杆状病毒早期启动子载体的构建及报告基因的表达

目的：用苜蓿尺蠖核多角体病毒（AcNPV)的IE1基因启动子构建杆状病毒早期基因启动子载体。方法：以AcNPV p10基因为侧翼序列,并将新霉素抗性基因（neo）插入IE1基因启动子下游,得到转移载体pAcPIneoAcNPV DNA共转染昆虫细胞Sf9,由于neo基因的表达,通过G418的选择和富集作用,得到重组病毒vAcPIneo的纯培养。结果：用酶切和Southern印迹杂交证明,neo基因整合于AcNPV基因组的p10位相。结论：成功地构建了杆状病毒早期启动子载体,neo基因在受染细胞内从早期到晚期均可发生转录。     

带新霉素抗性的萤光素酶报告载体的构建

目的:构建带新霉素抗性的萤光素酶报告载体.方法:设计扩增新霉素抗性基闪neo,克隆人萤光素酶报告载体pGL3,得到pGL3-neo.分别比较pGL3、pGL3-CMV promoter瞬时转染组和经G418筛选的pGL3-neo、pGL3-neo-CMV promoter稳定转染组细胞萤光素酶活性.结果:PCR扩增出neo表达单元;酶切和DNA测序分析鉴定得到带新霉素抗性的萤光索酶报告质粒pGL3-neo.G418筛选可获得稳定转染pGL3-neO)细胞株和稳定转染pGL3-neo-CMV promoter的细胞株.荧光检测显示:瞬时转染pGL3组、pGL3-CMV promoter组及稳定转染pGL3-neo组、pGL3-neo-CMV promoter组萤光素酶活性值分别为1 047±86、1 504±107和34 819±l 479、456 109 4±15 791,稳定转染组萤光素酶活性均高于瞬时转染组,P<0.05.结论:成功构建了带新霉素抗性的萤光素酶报告基因载体,使报告基因检测数据的敏感性和可靠性显著提高.     

EBV-LMP1基因杆状病毒表达载体的构建及其在昆虫细胞中的表达

目的：构建EBV-LMP1基因的杆状病毒重组供体质粒，包装重组LMP1的杆状病毒，感染昆虫细胞进行表达。方法：先将已克隆的LMP1 cDNA与线性化的pFastBACHTb进行连接，使pFASTBACHTb-LMP1与DHl0BAC感受菌进行转座重组，利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid／LMPl克隆，提取Bacmid／LMP1转染昆虫细胞Sf9包装杆状病毒，利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达，通过免疫荧光、SDS-PAGE和Western-blot检测表达情况。结果:获得了重组LMP1的杆状病毒，细胞能表达出与LMP1单抗结合的蛋白，分子量为63kDa左右，细胞可直接分泌LMP1蛋白至上清。结论:LMPl能在昆虫细胞中获得良好表达，为研究肿瘤疫苗及LMPl在EBV致瘤分子机理中的作用奠定了基础。     

谷氨酸脱羧酶重组杆状病毒表达载体的构建

谷氨酸脱羧酶 (ＧＡＤ)是胰岛β细胞的一种主要的自身抗原 ,与１型糖尿病细胞免疫和体液免疫均有密切关系。由于抗ＧＡＤ抗体是最重要的免疫学标志之一和可靠的早期诊断指标 ［１］,所以ＧＡＤ抗原的制备对１型糖尿病的早期诊断及其病因和机制的研究都具有重要意义。本实验将ＧＡＤ６５基因在真核细胞中的表达打下基础。１材料和方法１．１菌株Ｅ．ｃｏｉｌＤＨ５α和质粒 ｐＵＣ１８ -ＧＡＤ６５ 均为本室保存 ;ＲＮＡａｓｅ购自华美生物工程公司 ;限制性内切酶ＸｂａⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ和Ｔ４-ＤＮＡ连接酶、ＤＬ -２０００Ｍａｒｋ…     

杆状病毒介导的靶向DNA甲基转移酶1 siRNA表达载体的构建

目的:构建携带DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)RNAi基因的重组杆状病毒载体,以进一步研究DNMT1对胰腺癌相关基因的影响方法:首先将带有BglⅡ和Hind Ⅲ酶切黏性末端的60 bp正义和反义寡核苷酸退火,与用BglⅡ和Hind Ⅲ双酶切后的线性化载体pSUPER连接构...     

重组人乙型肝炎核心抗原昆虫杆状病毒表达载体的构建

作者利用寡核苷酸定位诱导突变技术,将重组的人乙型肝炎核心抗原(HBcAg),插入丫蚊夜蛾核多角体蛋白病毒,表达载体pAc360的-35位BamH 酶切位点,经突变缺失多角体蛋白基因调控区和HBcAg起始码ATG间32个非编码核苷酸序列,获得一个与自然核多角体蛋白基因结构形式相同的表达载体,即核多角体蛋白基因调控区的-1位紧连核心抗原的起始码ATG.     

杆状病毒表达系统的发展

真核细胞表达系统包括昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞表达系统.而昆虫细胞表达系统,即杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector Systems,BEVS),以其表达量大、可携带较大的基因片段和表达产物功能活性好等方面的优越性而得到了广泛的应用.该系统以杆状病毒为载体,可以用于表达有应用价值的外源基因,也可利用基因工程技术将外源基因引入杆状病毒基因组,生产增强杀虫能力的杆状病毒杀虫剂,并且还可以用于以杆状病毒作为载体的基因治疗,为农业、制药、生物医学等有重要意义的基因研究和生产提供了一种新型、高效的表达系统.     

利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBVC基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual—HBV core，转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9，获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBVC基因的重组杆状病毒，而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白，为进一步研究奠定了基础。     

杆状病毒表达系统的发展

真核细胞表达系统包括昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞表达系统。而昆虫细胞表达系统，即杆状病毒表达系统（Baculovirus Expression Vector Systems，BEVS），以其表达量大、可携带较大的基因片段和表达产物功能活性好等方面的优越性而得到了广泛的应用。该系统以杆状病毒为载体，可以用于表达有应用价值的外源基因，也可利用基因工程技术将外源基因引入杆状病毒基因组，生产增强杀虫能力的杆状病毒杀虫剂，     

人VEGF基因昆虫杆状病毒表达载体的构建

为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有穿梭载体杆粒 (Bacmid)的DH1 0Bac感受态细胞 ,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacmid/VEGF ,采用琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增对重组转座载体、穿梭载体进行鉴定。将Bacmid/VEGF转染sf 9细胞 ,进行病毒重组及噬斑筛选。结果 :琼脂糖电泳得到杆粒 (Bacmid)DNA条带 ,PCR扩增得到 5 75bp的VEGF片段 ,病毒液在 1 0 - 7稀释度时出现噬斑 ,约 5 0个 /孔。说明已成功构建了重组杆状病毒穿梭载体并重组出杆状病毒。     

神经营养素—4（NT—4）在昆虫杆状病毒表达系统中的克隆与表达

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势,表达出具有生物学活性的神经营养系－4（hNT－4）蛋白。方法 通过PCR方法获得hNT－4成熟肽的基因。将其连接到昆虫表达载体pAcgp67B上,在昆虫细胞Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生物学活性测定。结果 获得hNT－4蛋白的表达产物,SDS－PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为15000。经Western-blot验证,表达上清及细胞全蛋白均有一条能与抗人NT－4抗体发生特异性免疫反应的条带。经PC12细胞测定。表达上清中的rNT－4蛋白具有明确的生物学活性。结论 hNT－4在昆虫杆状病毒表达系统中的表达为今后进一步深入研究hNT－4的功能及其在临床中的应用提供了条件。     

HIV-1 gag-gp120嵌合基因重组杆状病毒载体的构建

目的 :构建含有 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体。方法 :利用基因重组技术将 B亚型中国株 HIV- 1的结构基因 gag与 gp12 0嵌合后再通过大肠杆菌 /杆状病毒系统构建重组杆状病毒载体。结果 :酶切电泳显示基因重组正确 ,电镜显示重组杆状病毒大量扩增。结论 :含有B亚型 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体构建成功 ,为进一步研究Gag- gp12 0嵌合蛋白的表达及其生物学活性奠定了基础。     

人类偏肺病毒F基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人类偏肺病毒融合蛋白(F)基因的真核表达质粒,并在昆虫细胞sf-9中表达.方法:采用RT-PCR法扩增人类偏肺病毒A亚型CAN97-83 F基因的全长序列,将其插入供体质粒pFastBacHT载体多克隆位点区,经酶切鉴定后转化大肠杆菌DH10bac.供体质粒与受体杆粒(Bacmid)发生位点特异性转座获得重组的杆粒.采用脂质体将重组杆粒转染进昆虫细胞sf-9,包装获得感染性杆状病毒.用此病毒感染sf-9细胞并表达蛋白,经6×His树脂纯化后用免疫印迹法验证表达蛋白.结果:PCR及序列分析证实所获得的重组杆粒包含hMPV全长F基因序列,被重组杆状病毒感染的昆虫细胞sf-9显示典型细胞病变.采用抗6×His单克隆抗体为一抗,免疫印迹法检测到分子量约70ku的较单一的蛋白条带,证实F蛋白表达成功.结论:杆状病毒是一高通量、目标蛋白抗原性保存完好的表达系统.采用这一系统成功表达的hMPV F蛋白,将为我国hMPV血清流行病学和免疫发病机理研究奠定基础.     

Survivin启动子驱动的LRIG1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含Survivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为肿瘤基因治疗的研究奠定基础。方法应用分子克隆技术将Survivin启动子连接至pLRIGl-GFP上构建出pEGFP-Surp-LRIGl,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine2000共转染至人胚肾293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl。Ad-Surp-LRIGl在人胚肾293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果 pEGFP-Surp-LRIGl经酶切鉴定正确,扩增得到的Ad-Surp-LRIGl经PCR扩增证实为Survivin启动子驱动的LRIG1重组腺病毒,滴度为2.3×1010pfu/ml。结论成功构建出含有Sur-vivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步膀胱癌基因治疗的研究中。     

含mdr1启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建

目的克隆编码mdr1基因的启动子并插入荧光素酶报告基因载体.方法用PCR技术扩增出人类mdr1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pGEM-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-enhancer载体中,并确定扩增DNA的序列.结果测序结果显示扩增mdr1启动子序列正确.结论成功克隆了mdr1启动子,为下一步对多耐药性卵巢癌进行靶向基因治疗提供了重要基础.     

携带lacz报告基因的腺病毒载体在大鼠滑膜组织中的表达

目的：观察lacz报告基因重组腺病毒对滑膜组织的转染能力及表达持续时间。方法：55只雄性Wistar大鼠随机分为11组，每组5只。将100μl lacz报告基因的腺病毒载体(pAxCAI lacz)进行保关节腔注射，注射后分别于第1、2、3天及第1、2、3、4、5、6、7、8周时处死1组大鼠，采用x—gal染色的方法观察腺病毒在滑膜组织中的表达情况，计算机图像分析定量描述其表达的时相性改变。结果：x—gal染色显示，腺病毒转染滑膜组织后，报告基因在滑膜衬里层及滑膜下层的组织细胞中表达，表达的高峰出现在转染后3—7d，持续表达时间一直维持到转染后7周。结论：腺病毒载体可以高效实现体内基因的转移和表达，是一种可用于关节滑膜组织体内转基因治疗的基因载体。     

人NaDC1基因近端启动子生物信息学分析及载体构建

目的对人NaDC1（hNaDC1）基因近端启动子进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式元件,并构建相应基因序列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法使用First EF程序分析并获得hNaDC1基因近端启动子序列,使用MatInspector5.0软件对近端启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。PCR法扩增hNaDC1基因近端启动子序列,PCR产物经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆到pGL3-Basic载体。重组质粒行KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定。结果使用FirstEF程序获得长度为2.4kb（-2232/＋136）的hNaDC1基因近端启动子序列。MatInspector5.0程序分析显示该基因序列共含有152个74种顺式作用元件。KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hNaDC1A质粒插入片段正确无误。结论成功构建hNaDC1基因近端启动子转录调控序列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为利用双荧光素酶报告基因检测系统研究hNaDC1基因近端启动子转录调控元件的分布及其性质提供了基本试验条件。     

AKR1B10基因过表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

目的：构建AKR1B10基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,观察其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,为研究AKR1B10基因与乳腺癌的关系提供实验依据。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,将载体瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR与Western blotting方法检测未转染的MCF-7细胞、转染pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞和转染空质粒pcDNA3.1(+)的MCF-7细胞中AKR1B10基因的表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10。RT-PCR结果显示,将未转染的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量设定为1,转染质粒的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量为1.79,转染空质粒的MCF-7细胞表达量为0.98,转染表达载体细胞AKR1B10基因表达量与转染空质粒的细胞和未转染的细胞比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blotting结果显示,与未转染的MCF-7细胞和转染空质粒的细胞比较,转染表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量增多。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,AKR1B10基因在转染表达载体的MCF-7细胞中高表达。     

以绿色荧光蛋白为报告基因的酿酒酵母表达载体的构建

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的酿酒酵母表达载体。方法：利用通用载体质粒融合系统（UPS），首先将GFP片断连入donor载体，随后在Cre酶作用下与acceptor载体融合，获得了带有GFP片断的酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）表达载体。结果：成功构建了以GFP为报告基因的酿酒酵母载体，并在酵母中得到表达。结论：GFP是一种理想的报告基因。同时，利用UPS能够高效、简便地进行酵母表达载体的构建。     

YB-1腺病毒载体的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞耐药性的影响

目的:构建携带人YB1基因的重组腺病毒载体,并观察其对乳腺癌细胞株MCF-7药物敏感性的影响,并分析其可能的机制.方法:设计含有BglⅡ和HindⅢ酶切位点的引物,PCR克隆人YB1基因,插入穿梭载体pAdTrack-CMV,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组,获得重组子pAdEasy...