hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

MafA真核表达载体的构建及在人肝癌细胞中的表达

目的:构建肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)真核表达载体pEGFP-N2/MafA,pEGFP-C1/MafA,观察MafA在人肝癌细胞HepG-2细胞内的表达.为研究Mafa基因功能和作用机制奠定基础.方法:提取胰腺总RNA,经RT-PCR获得MafA基因片段,在两端分别引入Hind Ⅲ和Sal Ⅰ的酶切位点.重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2,pEGFP-C1中,用脂质体方法转染至人肝癌细胞HepG-2细胞中,通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测MafA基因和insulin Ⅱ基因的表达.结果:通过RT-PCR获取了MafA基因并成功克隆人载体,转染的细胞有绿色荧光蛋白表达及MafA基因表达,但没检测到insulin Ⅱ基因表达.结论:成功构建质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,并成功表达MafA 基因,但没有insulin Ⅱ基因的表达.     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1构建及在小鼠足细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1及稳定转染小鼠足细胞.方法:用RT-PCR法扩增小鼠肾脏caveolin-1的开放阅读框(ORF),构建TA克隆,用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点亚克隆至真核表达质粒pEGFP-C3中,酶切和测序鉴定.脂质体转染法转染小鼠足细胞,荧光显微镜下动态观察转...     

GDF5基因真核表达载体的构建及其在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达

目的克隆人软骨组织生长分化因子5（GDF5）基因及构建GDF5基因真核表达载体，观察其在恒河猴骨髓间充质干细胞（MSCs）中的表达情况。方法采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人胎儿软骨组织克隆hGDF5基因全长cDNA，插入pEGFP-C2载体，构建重组真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5。重组质粒脂质体介导法转染MSCs细胞，荧光显微镜观察报告基因的表达，RT-PCR法检测目的基因表达。结果成功克隆人软骨组织GDF5基因和构建GDF5真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5，克隆在载体上的基因长度为1505bp，包含全部cDNA编码序列1505bp，测序显示与Genbank上的序列一致。重组质粒转染恒河猴MSCs细胞得到表达，绿色荧光蛋白在转染24h后开始表达，72h达高峰，然后表达逐渐减弱。转染后72h可检测到GDF5mRNA表达。结论人GDF5基因在恒河猴MSCs细胞的成功表达为应用恒河猴模型开展基于细胞的基因疗法修复骨和软骨损伤研究奠定了必要基础。     

Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法从人宫颈癌HeLa细胞中,以RT-PCR方法扩增出人Pin1基因全长cDNA序列(CDS),插入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测GFP-Pin1蛋白的表达。结果RT-PCR扩增出人Pin1基因;构建pEGFP-C1-Pin1重组质粒,体外成功转染入宫颈癌HeLa细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法证实存在GFP-Pin1蛋白高表达;经G418筛选获得单细胞克隆。结论重组质粒pEGFP-Pin1体外转染HeLa细胞后,目的基因能够在细胞内有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。     

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的构建含幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A（CagA）基因片段的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-CagA。方法从幽门螺杆菌细胞株中扩增出CagA基因片段,经回收、纯化,连接到质粒pGEM-T上,测序、酶切后与质粒pEGFP-C3连接,脂质体法将pEGFP-C3-CagA转染入胃癌细胞株BGC823,用荧光显微镜观察转染的细胞。结果通过测序、酶切证明CagA插入质粒正确,构建出载体pEGFP-C3-CagA,转染后经荧光显微镜观察到胃癌细胞株BGC823中有绿色荧光。结论成功构建表达CagA的真核绿色荧光载体。     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控的真核荧光表达载体的构建与表达

目的:克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,构建真核表达载体pEGFP-C3-hTERTp.方法:PCR方法扩增出hTERTp,依次克隆至pGEM-T Easy载体和重组载体pEGFP-C3上.经酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-C3-hTERTp转染人胚肾293A细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果:成功扩增出276 bp的hTERTp,测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致.重组载体pEGFP-C3-hTERTp转染293A细胞能观察到荧光表达.结论:成功构建了hTERT启动子调控的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-hTERTp,其能够在人胚肾293A细胞中表达.     

真核表达载体pEGFP-VASP-lC的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-VASP-lC并稳定转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,为进一步探讨VASP-lC区介导的VASP的寡聚化在HeLa细胞迁移中的作用奠定基础。方法:用RT-PCR技术从人内皮细胞株ECV304细胞中获得VASP-lC区的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-C1中,构建的重组质粒经脂质体介导转染HeLa细胞,Western blot鉴定VASP-lC区在HeLa细胞中的稳定表达。结果:RT-PCR成功地扩增出一条约310bp的片段,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western blot证明人VASP-lC区能以融合蛋白的形式在HeLa细胞中稳定表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-VASP-lC,获得了稳定表达人VASP-lC区基因的HeLa细胞克隆,便于进一步探讨VASP-lC区介导的VASP的寡聚化在HeLa细胞迁移中的作用。