酪酸梭菌与婴儿型双歧杆菌对艰难梭菌的试管内生物拮抗试验的研究

本文用酪酸梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）和婴儿型双歧杆菌（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｕｍＩｎｆａｎｔｉｓ）对艰难梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｌｉｅ）进行了试管内的生物拮抗试验。将酪酸梭菌ＬＣＬ１６６株，婴儿型双歧杆菌菌ＬＣＬ１７２株及酪酸梭菌ＬＣＬ１６６株和婴儿型双歧杆菌１７２株分别与艰难菌ＬＣＬ１６６株和婴儿型双歧杆菌ＬＣＬ１７２株能明显抑制艰梭菌ＶＰＩ１０４６３株的     

人肝梭曼水解酶的微量比色测定及性质

建立了人肝二异丙基氟磷酸酯酶（ＤＦＰａｓｅ，ＥＣ．３．１．８．２．）的微量比色测定法并探讨了此酶的部分生化性质。梭曼在过硼酸钠及丙酮存在时，可与盐酸联苯胺反应生成橙黄色偶氮化合物，橙黄色产物的量与梭曼量在１０－２００ｎｍｏｌ范围内呈正相关。本文将此呈色反应与酶反应相结合，通过测定剩余梭曼的量来测定酶活力，并探讨了测定的最适条件。测定的变异系数为５％，测得人肝ＤＦＰａｓｅ的Ｋｍ值为３ｍｍｏｌ·Ｌ－１，最适ｐＨ范围为７．０－７．２，酶反应时间为２５ｍｉｎ，在－２０℃保存７个月，或在３７℃保温１８ｈ活性无明显丧失，反复冻融３次活性不变，但经冻融６次时活性下降１／５．人肝ＤＦＰａｓｅ活性主要存在于细胞的可溶性部分。     

梭曼代谢与体内解毒

梭曼代谢与体内解毒阮金秀梭曼有一个不对称碳原子和一个不对称磷原子，因此有４个光学异构体，即Ｃ（＋）Ｐ（＋）、Ｃ（＋）Ｐ（－）、Ｃ（－）Ｐ（＋）、Ｃ（－）Ｐ（－）。这４个异构体的毒性作用和体内代谢过程有很大的差别。已经知道，Ｃ（±）Ｐ（－）对乙酰胆碱酯...     

应用PCR—直接测序法测定结核分支杆菌rpsL基因突变的研究

目的：了解我国结核分支杆菌耐链霉素（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ,ＳＭ）分离株ｒｐｓＬ基因突变情况,建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：通过聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）－单链构象多态性（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＳＳＣＰ）、ＰＣＲ－限制性片段长度多态性（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＲＦＬＰ）和ＰＣＲ－直接测序法（ＤｉｒｅｃｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ,ＤＳ）分析３８株结核分支杆菌耐ＳＭ分离株的ｒｐｓＬ基因。结果３８株耐ＳＭ分离株中,２５株ＳＳＣＰ异常、不被ＭｂｏⅡ消化、ＤＳ分析４３位密码子ＡＡＧ→ＡＧＧ突变;１株ＳＳＣＰ异常、可被ＭｂｏⅡ消化、ＤＳ分析３３位密码子ＧＴＡ→ＡＴＡ突变;１２株ＳＳＣＰ正常、可被ＭｂｏⅡ消化、ＤＳ分析未见异常;未发现８８位密码子突变。结论：大多数结核分支杆菌耐ＳＭ是由于其ｒｐｓＬ基因４３位密码子突变所致,采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＤＳ方法可快速测定部分结核分支杆菌ＳＭ耐药基因型。     

Distribution of the scavenger esterases against organophosphorus compounds in human tissues

测定了人体各种组织中与有机磷化合物代谢有关的二异丙基氟磷酸酯酶（ＤＦＰａｓｅ），对氧磷酶，乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ），丁酰胆碱酯酶（ＢＣｈＥ）及羧基酯酶（ＣａＥ）的活性水平．结果表明：在肾脏，脾脏和肝脏中含有丰富的ＤＦＰａｓｅ，可催化水解梭曼．其他组织该酶活性均很低．除人血清外，其他组织均未测到对氧磷酶活性．ＡＣｈＥ和ＢＣｈＥ主要分布于中脑，桥脑，延脑，纹状体及丘脑等脑干区域，另外肝脏中ＢＣｈＥ的比活性也较高．ＣａＥ主要分布于肝脏组织中，肺脏中也有较高的ＣａＥ活性．以上结果对了解有机磷化合物在人体中的中毒及代谢提供了一定的理论基础     

维生素C二步发酵过程中蛋白酶的发展及其作用

本文研究发现了维生素Ｃ”二步发酵法”第二步混合菌发酵中的蛋白酶活性。蛋白酶主要来源于大菌（枯草芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），小菌（氧化葡萄糖酸杆菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）不产蛋白酶。混合发酵时产蛋白酶提前，并初步研究蛋白酶活性对产酸的影响。     

庆大霉素耐药质粒的检测及P1Gm噬菌体的分离

本文检测邯郸、福州两地１４９株新生儿胎便中肠道杆菌的耐药率、ＭＩＣ、耐药质位及其消除率。结果表明庆大霉素（Ｇｍ）耐药基因主要位于耐药质粒上；Ｇｍ耐药质粒较稳定、宿主范围较广。此外，本文获得８株ＰＩＣｍｃｌ（ｔｓ）１００与Ｇｍ耐药质粒形成的类似于Ｐ１Ｃｍ性质而由Ｇｍ取代Ｃｍ基因的Ｐ１Ｇｍｃｌ（ｔｓ）１００。Ｐ１Ｃｍ或Ｐ１Ｇｍ可感染９种肠道杆菌。     

肉苁蓉炮制方法的改进

肉苁蓉炮制方法的改进钱学勤，何学龙（国防科工委５１３医院兰州７３２７５０）肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉（ＣｉｓｔａｎｃｈｅｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａＭａＹＣ）的干燥带鳞片的肉质茎。最早见于《神农本草经》。其味甘咸，性温，归肾、大肠经。肉苁蓉含有多种生物碱、黄...     

模拟高原梭曼中毒犬血气变化

模拟高原梭曼中毒犬血气变化赵吉青欧阳子倩刘勇魏相德吕宏宇（第三军医大学预防医学系毒理学教研室，重庆６３００３８）梭曼（ｓｏｍａｎ）是一种主要引起胆碱能神经紊乱的有机磷酸酯类化合物，也是化学战剂中难防难治的毒剂之一；其急性中毒死亡的主要原因是呼吸衰竭［...     

醋柳总黄酮对兔血管紧张素转换酶的抑制作用

目的：探讨醛柳总黄内酮（ＴＦＨ）及其单体降压及心血管综合保护作用机制。方法：紫分光光度法和放射免疫法检测ＴＦＨ、槲皮素（Ｑｕｅ）、异鼠李素（ｓｏｒ）对培养的兔主动脉平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）及兔血浆血管紧张毒汁转换酶（ＡＣＥ）活性及血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）生成的影响,用卡托普利（Ｃａｐ）作对照。结果：ＴＦＨ、Ｑｕｅ、Ｉｓｏｒ对ＡＳＭＣ ＡＣＥ活性及ＡｎｇⅡ生成有显著持久的抵抑制作用,对血浆ＡＣＥ活性及     

内源性血管生成抑制因子A rresten在E.coli JM109中的表达及抗新生血管生成的药理学研究

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并进行表达,抑制新生血管的药理学实验中发现,该表达产物具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli JM109进行原核表达,大量表达提取Arresten蛋白,用鸡胚绒毛尿囊膜实验进行活性测定。结果成功构建的重组质粒pBV220-Arr在E.coliJM109菌株中2~8 h均可获得表达,其中诱导4 h表达效率最高,Arresten蛋白可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长,活性功能明显强于血管抑素。结论成功构建Arresten基因重组质粒pBV220-Arr,并可在E.coli JM109菌株中获得表达,Arresten蛋白具有明显的抑制血管生成的作用。     

人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人脂联素重组表达载体PQE30/ADPN,并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白,对表达产物进行鉴定。方法:将构建好的人脂联素克隆载体PUC57/ADPN与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中。通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体PQE30/ADPN,并用IPTG在大肠杆菌M15中诱导表达。结果:PCR获得长度为753bp目的片段,经PQE30原核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入的目的片段与GenBank检索的人脂联素cDNA序列(Accession NM-004797)100%匹配;含重组Adiponectin质粒的大肠杆菌经0.4mmol/L的IPTG诱导6h后有表达。结论:应用并成功构建了人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN,且在大肠杆菌中获得有效表达。     

新型大肠杆菌融合表达系统表达水蛭素Ⅲ基因研究

选用大肠杆菌Ｌ－门冬酰胺酶（ＡＳＰｓⅡ）高效表达质粒ｐＫＡ作为融合表达载体,将水蛙素Ⅲ（ＨＶ３）人工合成编码基因插入 ｐＫＡ质粒的 ＡＳＰｓⅡ编码基因 ａｎｓＢ中,使 ＡＳＰｓ Ⅱ１Ｎ端的 ８９个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基与 ＨＶ３形成融合蛋白,从而构建成 ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白表达质粒 ｐＫＡＨ,通过基因操作将该质粒的低拷贝数复制原长更换成 ｐＵＣ高拷贝数复制原点,进而构建成ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白高效表达载体 ｐＵＫＡＨ。该质粒在大肠杆菌 ＪＭ１０５宿主细胞中表达后,融合蛋白（１５． ６ ｋＤ）占细菌总蛋白 １０ ５％,该融合蛋白经 ＣＮＢｒ切割释放出活性水蛭素分子,抗凝血活力达约 ２０ ＡＴＵ／ｍｌ培养液,为以后进一步研究打下了基础。     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

Ⅰ型单纯疱疹病毒UL12基因在大肠杆菌BL21和Rosetta菌中的差异表达

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a-UL12,比较重组表达质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性。方法使用PCR的方法扩增出HSV-1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a-UL12,分别转化E.coli BL21和E.coli Rosetta菌。经SDS-PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性。结果重组质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coliRosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高。结论成功构建了表达出了具有较高活性的HSV-1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV-1药物奠定了基础。     

人白细胞介素18基因化学合成及其在大肠杆菌中高表达

目的设计并合成人白细胞介素18(hIL-18)基因,在大肠杆菌T7表达系统中高表达hIL 18。方法根据大肠杆菌的偏爱密码子和翻译起始区的二级结构,设计并人工合成了hIL-18的基因。将新合成基因克隆到载体pMFT7-5 ,经转化JM10 9(DE3) ,得到工程菌JTI。结果经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明目的蛋白质占总蛋白质的30 % ,具有免疫学活性。结论实现hIL基因在大肠杆菌中的高效表达     

ACT-6, a novel plasmid-encoded class C β-lactamase in a Klebsiella pneumoniae isolate from China

The purpose of this study was to investigate the phenotypic and molecular characterization of a novel plasmid-mediated AmpC-type β-lactamase in Klebsiella pneumoniae E701 isolated from Anhui province in China. In comparison with the ACT-1, sequence analysis revealed that there were 43 point mutations in the coding gene, and 10 of which led to amino-acid substitution. Resistance could be transferred by conjugation or transformation with plasmid DNA into E. coli JM109, which was due to the production of a β-lactamase with an isoelectric point of 8.4 named ACT-6. Cloning, expression, purification and kinetics were carried out to study the characterization of the novel AmpC-type β-lactamase. The results of MIC determinations and substrate profiles showed there was no significant difference in the activities of the novel enzyme and ACT-1. Moreover, the class 1 integron and the whole open reading frame of the novel AmpC-type β-lactamase from K.pneumoniae E701 were detectable in the same size plasmid. This is the first report on the emergence of the novel ACT-6 type β-lactamases in K. pneumoniae.     

胃泌素释放肽前体融合蛋白的制备及其在肿瘤研究中的应用

目的克隆胃泌素释放肽前体(pro-GRP)基因、构建重组质粒pGEM-T-pro-GRP和表达载体PMS-31b-pro-GRP、在大肠杆菌中热诱导表达并制备融合蛋白。方法从BGC823胃癌细胞中提取总RNA,利用pro-GRP特异引物,扩增人pro-GRP分子的cDNA全长。将pro-GRP基因定向克隆于pGEM-T载体转化JM109,DNA测序鉴定基因序列。将pro-GRP基因定向克隆于原核高效表达载体PMS-31b,转化大肠杆菌POP2136经42℃热诱导表达MS2-pro-GRP融合蛋白。将融合蛋白分离纯化后,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶鉴定。结果经聚合酶链反应(PCR)扩增成功获得210bp的pro-GRP基因,目的基因序列正确。SDS-PAGE显示热诱导后表达的融合蛋白分子量约为18000。结论成功克隆pro-GRP基因,并表达和纯化了PMS-31b-pro-GRP融合蛋白,为建立pro-GRP检测方法奠定了基础。     

凋亡素基因的克隆及其原核表达

目的建立凋亡素基因克隆及原核表达的方法。方法根据已报道的鸡贫血病毒凋亡素基因设计合成一对引物 ,通过PCR扩增 ,构建重组质粒pUC18 VP3,将其与pET30质粒分别用限制性内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ消化 ,构建原核表达载体pET30 VP3,用以转化感受态的E .coliDE3,经IPTG化学诱导表达 ,表达产物进行SDS PAGE电泳鉴定。结果凋亡素基因在E .coliDE3中获得了大量表达。结论该结果对凋亡素进一步开发为抗肿瘤新药具有重要意义。     

菊欧氏杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶celY基因在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

以菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增了该菌的β-1,4-内切葡聚糖酶celY基因及其调控元件并克隆至pUC19载体。测序结果经分析,该基因编码的蛋白序列与菊欧氏杆菌Ech586的β-1,4-内切葡聚糖酶同源性达到98%。将celY的开放阅读框基因插入到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),采用LB-CMC平板刚果红染色筛选含celY基因的转化子。12%SDS-PAGE显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,其相对分子质量与预期结果相符。CMCase活力测定显示重组pET-28a-celY阳性菌分泌到培养基中的CelY酶活力为84.4 U/L,周质中的酶活力为12.7 U/L。β-1,4-内切葡聚糖酶CelY工程菌的获得,为研究菊欧氏杆菌纤维素酶基因在菊欧氏杆菌同源转化中的表达及工程菌的酶学特性提供了重要的资料。