喇叭唇石斛组织培养的研究

目的 :筛选喇叭唇石斛快速繁殖体系的适宜培养基及培养条件。方法 :对基本培养基、光照条件、激素、天然提取物浓度等进行比较研究。进行叶绿素含量、可溶性蛋白含量测定。结果 :N₆培养基是种胚萌发成苗适宜培养基 ,而 1/2 MS +NAA 0.5mg·L^-1易于原球茎膨大增殖。先暗培养 20d再光照培养有利于胚的萌发及苗的生长。 1/ 2MS +NAA 0～ 0 .5mg·L^-1有利于原球茎大量增殖 ,N₆+6 BA 2 .0mg·L^-1+NAA 0 .5mg·L^-1+10 %马铃薯汁是原球茎分化的适宜培养基 ,添加激素和马铃薯汁促进叶绿素和可溶性蛋白含量上升。N₆+NAA 0 .5mg·L^-1+10 %香蕉汁生根壮苗最适宜。结论 :无机盐浓度、氮源形态、光照条件对胚萌发生长影响较大 ;氮源形态对原球茎增殖有影响 ;叶绿素含量、可溶性蛋白含量能反映组培苗的生长状态 ,可作为筛选培养基参考指标。     

天山雪莲组培苗生根培养体系的优化

 目的 研究不同培养基、不同植物激素和活性炭对天山雪莲组培苗生根的影响。 方法 采用 7 种培养基, 3 种植物激素和不同添加量的活性炭,通过测定天山雪莲的根长、根数和生根率 3 个生根指标来筛选最适生根培养基。 结果 有 4 种培养基可以促进生根,其中 White 培养基的效果最佳,根长达 3.431 cm ,根数 2 条,生根率达 80% ;添加生长素 IAA( 吲哚乙酸 ) 、 IBA( 吲哚丁酸 ) 和 NAA( 萘乙酸 ) 均可以促进生根,其中 0.2 mg·L^-1 的 IAA 的效果最佳,根长达到 1.294 cm ,平均根数达到 8 条 , 生根率为 100% ;添加活性炭可以提高生根质量,最适添加量为 1 g·L^-1 。此时,平均根长为 1.620 cm ,平均根数为 9 条,生根效果最佳。 结论 天山雪莲组培苗最适生根培养基为 White+0.2 mg·L^-1 IAA+1 g·L^-1 活性炭。     

鼓槌石斛组织培养研究

目的 :建立鼓槌石斛快速繁殖体系。方法 :组织培养 ,虫荧光素 荧光素酶生物发光法及苯酚 硫酸法。结果 :胚在光照及黑暗条件下均可以萌发 ,但苗的生长需要光照条件 ,MS,1/2MS ,B₅,N₆培养基对苗的生长均比较适宜 ,0.5mg·L^-1NAA与 1mg·L^-16-BA利于鼓槌石斛组培幼苗的生长与分化。三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate ,ATP)在鼓槌石斛培养时发生节律性变化。组培苗多糖含量 7.254% ,原植物为 2.833%。结论 :光照对胚的萌发没有影响 ,分化出幼苗后 ,培养基中的激素、氮源及有机元素对苗的生长及分化有较大的影响 ,因此要及时将苗转移到附加NAA与 6-BA的MS ,1/2MS ,B₅,N₆培养基中。ATP可作为鼓槌石斛培养时的动态指标 ,反应其发育过程中对营养和能量的需求。组培苗的多糖高于原植物。     

碳源、氮源和磷源对西洋参悬浮细胞生物量和活性成分积累的影响

 目的研究碳源、氮源和磷源对西洋参悬浮细胞生长,人参皂苷Re,Rb1以及西洋参多糖合成的影响。方法利用组织培养技术结合高效液相色谱法和紫外分光光度法,通过改变培养基碳源种类、氮源和磷源浓度,研究其对西洋参悬浮细胞生长,人参皂苷Re,Rb1以及西洋参多糖含量的影响。结果添加40g·L^-1蔗糖的细胞干重生长率最大,加入30g·L^-1蔗糖得到的人参皂苷Re、Rb1和多糖的含量最高,分别为0.531%,0.145%和3.62%。本实验保持氮源浓度60mmol·L^-1,当培养基中全部为NO₃^-时,细胞干重生长率最低,而人参皂苷Re、Rb1和多糖含量最高,分别为对照组的2.40,1.96和4.41倍。添加5.00mmol·L^-1的KH₂PO₄,细胞干重生长率最大。当培养基中KH₂PO₄浓度为0.63mmol·L^-1时,人参皂苷Re、Rb1和多糖的含量最高。结论本实验确定了西洋参细胞悬浮培养的最佳碳源种类、氮源比例和磷源浓度,表明不同碳源、氮源和磷源对西洋参细胞生长和活性成分有显著影响。     

培养基成分对怀牛膝愈伤组织诱导及牛膝多糖含量的影响

目的:研究培养基成分对怀牛膝愈伤组织诱导形成及牛膝多糖含量的影响。方法:以怀牛膝无菌苗的叶片、茎段为材料,采用正交设计研究基本培养基,碳源,2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、N-苯基-N′-噻二唑-5-脲(TDZ)、水解酪蛋白(CH)对愈伤组织诱导和多糖含量的影响。结果:诱导叶片愈伤组织形成的适宜培养基为B₅+2mg·L^-12,4-D+0.5mg·L^-16-BA+30g·L^-1葡萄糖+1g·L^-1CH,诱导茎段愈伤组织形成的适宜培养基为B₅+2mg·L^-12,4-D+1mg·L^-16-BA+30g·L^-1葡萄糖+0.5g·L^-1CH;有利于叶片愈伤组织中多糖含量提高的培养基是LS+1mg·L^-16-BA+1mg·L^-1TDZ+30g·L^-1蔗糖,有利于茎段愈伤组织中多糖含量提高的培养基是LS+1mg.L^-12,4-D+0.5mg·L^-16-BA+1mg·L^-1TDZ+30g·L^-1葡萄糖。结论:初步建立了怀牛膝叶片、茎段诱导愈伤组织的适宜培养条件,为通过植物组织细胞培养途径生产牛膝多糖提供了依据。     

新疆雪莲细胞悬浮系的建立和黄酮类活性成分的产生

目的:建立新疆雪莲的悬浮培养体系。方法:研究不同培养基、培养基初始pH、碳源、接种量、植物生长物质含量对雪莲细胞生长和黄酮合成的影响。结果:N₆液体培养基在pH5.8、蔗糖含量50g·L^-1、接种量60-80g·L^-1FW时有利于细胞生长和黄酮合成,附加BA0.2mg·L^-1+NAA2mg·L^-1有利于黄酮合成,而附加BA0.5mg·L^-1+NAA3mg·L^-1则对生长有利。结论:培养条件的优化可有效提高雪莲悬浮细胞的生长和总黄酮的合成。     

铁皮石斛的种胚萌发及其离体繁殖研究

目的:研究铁皮石斛种胚萌发和快速繁殖的组织培养技术,为铁皮石斛的繁殖建立最佳培养条件。方法:以成熟的铁皮石斛种胚为研究材料,以1/2MS为基本培养基,接种到含有不同植物生长物质BA(6-苄基腺嘌呤)和NAA(萘乙酸)组合及含有马铃薯提取液、香蕉提取物及活性碳的培养基上,诱导铁皮石斛种胚的萌发、原球茎增殖、分化及试管苗生根。结果与结论:添加20%马铃薯液有利于种胚的萌发,种胚萌发率为79.37%;BA 1.0 mg.L^-1和NAA 0.1 mg.L^-1最有利于原球茎增殖,培养基中添加2%活性碳原球茎增殖倍数高;NAA有助于试管苗的生根,不同含量NAA以0.5 mg.L^-1时试管苗平均根数最多和平均根长最长。     

马来酸依那普利片的人体生物等效性研究

 目的用HPLC-MS测定健康受试者口服马来酸依那普利制剂后的血药浓度,估算受试制剂和参比制剂的药动学参数,评价两种制剂的生物等效性和相对生物利用度。方法采用随机二交叉设计试验,20例男性健康志愿受试者,单剂量口服受试制剂和参比制剂的马来酸依那普利片。以高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中依那普利和依那普利拉的浓度。采用SPSS及BAPP2.2软件处理计算主要药动学参数。结果受试制剂和参比制剂血浆中马来酸依那普利的t_1/2分别为(1.33±0.22)和(1.25±0.37)h;ρ_max分别为(238.59±55.40)和(230.61±78.29)μg·L^-1,t_max分别为(0.70±0.20)和(0.80±0.20)h,AUC_0-8h分别为(339.03±70.66)和(373.23±108.83)μg·h·L^-1,AUC_0-∞分别为(343.51±71.15)和(378.36±107.35)μg·h·L^-1。依那普利拉的t_1/2分别为(6.26±0.63)和(5.72±0.54)h;ρ_max分别为(83.75±25.91)和(99.13±29.61)μg.L^-1,t_max分别为(3.80±0.60)和(3.40±0.70)h,AUC_{0-36 h}分别为(812.02±181.88)和(803.35±199.50)μg·h·L^-1,AUC_0-∞分别为(832.99±180.85)和(817.36±201.78)μg·h·L^-1,以依那普利和依那普利拉计算的人体相对生物利用度分别为(90.84±39.6)%和(102.8±31.3)%。结论两种制剂在健康人体内具有生物等效性。     

反相高效液相色谱法测定人血浆中氟伐他汀浓度及其药动学研究应用

 目的建立反相高效液相色谱法测定人血浆中氟伐他汀的浓度,以用于药动学研究。方法采用体积分数0.2%磷酸乙腈溶液沉淀100μL血浆样品蛋白,高速离心后上清液直接进样分析。分析柱Kromasil C₁₈色谱柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相0.02mol·L^-1磷酸二氢钾溶液-乙腈(53∶47);流速1.2mL·min^-1;检测器荧光检测器(激发波长305nm,发射波长390nm)。以外标法定量,进行方法学确证试验,并用于20名健康志愿者单剂量po40mg氟伐他汀胶囊(来适可)的药动学研究。结果本方法专属性强,内源性杂质和代谢物不干扰氟伐他汀的出峰。在2～600μg·L^-1内线性良好,相关系数r=0.999999(n=6)。定量限为2μg·L^-1。高、中、低质控样品的日内、日间RSD均小于10%,方法学回收率为95.0%～100.9%,平均提取回收率为111.4%。药-时曲线提示,氟伐他汀在中国人体内处置过程存在较大的个体差异。ρ_max,t_max,t_1/2和AUC_0～t值分别为(491.4±211.4)μg·L^-1,(0.6±0.2)h,(1.1±0.3)h和(540.2±226.5)μg·h·L^-1。结论本测定方法稳定、操作简便、快速、准确、灵敏,可用于氟伐他汀药动学的研究。中国人群中的ρ_max,AUC_0-t显著高于白人,而且还具有吸收更快、末端相消除更快的特点。     

雪莲花醇提物对大鼠组织和红细胞的抗氧化活性

 目的研究雪莲花醇提物(ESLHM)的抗氧化活性。方法用·HO生成系统Fe²⁺维生素C诱导大鼠心、肝、肾组织匀浆脂质过氧化,用TBA比色法测定MDA含量;用NBT还原法测酵母多糖A刺激大鼠中性粒细胞产生的O₂^-;用分光光度法测H₂O₂诱发的大鼠红细胞溶血度。结果对照组大鼠心、肝、肾匀浆经Fe²⁺+维生素C溶液诱发后MDA含量较空白组升高(P<0.01),中性粒细胞受酵母多糖A刺激后O₂^-生成较空白组升高(P<0.01),红细胞经H₂O₂诱发后溶血度较空白组升高(P<0.01)。而6.3,12.5,25,50,100,200μ·L^-1 ESLHM能不同程度抑制Fe²⁺维生素C诱导的大鼠心、肝、肾脂质过氧化产物MDA生成,其抑制心、肝、肾MDA生成的IC₅₀分别为29.4,32.9,31.4 μg·L^-1,其量效关系均呈负相关,相关系数分别为-0.905, -0.912,-0.908,相关性检验P值均<0.01;能不同程度抑制酵母多糖A刺激中性粒细胞生成O₂^-,其抑制中性粒细胞生成O₂-的IC₅₀为24.6 μg·L^-1,其量效关系呈负相关,相关系数为-0.887(P<0 01);能不同程度抑制H₂O₂诱发的红细胞氧化溶血,其抑制红细胞氧化溶血的IC₅₀为57.6μg·L^-1,其量效关系呈负相关,相关系数为-0.905(P<0.01),.结论雪莲花醇提物通过清除·HO,O₂^-及H₂O₂发挥抗氧化活性。     

铁皮石斛中一个新化合物

 目的 研究铁皮石斛的化学成分。方法 采用硅胶色谱法、HP₂MGL型大孔树脂色谱法、Sephadex LH-20、Sephadex G-25凝胶色谱法、RP-HPLC制备柱色谱法进行分离纯化,通过现代波谱技术进行结构鉴定。结果 鉴定了10个化合物,分别为2-甲氧基苯基-1-O-β-D-芹糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷(1), 3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-β-D-芹糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷(2), leonuriside A（3）,(1′R)-1′-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙醇-4-O-β-D-葡萄糖苷（4）,左旋丁香脂素（5）,丁香脂素-4,4′-O-双-β-D-葡萄糖苷（6）,(+)-丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（7）,icariol A₂-4-O-β-D-glucopyranoside（8）,(+)-lyoniresinol-3a-O-β-D-glucopyranoside（9）,裂异落叶松脂醇（10）。结论 1为新化合物,2～4,6～10为首次从本属植物中发现,5为首次从本植物中发现。
     

石斛多糖抗肿瘤作用的实验研究

 目的 观察石斛多糖（Dendrobium candidum polysaccharides, DP）对在体肿瘤和离体培养肿瘤细胞的抑制作用,探讨其抑制作用的可能机制。方法 以接种肉瘤( S180)的小鼠为模型,观察DP对接种肉瘤瘤体生长的抑制作用,分析荷瘤小鼠内脏指数的变化。ELISA法检测小鼠外周血中细胞因子白介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量。以人肝肿瘤细胞(SMMC27721)为模型,采用cell counting kit-8(CCK-8)检测DP的体外抗肿瘤活性。结果 DP处理能够有效抑制小鼠肉瘤(S180)瘤体生长和离体肝肿瘤细胞生长（P＜0.05）;有效提高荷瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数,提高外周血中IL-2和TNF-α含量（P＜0.05）。结论 DP具有显著的抗肿瘤效应,其抑瘤机制可能与DP促进免疫器官功能和提高细胞免疫能力有关。     

金钗石斛和铁皮石斛软腐病原菌的分离和鉴定

 目的 确定引起金钗石斛和铁皮石斛软腐病的病原菌,为制定高效、安全的防治措施提供依据。方法 采用普查和定点观察相结合对软腐病发病情况进行田间观察,采集两种石斛典型病株样本,按照柯赫氏法则对其病原菌进行分离、纯化、菌株鉴定及致病性测定。结果 在树皮为基质的苗床上软腐病在不同苗龄上均可发生,病原菌主要侵染幼嫩多汁的嫩芽和新枝,引起幼嫩茎叶的腐烂、萎焉和坏死等症状。通过对病原菌形态学观察,以及核糖体rDNA ITS序列分析,侵染石斛植株的2个分离菌株被鉴定为终极腐霉Pythium ultimum。致病性实验证明,这两个菌株为石斛软腐病的致病菌株。结论 金钗石斛和铁皮石斛是终极腐霉菌的自然寄主。     

铁皮石斛原球茎高效再生体系的研究

目的以铁皮石斛Dendrobium officinale实生种子为外植体,研究铁皮石斛原球茎的增殖、分化、诱导生根等条件,筛选出适宜铁皮石斛原球茎高效再生的诱导条件,建立高效的再生体系。方法以铁皮石斛种子为外植体,在培养基上诱导产生原球茎,经过增殖培养后,转移到分化培养基中诱导芽苗分化,待分化的芽苗长到1~2 cm时,转移到生根培养基诱导生根,最终长成完整的再生植株。结果适宜铁皮石斛生长的基本培养基为1/2 MS;原球茎诱导的培养基为1/2 MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+50 g/L土豆泥;原球茎增殖的最适培养基为1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,最高增殖系数达23;最佳分化培养基为1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,平均分化率最高达95%;最佳生根培养基为1/2 MS+0.3mg/L NAA+50 g/L土豆泥,生根率达100%。结论铁皮石斛实生种子是铁皮石斛离体繁殖的优良外植体来源。以铁皮石斛种子诱导获得的高效再生技术体系可以为铁皮石斛快速繁殖和工厂化生产提供理论基础。     

铁皮石斛中的酚酸类及二氢黄酮类成分

 目的 研究铁皮石斛的化学成分。方法 利用硅胶、凝胶柱色谱及制备高效液相色谱等方法进行分离,根据光谱数据和理化性质鉴定其结构。并利用1,1-苯基苦基苯肼（DPPH）自由基清除实验评价分得的化合物的抗氧化活性。结果 从铁皮石斛的脂溶性部位分离得到了15个酚性化合物及2个二氢黄酮类化合物,分别鉴定为：N-p-香豆酰酪胺(1),反-N-(4-羟基苯乙基)阿魏酸酰胺(2),二氢松柏醇二氢对羟基桂皮酸酯(3),二氢阿魏酰酪胺(4),4-羟基-N-[2-(4-羟基苯基)乙基]苯丙酰胺(5),丁香酸(6),丁香醛(7),香草酸(8),对羟基苯丙酸(9),对羟基桂皮酸(10),阿魏酸(11),对羟基苯甲酸(12),灯盏花苷II(13),二氢丁香苷(14),3, 5-二甲氧基-4-羟基苯基-1-O-β-D-葡萄糖苷(15),柚皮素(16)及3′, 5, 5′,7-四羟基二氢黄酮(17)。其中化合物2、3、4、6、11及17具有抗氧化活性,但均弱于阳性对照抗坏血酸的活性。结论 化合物1~17均为首次在铁皮石斛中分离得到,化合物的活性强弱与结构之间存在一定的相关性。     

铁皮石斛人工种子制作流程及发芽研究

以原球茎为材料，建立了铁皮石斛Dendrobiumcandidum人工种子的初步制作流程。以改良1／2MS培养基各种成分附加蔗糖为人工胚乳的人工种子存活率、发芽率、成苗最好，其发芽率可达80％以上。     

人工栽培铁皮石斛多糖含量变异规律

目的:全面了解人工栽培铁皮石斛药材多糖质量分数,以及种质、采收年限等因素与多糖质量分数的关系,为优质铁皮石斛药材培育提供依据.方法:采集浙江铁皮石斛人工设施栽培骨干基地(产量占全国90%以上)11个种质一至三年生(生理年龄)的33个样品,并分别记载其形态特征;采用苯酚-硫酸比色法测定铁皮石斛多糖质量分数.结果:全国铁皮石斛骨干企业生产的二年生铁皮石斛其多糖平均质量分数达34.47%(25.63%～41.65%);不同种质、生理年龄的铁皮石斛多糖质量分数存在显著差异,5号种质多糖质量分数最低,一年生、二年生、三年生多糖质量分数分别为19.77%,25.63%,11.83%,10号种质最高,一年生、二年生、三年生多糖质量分数分别为33.31%,41.35%,28.39%.结论:全国人工栽培骨干基地生产的铁皮石斛,其多糖质量分数普遍高于野生药材,种质与生长年限显著影响多糖质量分数;铁皮石斛品种选育与采收年限的控制可提高多糖质量分数,浙江产区铁皮石斛最佳采收时间为两年生冬季至三年生开花前.     

添加剂对铁皮石斛组织培养和快速繁殖的影响

1／2MS培养基添加活性炭、植物激素及香蕉汁、苹果汁、土豆汁等对铁皮石斛Dendrobium canducum Wall．ex LindL快速繁殖的影响研究，结果表明：适量的活性炭和1．0mg／LNAA比较适合铁皮石斛原球茎的增殖；1／2MS及添加0．5mg／LNAA和0．5％活性炭比较适于原球茎的分化；添加0．5％活性炭和香蕉汁、苹果汁能促进试管苗根的生成和生长。