构建携带hTERT I540-PTD融合基因表达框的穿梭质粒

目的: 设计hTERT I540-PTD融合基因表达框并构建携带该表达框的穿梭质粒.方法: 根据hTERT I540表位、HIV-1 TAT-PTD和PTD4的氨基酸序列设计融合疫苗,然后根据哺乳动物偏爱密码子反翻译成基因序列.分段合成寡聚脱氧核糖核酸,磷酸化、退火后先后克隆至pSP72的BamHI-EcoRI和XbaI-BanHI之间.将经双酶切鉴定获得的阳性重组子进行基因测序.然后将hTERT I540-PTD融合基因表达框亚克隆至pDC315.结果: 测序结果表明hTERT I540-PTD和hTERT I540-PTD融合表达框的基因序列与设计完全一致.穿梭质粒pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4经EcoRI酶切后均清晰可见112 bp电泳条带,与预测相符.结论: 成功获得了携带hTERT I540-PTD和hTERT I540-PTD4表达框的穿梭质粒pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4,为制备以重组腺病毒为载体的I540-PTD基因疫苗、比较蛋白转导能力的强弱对基因疫苗免疫效能的影响奠定了基础.     

负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的:构建负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的复制缺陷型腺病毒.方法:将克隆有正义hTERTcDNA的腺病毒穿梭质粒pDC315-hTERT与腺病毒包装质粒pBHGlox-DeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒表达载体(Ad-hTERT).对Ad-hTERT扩增、纯化并浓缩后,进一步行感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.结果:纯化浓缩后的Ad-hTERT滴度可达5×1012pfu/L.电镜下可见在HEK293细胞中形成的病毒颗粒,PCR双引物鉴定Ad-hTERT可扩增出Ad及hTERT特异片段,而对照则不能扩出hTERT片段.结论:成功构建了负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒.     

应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的 用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/mL.结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体.     

构建MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1表达的腺病毒载体

目的：构建串联的MYC反应元件修饰人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1表达的复制缺陷型腺病毒载体。方法：将串联的MYC反应元件修饰的hTERT核心启动子及下游酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1克隆到穿梭质粒pDC316上，上辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞获得重组复制缺陷型腺病毒并在HEK293细胞中扩增重组病毒。PCR法及斑形成实验鉴定重组腺病毒和病毒滴度。结果：成功获得由6倍和18倍MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的复制缺陷型腺病毒载体。结论：MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的腺病毒载体为进一步研究骨肉瘤转录靶向基因治疗奠定了基础。     

修饰hTERT核心启动子靶向转录FCY1的重组腺病毒的构建及鉴定

目的 :构建并鉴定雌激素反应元件与缺氧反应元件共修饰人端粒酶逆转录酶 (hTERT)核心启动子靶向转录酵母胞嘧啶脱氨酶 (FCY1)的复制缺陷型重组腺病毒 .方法 :构建由雌激素反应元件 (ERE)和缺氧反应元件 (HRE)串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子 ,将该启动子序列与酵母胞嘧啶脱氨酶 (FCY1)基因插入穿梭质粒 ,用穿梭质粒与辅助质粒共转染HEK 2 93细胞 ,获得重组腺病毒载体Ad EHhT FCY1,经PCR鉴定证实后 ,采用终点稀释试验测定病毒滴度 .结果 :经 2 4HRE与 8ERE共修饰的hTERT核心启动子序列经正反向测序均正确 ;穿梭质粒和辅助质粒共转染的HEK 2 93细胞 ,在转染后 7～ 10d出现了典型的细胞病变反应 (CPE) ,PCR反应能扩增出 12 2bp的目的片段 ,终点稀释试验测定得到的病毒滴度为 6 2× 10 7pfu·mL-1.结论 :成功构建并获得高滴度的ERE与HRE串联重复序列共修饰的hTERT核心启动子引导FCY1转录的复制缺陷型重组腺病毒 .     

携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建携带人脂联素基因的重组腺病毒载体,为进一步研究脂联素的功能提供实验基础。方法以带有人脂联素基因的质粒pINCY—APM1为模板,聚合酶链反应扩增人脂联素基因APM1,并将其定向克隆于真核表达载体pDC315-EGFP,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,经位点特异重组包装得到重组腺病毒Ad—APM1。通过Real—timePCR和Westernblot分别检测重组腺病毒Ad—APM1感染HEK293细胞后的表达。结果重组腺病毒Ad-APM1包装成功,病毒滴度〉6．3×10^12pfu／mL。Real—timePCR和Westernblot检测证实APM1在HEK293中表达。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了携带人脂联素基因的重组腺病毒。     

携带人白细胞介素10和肝细胞生长因子双基因的重组腺病毒载体构建与鉴定

目的：构建携带人白细胞介素10（hIL-10）和人肝细胞生长因子（hHGF）双基因的重组腺病毒载体。方法：分别以pDC316-hIL10-EGFP和pCDNA3-hHGF重组质粒为模板,PCR扩增获得hIL-10和hHGF基因片段,与pIRES连接成为hIL10-IRES—hHGF,测序正确后酶切,与pDC315连接,获得穿梭质粒pDC315-hIL10-IRES—hHGF,与腺病毒包装系统转染293细胞,包装产生重组腺病毒hIL10—hHGF,PCR鉴定后,扩增病毒,并测定病毒滴度。用重组腺病毒转染BEL-7402和WRL-68细胞,ELISA法检测上清液中hIL—10和hHGF的含量。结果：成功构建了重组腺病毒hIL10—hHGF,扩增纯化后测得重组腺病毒滴度为1×10^9pfu／ml,转染BEL-7402和WRL-68细胞72h后,表达hIL-10的量分别为（6271．7±5．2）pg/ml和（350．6±12．4）pg／ml,表达hHGF的量分别为（20827．1±345．5）pg／ml和（201．6±10．1）pg／ml。结论：本实验为进一步研究Ad—hIL10—hHGF在动物体内抗肝炎、肝纤维化作用奠定了基础。     

携带神经导向因子netrin-1基因的重组腺病毒构建

目的:制备并构建神经导向因子netrin-1(NT-1)和EGFP双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续的基因转染做准备.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因NT-1,并将目的基因克隆入含有报告基因EGFP的穿梭载体pDC316质粒;构建的质粒pDC316-netrin经酶切及测序鉴定正确后.通过脂质体lipofeetamine2000的介导与腺病毒包装质粒pBHGlox_E1.3Cre共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后得到携带鼠NT-1的重组腺病毒Ad5-netrin-CMV-EGFP.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒.以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度.结果:PCR鉴定证实重组腺病毒含有鼠NT-1基因,病毒滴度为5.2×109pfu/ml,EGFP活性检测腺病毒感染阳性细胞率在40%以上.结论:成功制备Ad5-netrin-CMV-EGFP腺病毒,为以后基因治疗研究打下基础.     

小鼠雌激素受体α基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建C57BL/6小鼠雌激素受体α（Esr1）重组腺病毒表达载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠卵巢细胞扩增目的Esr1 CDS区基因片段,至pMD19-TSimple载体后测序鉴定.亚克隆Esr1CDS区基因片段至腺病毒穿梭质粒pDNR-CMV,再与骨架质粒pLP-Adeno-X-CMV在感受态大肠杆菌ElectroMAXTMDH10BTMCells中进行同源重组获得腺病毒载体质粒Adeno-Esr1,PacI酶切线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,测定感染性滴度,获得重组腺病毒Ad-Esr1.将病毒感染HEK293细胞,Western Blot检测Esr1蛋白表达.结果：测序证实提取的Esr1 CDS区基因序列完全正确;测序及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;感染性滴度为6.4×1013（pfu/L）,Western Blot检测Ad-Esr1感染的HEK293细胞能表达Esr1蛋白,而未感染的HEK293细胞蛋白不表达.结论：成功构建了C57BL/6小鼠Esr1基因重组腺病毒载体,为进一步研究Esr1在神经系统中生物学功能及对神经系统疾病的基因治疗奠定了基础.     

HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究

目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒,病毒滴度为5×10^6PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞。结论HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.     

负载hTERT调控相关miR-138复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的 包装负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138前体全长cDNA(pre-miR-138)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR138).方法 pre-miR-138全基因合成后插入腺病毒穿梭质粒(pDC315-miR138),与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1、3Cre共转染人胚肾293细胞...     

表达抗G250人源性抗体增殖缺陷型腺病毒的构建

目的构建表达抗G250人源性抗体的增殖缺陷型腺病毒。方法通过重叠延伸PCR、常规PCR方法,分别获得G250重链的可变区和恒定区（GH）eDNA序列及G250轻链（GL）eDNA序列,并克隆至pCLON12-IRES载体上,构建质粒pCLON12-GL-IRES—GH。酶切质粒pCLON12-GL—IRES—GH回收GL—IRES—GH片段,克隆至腺病毒载体pDC315,构建pDC315-GL—IRES—GH（pDC315-G250）。将pDC315-G250与腺病毒包装骨架质粒pBHGE3共转染HEK293细胞,重组包装表达G250抗体的增殖缺陷型腺病毒AdDC315一G250。纯化病毒表达的G250抗体,免疫印迹实验检测该抗体能否与细胞表面抗原特异性结合。结果PCR及测序结果表明成功构建质粒pCLON12-GL—IRES—GH及腺病毒穿梭质粒pDC315-G250。PCR鉴定表明重组腺病毒AdDC315-G250含有目的基因,病毒包装成功。免疫印迹实验结果显示,纯化的抗体在G250抗原阳性的细胞中能检测到目的条带。结论成功构建表达抗G250人源性抗体的增殖缺陷型腺病毒。     

狨猴血清中重组人5型腺病毒中和抗体滴度的测定

目的构建表达荧光素酶与绿色荧光蛋白报告基因的重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP,检测血清中和抗体最佳实验方法, 分析小型灵长类动物普通棉耳狨猴体内腺病毒5型中和抗体水平,为评价腺病毒载体疫苗提供实验动物基础数据。方法利用 ADMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC315-Luc-GFP,将所得的穿梭质粒和骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293A细胞, 进行重组人5型腺病毒（rAd5/Luc/GFP）的包装。通过3次空斑形成实验筛选出单克隆重组腺病毒,并在大量扩增单克隆腺病毒 后用CsCl密度梯度离心法进行浓缩纯化。采用TCID50法测定纯化后病毒滴度,并挑选进行中和实验的最优病毒滴度。将合 适病毒滴度的rAd5/Luc/GFP与狨猴血清混合预孵育后感染293A细胞,分别采用化学发光法及流式细胞术,对14只普通棉耳狨 猴血清中腺病毒5型中和抗体进行检测。结果PCR、酶切和测序结果均表明穿梭质粒pDC315-Luc-GFP构建成功;GFP检测 结果证明重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP包装扩增成功,病毒滴度可达6.9×1011.5 PFU/mL。两种不同方法检测检测14只狨猴 的中和抗体结果一致性较好（P<0.05,Kappa=0.811）,化学发光法或流式细胞术检测阳性狨猴比率分别为28.6%（4/14）或21.4% （3/14）,化学发光法检测得其中2只狨猴中和抗体滴度为1/16,另2只为1/32,而流式细胞术检测得滴度均为1/16。结论化学发 光法是一种快速,准确,适用于多物种的方法,其灵敏度略高于以GFP为报告基因的流式细胞术（7.2%）。普通棉耳狨猴体内 Ad5血清阳性率较低,有望应用基于此型或其他型别腺病毒作为载体进行基因治疗和基因疫苗研究。     

腺病毒介导的脾酪氨酸激酶对血管平滑肌细胞表型转换的影响

目的 构建脾酪氨酸激酶(Syk)重组腺病毒并感染血管平滑肌细胞(VSMC),观察Syk对VSMC表型转换的影响.方法 运用pDC315-GFP腺病毒载体系统,细菌同源重组法构建含目的 基因Syk腺病毒重组质粒pDC315-GFP-Syk,经过包装、扩增、纯化后获得Syk重组腺病毒;测定病毒滴度并感染体外培养的大鼠VSMC,饥饿处理24 h,用Real-time PCR法和Western blot法对Syk、平滑肌22a蛋白(SM22α)及平滑肌α肌动蛋白(α-SM-actin)表达活性进行检测,观察Syk对平滑肌细胞表型转换的影响.结果 成功构建携带Syk基因的重组腺病毒,纯化后滴度为1011 pfu/mL,腺病毒感染VSMC后5 d,与空病毒组和对照组相比,Syk mRNA(741638.70±35213.53)和蛋白表达水平(2.14±0.71)增高(P<0.01);α-SM-actin(0.80±0.04)和SM22α mRNA表达水平(1.00±0.01)下降(P<0.05),同时,二者的蛋白表达水平也降低(0.61±0.10和0.18±0.06,P<0.01).结论 在VSMC中,Syk通过对其表型转换进行调控,进而影响平滑肌细胞的增殖和迁移.     

携带hVEGF121-EGFP融合基因的腺病毒表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子121(HUMAN VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR121,HVEGF121)和增强型绿色荧光蛋白(ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN,EGFP)融合基因的腺病毒表达载体,观测其表达。方法以PUC18-HVEGF121质粒中的HVEGF121CDNA为模板,用PCR法扩增HVEGF121CDNA片段并去除其终止密码子,将此片段连接到含有EGFP CDNA的PEGFP-N1质粒中,再将融合基因HVEGF121-EGFP克隆到穿梭质粒PDC315中,与腺病毒质粒共同转染293细胞,构建重组腺病毒,并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NIH3T3细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度,并用免疫组化法检测VEGF121在NIH3T3中的表达。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为1.2×1010~2.7×1011PFU/ML。荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的NIH3T3细胞有明显的绿色荧光表达。免疫组化结果也证明VEGF121能在NIH3T3中的表达。结论构建的HVEGF121-EGFP腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗,并观察外源基因在体内的表达。     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。     

全人源鼻咽癌抗独特型抗体I50的原核表达及活性鉴定

目的:用基因工程手段获得有活性的抗独特型抗体I50,并在体外鉴定其活性.方法:以fuse5-I50为模板,用PCR方法扩增出抗独特型抗体I50基因,并将其插入到pET25b(+)中构建原核表达载体pET25b-I50.含有重组质粒pET25b-I50的菌株E.coli BL21(DE3)经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖...