虹膜色素上皮细胞(IPE)的作用.方法:采用酶辅助的显微分离法对成人眼进行IPE的原代和传代培养,观察其形态;以不同浓度的层黏连蛋白(0,1,5,10mg/L)处理第3代IPE细胞,MTT法作出生长曲线,免疫荧光法检测细胞角蛋白1(CK1)表达的变化.结果:原代培养的IPE细胞内色素丰富,而传代培养后色素显著减少;低浓度层黏连蛋白(5mg/L)明显促进IPE细胞增殖(0.187 vs 0.151,0.236 vs 0.176,0.245 vs 0.215,0.261vs 0.238,0.279 vs 0.254;P＜0.05);高浓度(10mg/L)明显抑制细胞增殖(0.121 vs 0.151,0.081 vs 0.176,0.094 vs0.215,0.065 vs 0.238,0.078 vs 0.254;P＜0.05);CK1染色均为阳性,高浓度层黏连蛋白(10mg/L)使IPE细胞聚集,CK1表达明显增强.结论:层黏连蛋白对IPE细胞具有双重作用,低浓度的层黏连蛋白适于IPE细胞的体外培养.     

体外分离培养猪虹膜色素上皮细胞的生物学评价

目的 :培养猪的虹膜色素上皮 (IPE)细胞并进行IPE的生物学评价 ,为IPE移植治疗视网膜色素变性 (RP)打下基础。方法 :采用酶辅助的显微分离法对 5 0只猪眼进行IPE的原代和传代培养 ,免疫组化方法鉴定细胞 ,并对其生物学性状进行评价。结果 :从IPE生长曲线上看 ,细胞于接种后 2天开始进入细胞对数生长期 ,经过 3～ 4天的对数期生长后进入生长缓慢的平台期。细胞培养成功率为 85 0 %。原代细胞的贴壁率为 31 8%± 3 7% ,细胞的活力为 82 5 %± 5 1% ,传代细胞的贴壁率为 86 4 %± 4 3% ,细胞的活力为 91 2 %± 3 7%。伸展率为 83 6 %± 5 3% ,分裂时间为 2～ 7天 ,平均 3 5± 0 96天 ,总分裂次数为 6～ 10代。免疫组织化学显示 ,培养获得的IPE细胞的细胞角蛋白 (AE1/AE3)和S 10 0抗原染色均为阳性。结论 :对IPE细胞的生物学评价 ,不仅证实了IPE细胞高效纯化培养的实现 ,而且系列完整的数据为IPE移植治疗RP的相关实验提供了必要的基础保证     

腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染和表达

目的 研究重组腺相关病毒（rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因（GFP）对体外培养虹膜色素上皮（IPE）细胞的转染和表达，为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据。方法 酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定。按转染倍数（MOI）为10^3,10^4,10^5,10^6转录已培养3d的传二代IPE细胞，转染后的第1、3、5、7、9d，在倒置荧光显微镜下观察IPE中GFP表达阳性的情况，记录100个IPE细胞中GFP阳性所占的百分比。当GFP表达稳定后，共聚焦显微镜照相，流式细胞仪检测rAAV-GFP对IPE的转染效率，结果 rAAV-GFP在细胞中的表达呈绿色，弥漫于整个胞浆。MOI=10^3时，转染后48h,GFP开始表达，MOI=10^4,10^5,10^6时，转染后24h时便可看到GFP表达阳性的细胞，细胞的起始表达强度不一，随MOI值的增高而增强，同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强，转染后第7-9d达到高峰并维持，此时检测rAAV-GFP对IPE的转染效率，MOI=10^3时是26.7%,MOI=10^4时是53.6%,MOI=10^5时是60.2%,MOI=10^6时是63.7%。结论 rAAV-GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60%以上，将腺相关病毒载体介导的基因治疗和IPE移植结合起来治疗视网膜色素变性是可行的。     

兔虹膜和视网膜色素上皮细胞的体外培养比较

目的 观察比较有色素兔虹膜色素上皮(IPE)及视网膜色素上皮(RPE)细胞的体外生长状况。方法 采用酶消化法及酶辅助机械分离法分别分离IPE和RPE细胞。观察培养的两种细胞的生长状况，并对其进行免疫组化鉴定。结果 原代IPE及RPE细胞大多呈圆形或六边形，细胞内充满了黑色素颗粒。随着传代的增加，呈梭形或纤维细胞样生长的细胞增多，细胞中的色素颗粒也逐渐减少。细胞角蛋白免疫组化染色显示IPE及RPE细胞绝大多数呈棕黄色阳性反应。Desmin兔疫组化染色显示IPE细胞中阳性细胞约占5％。结论 分离培养的IPE和RPE细胞纯度很高。IPE细胞中绝大多数为后层IPE细胞。IPE和RPE细胞的形态及体外生长特点类似。     

成人虹膜色素上皮细胞的体外培养与超微结构观察

目的建立成人虹膜色素上皮(iris pigment epithelium,IPE)细胞体外分离培养方法.方法利用酶辅助显微分离-酶消化法分离成人IPE细胞后体外培养,应用免疫学方法鉴定,电镜观察超微结构.结果体外培养出成人IPE细胞,其形态呈多角形或不规则圆形,色素含量随传代次数增加而减少,角蛋白抗体免疫学染色阳性,电镜显示其具有正常的细胞器结构以及色素颗粒.结论酶辅助显微分离-酶消化法是IPE细胞分离与培养的理想方法.     

人眼虹膜色素上皮细胞的培养与鉴定

目的：观察体外培养的人眼虹膜色素上皮细胞（iris pigment epithelium,IPE)的生长情况，用透射电镜、细胞免疫化学实验鉴定其性质，为进一步研究IPE细胞生理，病理作用提供模型。方法：对来源于不同个体的健康人眼采用酶消化加显微分离法，分离IPE细胞，对其进行培养，传代，冻存和复苏。用透射电镜，细胞免疫化学法鉴定细胞性质。建立IPE细胞的有限细胞系，结果：原代培养的IPE呈棕黑色多角形或不规则形，24h内73％细胞贴壁，贴壁体积变大呈多边形或方形，胞核轮廓变清，胞浆内充满黑色素颗粒，分裂增殖生长的细胞色素颗粒逐渐减少，4－6代后细胞内色素随着不断分裂逐渐减少至消失，部分形态变为成纤维细胞状，电镜下可见细胞表面有丰富的微绒毛，胞浆内含少量色勾颗粒，细胞免疫化学抗角蛋白与抗S－100染色显示IPE细胞胞质呈鲜红色着色，结论：采用酶消化加显微分离法可以建立人IPE的有限细胞系。     

虹膜周边切除手术标本的色素上皮细胞体外培养与超微结构研究

目的：体外培养虹膜周边切除标本中的色素上皮细胞(iris pigment epithelium，IPE)，并进行生物学检测。方法：用酶-显微解剖-酶分离法培养IPE细胞并传代，免疫组化方法鉴定，透射电镜观察超微结构。结果：酶-显微解剖-酶分离法在小标本可成功获得较高纯度和密度的IPE细胞。其形态与免疫标志物表达与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞相似。结论：培养的IPE细胞为自体移植提供了较可靠的细胞来源。     

腺相关病毒介导胶质细胞源性神经营养因子转染牛眼虹膜色素上皮细胞

目的　探讨以腺相关病毒 (AAV)为载体对体外培养牛眼虹膜色素上皮细胞 (IPECs)进行胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)转染 ,获得高效表达GDNF转基因细胞的可行性。方法　采用狭隙杂交测定AAV GDNF的滴度 ,按感染复数 (MOI)为 50对传二代IPECs进行AAV GDNF转染 ,于含3 %胎牛血清DMEM培养基中连续不换液培养 4周 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)细胞培养上清液中GDNF的量。同样方法对传二代IPECs进行AAV介导的绿色荧光蛋白 (GFP)基因转染 ,于含 2 0 %胎牛血清DMEM培养基中进行常规细胞培养。荧光显微镜下每 2d计数 1次培养IPECs的GFP表达阳性率。结果　 (1)AAV GFP转染后 ,IPECs生长正常 ,于转染后 4d部分IPECs开始出现GFP表达。GFP的表达在荧光显微镜 490nm波长激发光下呈黄绿色 ,弥漫于整个胞质。转染 8～ 10d后 ,IPECs中GFP的表达至高峰。 (2 )根据ELISA检测结果、经过计算 ,AAV GDNF转染IPECs的培养上清液中GDNF的含量为 (17.14± 1.10 ) μg/L。 结论　AAV GDNF能有效地转染体外培养的IPECs和表达GDNF。 (中华眼科杂志 ,2 0 0 4,40 :45 48)     

腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染及毒性

目的 研究腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein，GFP)对体外培养虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelial，IPE)的转染和病毒载体对IPE细胞的毒性，为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据。方法酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定。按转染倍数(multiple of infection,MOI)为10^3,10^4,10^5,10^6转染已培养3d的传二代IPE细胞，流式细胞仪检测rAAV—GFP对IPE的转染效率。MTT法检测rAAV—GFP对IPE细胞的毒性。结果 rAAV-GFP对IPE的转染效率，MOI=10^3时为26．7％、MOI=10^4时为53．6％、MOI=10^5时为60．2％、MOI=10^6时是63．7％。AAV—GFP转染IPE细胞后，细胞生长正常。MTT法显示各转染组与未转染组的OD值无统计学差异。结论 rAAV—GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60％以上，而且腺相关病毒对细胞生长无明显抑制，腺相关病毒作为视网膜色素变性基因治疗的载体是安全可行的。     

CFDA-SE标记虹膜色素上皮细胞的自体移植

目的探讨兔眼自体虹膜色素上皮细胞（irispigment epithelialcells，IPECs）羧基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）标记后，采用单通道内路移植方法将传代的IPECs移植于视网膜神经上皮层下的可行性。方法取兔眼自体虹膜细胞分离培养并传代，于第3代经CFDA-SE染色后移植到自体视网膜神经上皮层下。术后不同时间应用彩色眼底照相、激光扫描检眼镜、光学相干断层扫描进行活体观察。不同时间点对移植眼进行切片并常规染色及免疫组化，用光学显微镜对移植细胞进行观察和评价。实验数据采用两均数的等效检验，以0．5倍标准差作为等效界值观察移植前后ZO-1和Actin表达情况。结果移植术后观察显示移植区界限清晰；激光扫描检眼镜可观察到移植区内荧光；光学相干断层扫描和HE染色均显示移植区神经上皮层下有色素上皮细胞堆积，并随时间推移堆积逐渐变平。经免疫组化显示移植区ZO-1、Actin呈棕色点，有规律的间断分布在Bruch膜上，IPECs嵌插在原始的RPECs间，且形成完整的单层。结论CFDA-SE是一种快捷、稳定、安全的活体细胞染料，在IPECs移植中可作为理想的标记物应用；我们首次使用的单通道内路移植方法具有手术快捷简单、安全、并发症少等优点。[眼科新进展2007；27（3）：165-169】     

雷帕霉素对人视网膜色素上皮细胞增生和凋亡的影响

背景雷帕霉素（RAPA）是哺乳动物RAPA靶蛋白（mTOR）特异性抑制剂,能有效抑制晶状体上皮细胞（LECs）及多种肿瘤细胞增生并具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,研究其对视网膜色素上皮（RPE）细胞是否具有类似作用对临床上预防和治疗增生性玻璃体视网膜病变（PVR）具有重要意义。目的研究RAPA对体外培养的人RPE细胞增生和凋亡的影响。方法对人RPE细胞（D407细胞株）进行体外传代培养,按照培养基中加入药物的不同将培养的细胞分为9组,空白对照组进行常规培养;二甲基亚砜（DMSO）对照组在培养基中加入质量分数0．1％。DMSO;实验各组将5、10、20、40、80、160、320nmol／LRAPA分别加入培养基中并分别培养12、24、48h。应用噻唑蓝（MTT）法检测各组吸光度（A490）值并计算各组人RPE细胞增生的抑制率,应用Hoechst染色法检测各组人RPE细胞的凋亡率,评价上述各浓度RAPA作用不同时间后对人RPE细胞增生和凋亡的影响。结果不同浓度RAPA组对人RPE细胞的抑制率随浓度的增高而明显升高,差异有统计学意义（F=484．451,P〈0．01）,20～320nmol／LRAPA组在各时间点所测细胞增生抑制率均明显高于DMSO溶剂对照组,差异均有统计学意义（P〈0．01）。RAPA对细胞增生的抑制率随作用时间的延长明显增加,差异有统计学意义（F=232．262,P〈0．01）,各浓度的RAPA作用24h和48h后细胞增生的抑制率均明显高于12h,差异均有统计学意义（P〈0．05）。与空白对照组及溶剂对照组比较,10nmol／LRAPA作用12、24、48h均有诱导细胞凋亡的作用,差异均有统计学意义（P〈0．05）;20～320nmol／LRAPA组细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义（P〈0．叭）。各浓度RAPA组随作用时间的延长人RPE细胞的凋亡率明显增加（F=625．584,P〈0．01）。Hoechst33258染色可见凋亡细胞核碎裂并呈块状致密浓染,染色质固缩。结论RAPA以浓度和时间依赖的方式抑制体外培养的人RPE细胞增生并诱导其凋亡。     

Multiple bilateral primary cysts of the iris pigment epithelium

CASE REPORT: Diagnostic and therapeutic considerations in the case of a 57-year-old man with multiple iris cysts in both eyes. COMMENTS: Small and hidden from view, most primary iris cysts of the iris pigment epithelium remain clinically silent. Larger cysts may be noted on examination, but often remain difficult to visualize due to their location. By providing a high-resolution view of the iris and ciliary body, ultrasound biomicroscopy is a useful adjunct to the clinical examination in distinguishing primary cysts of the iris pigment epithelium from solid uveal neoplasms.     

腺病毒介导的LacZ基因对视网膜色素上皮细胞的转导

探索腺病毒载体作用眼科基因治疗以及视网膜移植物标记的可行性。方法用腺病毒介导ＬａｃＺ基因转导视网膜色素上皮细胞;ＭＴＴ法测定毒性影响。结果腺病毒滴度为４．６＊１０＾６时可使ＲＰＥ细胞１００％感染;