人视网膜中神经干细胞样细胞的分离和体外培养

目的 分离培养发育基本成熟的人视网膜中神经干细胞样细胞。方法 取0～3岁猝死婴幼儿视网膜细胞，在干细胞选择性培养基中培养，观察原代和传代细胞的形态和增殖情况，并对其诱导分化。通过免疫细胞化学方法检测Nestin、MAP-2和GFAP的表达。结果 原代细胞可形成悬浮生长的致密球状细胞团，传代后能形成新的细胞球。部分细胞球表达Nestin，传代后阳性率增加。分化后细胞形态多样，每一团细胞相对一致，部分细胞表达MAP-2或GFAP。结论 0～3岁人视网膜中存在一种表现出神经干细胞特性的细胞。     

大鼠胚胎视网膜中神经干细胞的体外培养与鉴定

目的 培养和鉴定大鼠胚胎视网膜中的神经干细胞.方法 取孕龄16～19 dSD大鼠胚胎鼠的视网膜组织,在干细胞选择性培养基中培养,用免疫组织化学法来检测Nestin和Chx-10的表达.结果 SD大鼠胚胎鼠视网膜中的神经干细胞在体外悬浮生长,形成致密的球形细胞团,传代后能够生成新的细胞团,原代和传代细胞Nestin和Chx-10蛋白均表达阳性.结论 SD大鼠胚胎视网膜内存在神经干细胞,并且可以进行体外培养和扩增.     

胎儿视网膜前体细胞的分离培养

目的建立视网膜前体细胞的培养方法。方法分离8~12周流产胎儿的视网膜神经上皮细胞，采用悬浮和贴壁两种方法分别进行培养和传代，取传代细胞用含5%胎牛血清的、无碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的培养基诱导分化培养14 d，并采用免疫荧光法检测培养细胞诱导分化前后前体细胞和视网膜终末细胞标记物表达的改变。结果悬浮培养的细胞形成神经球并表达神经干细胞的标记物巢蛋白nestin，但无法成功传代扩增；贴壁培养的细胞可连续传代并表达nestin，传代细胞诱导分化后表达视网膜终末细胞的标记物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白(β-tubulin)和恢复蛋白recoverin。结论从8～12周的人胚胎视网膜神经上皮分离培养的视网膜前体细胞具有体外扩增和多分化潜能。（中华眼底病杂志，2007，23：98-100）     

应用组织块培养法对大鼠视网膜干细胞进行分离培养及鉴定

目的:应用组织块培养大鼠视网膜干细胞的有效性。方法:机械分离出生10d大鼠睫状体组织,剪成细小组织块,置入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,同时取大鼠胚胎脑组织,应用常规机械-酶消化法进行神经干细胞的分离培养作为阳性对照。应用免疫荧光染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白(nestin)的表达,应用含100mL/L的胎牛血清的培养基促进其分化以确定其神经干细胞特性。结果:原代培养48h后在组织块边缘开始出现细胞团,折光性强,呈球形或者桑葚状悬浮生长。培养4～5d后,悬浮生长的细胞团数量增多,出现较大的细胞团,原代培养7d后传代,传代后细胞能重新形成细胞团。应用免疫荧光方法可检测到细胞内nestin阳性表达,且视网膜干细胞可在以血清为诱导条件下变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞。其形态、增殖及可分化特性与作为阳性对照的神经干细胞相似。结论:组织块培养法对细胞损伤小,操作简便,可成功对大鼠视网膜干细胞进行分离培养。     

人视网膜前体细胞的体外视网膜组织片下移植

目的研究人视网膜前体细胞移植到体外培养的人视网膜组织片下的细胞分化。方法取无眼部发育异常的4～5个月胚胎眼球，进行视网膜前体细胞分离培养。将传代的细胞移植到体外培养的视网膜神经上皮组织片下，通过光学显微镜和免疫组织化学观察细胞分化和组织整合情况。结果人视网膜前体细胞在体外培养时形成神经球样细胞团，传代后形成子代细胞团，表达神经干细胞标志Nestin。体外培养的视网膜组织片在5d、10d均能基本维持视网膜结构。移植到视网膜组织片下的视网膜前体细胞能够与其建立细胞连接。这些视网膜前体细胞分化后能够表达胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白-2和视紫红质，分别为神经胶质细胞、神经元和光感受器细胞的特异蛋白。结论人视网膜前体细胞具有神经干细胞特征，在体外移植到培养的人视网膜组织片下，能够分化成相应的终末分化细胞。     

大鼠视网膜干细胞与神经干细胞体外增殖、分化特点比较

目的 通过对大鼠视网膜干细胞和神经干细胞体外增殖、分化特点进行比较,进一步明确视网膜于细胞自我更新及向神经细胞方向分化的能力.方法 实验研究.分离出生10 d大鼠睫状体区组织及新生大鼠脑组织,分别应用酶消化法将两种组织制成单细胞悬液,放入含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,观察并比较视网膜干细胞及神经干细胞体外增殖的特点.分别取第2代细胞,应用免疫细胞化学染色法检测干细胞特异性抗原神经巢蛋白（nestin）及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷（BrdU）的表达.同时,应用含50 ml/L的胎牛血清及1×N2添加剂的培养基促进其分化,观察两种细胞向神经细胞方向分化的特点：分别应用免疫细胞化学染色法对分化后的细胞nestin、神经无标志物神经元特异性烯醇酶（NSE）、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白（GFAP）进行检测,并应用卡方检验对两种干细胞分化后的NSE及GFAP阳性细胞数比例进行比较.结果 两种细胞原代培养48 h后均可见小的球状细胞团悬浮生长,折光性强.原代培养约7 d后传代,传代后细胞能重新形成球状细胞团,应用免疫细胞化学染色方法均可检测到细胞内nestin及BrdU的阳性表达,视网膜干细胞体外增殖的能力较神经干细胞弱.两种细胞均可在血清诱导条件下转变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞.诱导第7天进行免疫细胞化学染色,检测出两种干细胞表达nestin阳性细胞数比例分别为（9.5±3.5）%及（9.1±0.7）%.视网膜干细胞分化后NSE及GFAP的阳性细胞数比例分别为（11.2±2.8）%及（18.9＋2.1）%,低于神经干细胞分化后两种标志物阳性细胞数比例[（34.1±63）%及（41.9±3.3）%],NSE、GFAP在两组表达的差异均有统计学意义（x2=103.23,P＜0.05;x2=74.36,P＜0.05）.结论 来源于睫状体区的大鼠视网膜干细胞形态、体外增殖及可分化特性与神经干细胞相似,但其增殖及分化为神经细胞的能力较神经干细胞弱.     

大鼠胚胎视网膜前体细胞的分离、体外培养及鉴定

目的探讨流式细胞分析技术、免疫荧光及^3H—Thymidine分析对大鼠胚胎视网膜前体细胞性质及其体外增殖进行鉴定的可行性。方法来源于19d胚胎大鼠视网膜的视网膜前体细胞,使用流式细胞分析及免疫荧光技术从数量及形态上对细胞性质进行鉴定。采用无血清培养基体外培养,通过^3H-Thymidine分析、形态学观察及统计学分析,研究细胞增殖情况。结果从胚胎大鼠全层视网膜分离出的原代视网膜前体细胞,流式细胞分析结果显示：培养0d时,22．23％的细胞神经上皮干细胞蛋白（Nestin）呈阳性表达,16．04％的细胞Sox-2呈阳性表达,19．66％的细胞钙结合蛋白呈阳性表达,其余终末视网膜细胞标记物（胶质纤维酸性蛋白、CD90、视紫红质、C反应蛋白、突触前膜列阵蛋白）均呈极微量阳性或阴性。免疫荧光结果显示大部分细胞及细胞球（〉90％）Nestin呈阳性表达。培养6d后,流式细胞分析显示43．36％的细胞Nestin阳性,免疫荧光显示Nestin及胶质纤维酸性蛋白呈阳性。连续4d^3H-Thymidine分析及形态学观察、统计学分析原代视网膜前体细胞初期增殖良好。结论流式细胞分析、免疫荧光及^3H—Thymidine等免疫学技术可很好的对视网膜前体细胞性质及其增殖情况进行鉴定。大鼠胚胎原代视网膜前体细胞表现出神经干细胞的特性,根据检测手段不同,阳性结果不同,其原代视网膜前体细胞体外培养初期增殖良好。     

视网膜神经节细胞无血清上清培养液诱导大鼠视网膜干细胞的分化

目的　探讨视网膜神经节细胞无血清上清培养液对视网膜干细胞分化的影响。方法　分离大鼠视网膜干细胞和视网膜神经节细胞;采用免疫荧光法鉴定体外培养的大鼠视网膜干细胞与视网膜神经节细胞,视网膜干细胞以Nestin抗体进行鉴定,视网膜神经节细胞以Thy-1抗体进行鉴定;以视网膜神经节细胞无血清上清培养液培养视网膜干细胞,以不加入条件培养液培养的视网膜干细胞为对照组,收集分化细胞,采用qPCR法检测Nestin、Pax6、Thy-1及Brn-3的基因表达。结果　培养的视网膜干细胞Nestin抗体染色阳性,视网膜神经节细胞Thy-1抗体染色阳性。培养视网膜干细胞72 h后,与对照组相比,无血清上清培养液组细胞Nestin和PAX6基因相对表达量降低,差异均有统计学意义（均为P<0.000 1）;Thy-1和Brn-3基因相对表达量升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　视网膜神经节细胞无血清上清培养液能够诱导视网膜干细胞分化为视网膜神经节样细胞。     

体外诱导大鼠视网膜Müller细胞向神经节细胞定向分化的研究

目的 研究鼠视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后去分化为神经干细胞及进一步定向分化成神经节样细胞的特性.方法 实验研究.体外培养出生后7-10 d的Sprague Dawley大鼠视网膜Müller细胞,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫荧光染色法鉴定Müller细胞纯度.取培养的第3或4代Müller细胞,用含有N2、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的Delbeccon's modified Eagle's medium(DMEM)-F12干细胞条件培养基培养3～5 d后,再用含5%胎牛血清、脑源性神经营养因子和视黄酸的DMEM培养基诱导分化7～10 d,采用免疫荧光染色法分别鉴定去分化及再诱导分化后的细胞.结果 RT-PCR及免疫荧光染色结果显示,分离培养的视网膜Müller细胞纯度可达(95.17±2.68)%以上.干细胞条件培养基培养3～5 d后,大部分Müller细胞汇集形成细胞球,经免疫荧光染色法鉴定,显示细胞球内(95.26 ±1.35)%以上的细胞Nestin表达阳性,(90.33±4.12)%以上细胞BrdU表达阳性.将这些细胞球进一步诱导分化后,可见细胞球内细胞可向外扩展、铺开,分化出形态各异的细胞,其中约(21.14±1.49)%细胞表达神经节细胞特异性标记物Thy1.1阳性.结论 成年啮齿动物视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后,可以产生具有增殖能力和分化潜能的神经干细胞,并可进一步定向分化为神经节样细胞,这为干细胞研究和视神经再生治疗等提供了新的方法和手段.     

全神经球贴壁培养法体外长期扩增视网膜前体细胞

目的:探寻一种既高效又能连续体外扩增视网膜前体细胞(RetinalProgenitorCell,RPC)的培养方法。方法:小鼠胚胎视网膜细胞采取神经球贴壁培养或直接贴壁培养法。神经球贴壁培养时,先经悬浮培养生成富含前体细胞的神经球,然后将低速离心分离出的神经球接种到Poly-D-Lysine包被的培养瓶,在前体细胞培养液中(含FGF-2、EGF和LIF)贴壁培养,头24h在培养液中添加10%的胎牛血清。直接贴壁培养法是将细胞悬液直接接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶。免疫组化和FACS分析神经球贴壁培养细胞的干细胞特性和分化能力,并与直接贴壁培养法得到的细胞进行比较。结果:神经球接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶后贴附到培养瓶底,逐渐形成贴壁生长的单层细胞。该法能够在体外长期扩增视网膜前体细胞,3个月内细胞能够传代10次以上。在RA诱导分化时,能够生成成熟视网膜细胞,表达视网膜细胞特异性标记。FACS分析和免疫组化染色显示神经球贴壁培养所得细胞在未分化时Nestin阳性率(92%)细胞率以及分化为成熟视网膜细胞的比率(53.7%),均高于直接贴壁培养法获得的细胞。结论:神经球贴壁培养法能够在体外长期大量扩增视网膜前体细胞,能较好地保持干细胞特性,并容易分化为成熟的视网膜细胞,较直接贴壁培养具有较大的优越性。     

Strabisme Alternant - Etude clinique - traitement

The author defines motor and sensory alternation: the term alternation should not be used in isolation, it should always be accompanied by the name of the parameter concerned. Sensory alternation is always found together with motor alternation but the reverse is not true.The examining criteria for a diagnosis of sensory alternation are given, sensory alternation must not be confused with alternating inhibition. Working from clinical observations of cases of motor alternating strabismus, the author selects 2 types of binocular sensory relations which allow one to differentiate between:- cases of primary alternating strabismus- cases of secondary alternating strabismusThese forms will develop in different ways; in both cases a cure is possible providing that the right treatment is prescribed and once prescribed carefully followed, etc. It is always a case of serious forms of strabismus whose developmental period is spread over several years.According to the authors, the frequency of cases of true primary strabismus is from 1–3%, the frequency of cases of secondary alternating strabismus varies according to the type of therapy practised on cases of monocular strabismus with amblyopia. These latter will become cases of alternating strabismus under the influence of certain types of therapy carried out over several years (penalization, rocking, alternated occlusion, etc...).Experimental data on kittens confirm clinical data; kittens placed in abnormal environments during the sensitive period will show modification in the distribution of cortical cells and the absence of binocular cells (either because the excitation of the two eyes was not simultaneous, or not identical: artificial strabismus, occlusion, opaque glasses). This disturbances become irreversible after a certain period of exposure (a function of age, length of exposure, etc...).It is thus necessary to bear in mind: 1) the iatrogenic risks of certain orthoptic treatments, 2) the necessity for a binocular form of treatment as soon as possible, as once a certain stage is passed, cortical plasticity diminishes and the elaboration of normal binocular relations becomes impossible.

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