9-硝基喜树碱及其脂质体对HepG2、L02细胞周期和凋亡作用的研究

目的 研究9-硝基喜树碱及其脂质体对人肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞L02细胞周期、凋亡的影响及其可能的作用机制.方法 HepG2、L02细胞用含不同浓度9-硝基喜树碱及其脂质体的培养液孵育后,利用MTT法测定细胞活性,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,WesternBlot验证周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达变化.结果 9-硝基喜树碱及其脂质体对两种细胞生长呈时间和剂量依赖性抑制.药物处理后S期和G2/M期细胞明显增多,浓度大于0.1 μmol/L时24 h后HepG2细胞完全阻滞于S期;0.1 μmol/L孵育72 h后,超过95%HepG2细胞阻滞于G2/M期.药物对细胞凋亡的诱导作用也呈明显的剂量和时间依赖关系.Western Blot显示:Bax、Caspase3表达增高,Cyclin A、Cdk2、Cyclin E、Bcl-2表达减低.与L02相比,HepG2细胞对药物更加敏感.结论 9-硝基喜树碱及其脂质体可以通过调控细胞周期和诱导凋亡有效抑制细胞生长,其对肿瘤细胞的抑制作用强于正常肝细胞.9-硝基喜树碱脂质体体外抗肿瘤效果略强于9-硝基喜树碱单体.

Abstract：

Objective To investigate the modulating effects and explore their mechanism of 9-nitrocamptothecin and its liposomes to induce apoptosis and inhibit cell cycle in HepG2 and L02 cell lines. Methods Cells were incubated with 9-nitrocamptothecin(9NC) or with 9-nitrocamptothecin liposomes for 24 h, 48 h and 72 h, then, the cell viability was measured via MTT assay; cell cycle and apoptosis was evaluated by flow cytometry after stained by PI and Annexin V-PE/7AAD. Additional, Western Blot was used to evaluate the expression of cell cycle and apoptosis related protein. Results Both cells viability were apparently inhibited by the 9-nitrocamptothecin and 9-nitrocamptothecin liposomes, the inhibitory effect showed a time-dependent and dose-dependent manner. Both S and G2/M phases arrest were observed after incubated with drugs. HepG2 cell was completely arrested in S phase when 9NC concentration over than 0. 1 μmol/L after incubation for 24 h, while more than 95% cells arrested in G2/M phase when 9NC concentration is 0. 1 μmol/L after incubation for 72 h. Apoptosis induction effect also showed a time-dependent and dose-dependent manner. Western Blot results showed the expression of Bax and Caspase-3 were upregulated while Cyclin A, Cdk2, Cyclin E and Bcl-2 were downregulated. More importantly, the compounds were more cytotoxic to the cancer cell lines than to the normal liver cell. Conclusions 9-nitrocamptothecin and 9-nitrocamptothecin liposomes can potently inhibit cell growth via regulation of cell cycle and induction of apoptosis, and this effect was preferentially in cancer cell. Inhibitory of 9-nitrocamptothecin liposomes was slightly better than the 9-nitrocamptothecin.     

抗肿瘤新药9-硝基喜树碱研究进展

9-硝基喜树碱为新型的口服喜树碱类衍生物,具有明显的抗肿瘤作用,其作用机制与抑制DNA合成的拓扑异构酶Ⅰ有关.本文就9-硝基喜树碱的特点、作用机制、国内外最新临床研究及胰腺癌临床研究作一综述.     

索拉菲尼对肝癌细胞HepG2自噬的抑制作用

目的：研究化疗药物索拉菲尼（Sorafenib）对肝癌细胞HepG2自噬的作用及自噬与细胞增殖、细胞凋r_的关系。方法：常规细胞培养,以10μmol／L的索拉菲尼作用不同时间,采用MDC染色,在荧光显微镜下观察自噬泡的情况：用Western印迹检测自噬相关蛋白LC3的动态变化;用3-MA抑制肝癌细胞中自噬的表达,并用CCK8法检测索拉菲尼及其联合3-MA对细胞生存率的影响,用AnnexinV／PI流式细胞仪检测抑制自噬后凋亡的变化。结果：HepG2经索拉菲尼作用后,自噬泡明显减少,LC3蛋白尤其是LC3-Ⅱ随着作用时间延长逐渐减弱;索拉菲尼联合3-MA可进一步抑制HepG2细胞中自噬的表达,抑制自噬后细胞死亡明显增加,特别是细胞凋亡明显增加。结论：索拉菲尼抗肝癌作用可能与抑制肝癌细胞自噬有关。     

阿司匹林对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制

目的 观察阿司匹林(AS)对肝癌细胞SMMC-7721生长的作用,并探讨其作用机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度阿司匹林对肝癌细胞细胞生长的抑制作用以及流式细胞仪检测不同浓度阿司匹林对肝癌细胞细胞周期的影响;免疫组织化学方法检测阿司匹林对肝癌细胞细胞增殖核抗原(PCNA)、环氧合酶-2(COX-2)表达的影响;并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定COX-2基因的表达.结果 肝癌细胞经不同浓度的阿司匹林作用后,其生长抑制率明显升高(P<0.05),且与阿司匹林浓度有关和作用时间相关.细胞周期检测结果显示,经不同浓度阿司匹林作用后的SMMC-7721细胞,细胞周期发生明显变改.表现为随着阿司匹林浓度的增加,S期细胞比例下降明显,G0/G1期及G2/M期细胞比例则上升(10-2、10-3moL/L AS组与对照组比较P<0.05).免疫细胞化学染色显示,阿司匹林能下调肝癌细胞COX-2、PCNA的表达.RT-PCR检测表明,COX-2基因表达电泳条带与对照组比较辉度明显降低,其中10 mmol/L阿司匹林组最低,说明随着阿司匹林浓度增加,COX-2表达逐渐减少,阿司匹林能下调SMMC-7721细胞表达COX-2基因.结论 阿司匹林能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长,这种作用可能是其通过抑制细胞增殖,与抑制COX-2、PCNA的表达有关.     

9-顺-维A酸对肺鳞癌细胞株A2细胞周期、凋亡及相关基因表达的影响

目的 探讨9-顺-维 A酸(9-cis RA)对肺鳞癌细胞株A2细胞周期影响和诱导凋亡作用并检测细胞周期相关基因 Cyclin D1、Rb的表达,探讨9-cis RA的抗癌作用机制。方法 体外培养 A2细胞,随机分为两组,实验组加入 9-cis RA使其终浓度为 5μmol/L,对照组加入二甲亚砜使其终浓度为 0.1％,两个组别均按 0、12、24、36、48、72 h共 6个时相培养,用流式细胞仪技术分别检测肿瘤细胞G0/G1期比率、S期比率及凋亡发生率,同时检测Cyclin D1、Rb基因表达率,作对比研究。结果 9-cis RA作用于肺癌细胞 A2后 G0/G1期细胞比率增高,S期细胞比率下降。9-cis RA作用于 A2细胞后凋亡发生率明显升高,Rb基因表达增强,Cyclin D1基因表达受抑制,在 48 h时药物作用达最高峰。凋亡发生率与Rb基因表达呈正相关(r=0.647,p<0.05),与Cyclin D1基因表达呈负相关(r=-0.723,P<0.05)。结论 9-cis RA可能通过激活 Rb基因表达和抑制 Cyclin D1基因表达途径使肺癌细胞明显阻滞在 G0/G1期,抑制肺癌细胞增殖。9-cis RA可明显诱导肺癌细胞调亡,Rb和Cycin D1基因同样在其中发挥着重要作用。     

Triapine对肝癌细胞株HepG2中GADD45β表达影响及其可能机制

目的:DNA损伤修复相关基因GADD45β的特异性表达缺失与肝癌的恶性程度密切相关,本研究初步明确肝癌细胞中GADD45β近端启动子序列,探索3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲(Triapine)对人肝癌细胞株HepG2的GADD45β表达影响及其可能机制。方法:体外合成GADD45β近端启动子序列(-618至-314),构建荧光素表达质粒,转染HepG2,根据启动子活性强度结合数据库分析存在的转录调节因子结合位点;以实时荧光定量PCR比较Triapine作用前后HepG2细胞GADD45β表达;进一步比较Triapine对GADD45β启动子活性的调控作用,分析Triapine对HepG2的抑制效应;并通过Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表达变化测定凋亡的发生和发展。结果:GADD45β近端启动子中含有3个NF-κB(-602/-593、-581/-572、-537/-528)和1个E2F-1(-470/-436)转录调节因子与启动子结合位点;2.5μmol/L和5μmol/L的Triapine作用后,GADD45β/GAPDH分别为0.029 3和0.073 9,呈现剂量-诱导效应正相关,同时NF-κB和E2F-1启动子活性分别增强了1.5和0.8倍;高剂量Triapine对HepG2的DNA合成能力和细胞克隆形成能力的抑制率分别为75.25%和60.54%,呈现剂量-抑制效应正相关;Triapine作用后6 h即出现HepG2凋亡高峰。结论:Triapine能通过增强转录调节因子的活性,诱导肝癌细胞中特异性缺失的GADD45β基因表达;进而抑制肝癌细胞的增殖并启动凋亡途径。     

藤黄酸对膀胱癌细胞株BIU-87生长的抑制作用

目的 探讨GA(藤黄酸)对膀胱癌细胞株BIU-87生长的抑制作用及其机制.方法 分别以倒置相差显微镜、噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术观察GA对BIU-87的形态学改变作用、生长抑制效应、凋亡诱导以及周期阻滞作用.结果 倒置相差显微镜观察发现,GA作用后BIU-87细胞变圆、脱壁,部分死亡、漂浮;MTY法显示,GA对BIU-87具有明显的生长抑制作用,并随着药物浓度的增加(0～3 μmol/L)而逐渐增强,IC50为1.7μmol/L;流式细胞术检测发现,GA浓度为1.5、3.0μmol/L时凋亡率分别为(34.6±5.2)%和(58.6±6.9)%,显著高于对照组的(2.2±0.8)%;GA浓度为0、1.5、3.0 μmol/L,作用48 h后,G_0～G_1期细胞数分别是(35.0±1.2)%、(35.0±1.5)%、(46.0±3.1)%;而S期细胞比例分别为(33.5±0.7)%、(34.1±0.6)%、(15.6±3.3)%,并呈剂量依赖性阻滞BIU-87细胞周期于G_0/G_1期.结论 GA对BIU-87细胞有明显生长抑制作用,这可能与诱导BIU-87凋亡、阻滞其细胞周期进程有关.     

曲格列酮对肝癌细胞株HepG2侵袭潜能的抑制作用

目的观察过氧化物酶体增长因子活化受体γ激动剂曲格列酮对人肝癌细胞株HepG2侵袭潜能的抑制作用及其机制。方法以曲格列酮处理体外培养的HepG2细胞,Transwell小室检测细胞侵袭能力,RT-PCR检测尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,u-PA)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA表达。结果经曲格列酮作用后,HepG2细胞侵袭潜能受到明显抑制,u-PA和VEGF mRNA的表达水平下降。结论曲格列酮可抑制肝癌细胞的侵袭潜能,其机制涉及下调u-PA、VEGF的表达。     

MT1M基因对肝癌细胞株Hep-G_2细胞周期及信号通路的影响

目的 :研究MT1M基因对肝癌细胞Hep G2 细胞周期的影响及可能参与的信号通路。　方法 :构建表达MT1M基因的真核质粒 ,转染Hep G2 肝癌细胞株 ,流式细胞术检测该基因对细胞周期的影响 ,通过双荧光素酶报告系统检测该基因对细胞信号通路的影响。　结果 :MT1M基因可诱导Hep G2 细胞停滞在G2 期的细胞增加 ,同时能促进NF κB的转录活化。　结论 :MT1M基因可以影响Hep G2 细胞的细胞周期并活化NF κB的信号通路。     

10-HCPT对人肝癌细胞HepG2体外生长及凋亡的影响

我们观察了 10 羟基喜树碱(10 HCPT)对人肝癌细胞株HepG2体外生长及其凋亡率的影响,为10 HCPT在肝癌辅助治疗中的应用提供了实验依据。材料与方法一、材料人肝癌HepG2 细胞株(HepG2)由重庆医科大学肝脏病研究所提供。10 HCPT由中国医学科学院药植所新药中心提供。二、方法1     

Flavopiridol对尤文肉瘤SK-N-MC细胞增殖的抑制作用

目的探讨细胞周期蛋白激酶抑制剂（flavopiridol）在体内外抑制尤文肉瘤细胞增殖的作用及其机制。方法以不同浓度的flavopiridol作用于培养的SK-N-MC细胞,用噻唑蓝法（MTT）检测细胞增殖,流式细胞分析仪测定细胞周期。采用DNA凝胶电泳检测法,观察flavopiridol诱导细胞凋亡的情况;蛋白质电泳观察Bcl-2及Mcl-1表达变化;建立SK-N-MC细胞裸小鼠皮下移植瘤模型,腹腔内给药,观察肿瘤生长情况;肿瘤标本石蜡包埋切片,免疫组织化学原位末端标记法（TUNEL）检测flavopiridol在体内对肿瘤细胞的凋亡诱导情况。结果（1）Flavopiridol对人尤文肉瘤细胞增殖有抑制作用,时间越长、浓度越高,抑制作用越强。（2）Flavopiridol可改变尤文肉瘤细胞周期,随药物浓度增加Sub-G1期百分比逐渐上升。尤文肉瘤细胞经flavopiridol中、高浓度给药后,DNA凝胶电泳可见典型的梯状带。（3）Flavopiridol给药前后,Bcl-2蛋白表达无变化,而Mcl-1蛋白表达明显下降。（4）TUNEL染色结果显示实验组阳性细胞比例上升,与对照组比较差异有统计学意义。结论Flavopiridol能在体内外抑制尤文肉瘤细胞的增殖,其机制主要是阻滞细胞周期的G1/S期,诱导细胞凋亡。     

苦碟子注射液对Lewis肺癌的抑制作用

目的 探讨苦碟子注射液(KDI)对Lewis肺癌体内外的抑制作用及其机制.方法 12.5～400.0g/L KDI分别作用Lewis肺癌细胞后,噻唑蓝(MTT)比色法检测KDI体外对Lewis肺癌细胞的抑制作用.用C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型,观察不同浓度KDI的抗癌作用,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡及细胞周期.结果 KDI能显著抑制Lewis肺癌细胞的增殖,并呈剂量效应.低、中、高剂量组对Lewis肺癌的抑瘤率分别为21.64%、36.43%、46.68%,均明显高于生理盐水组(P＜0.01);流式细胞仪检测发现,KDI低、中、高剂量组G0/G1期细胞数分别为(68.10±3.43)%、(80.06±5.48)%和(78.36±6.68)%,S期细胞比例分别为(30.98±1.99)%、(17.48±6.36)%和(17.05±6.35)%,KDI能够使Lewis肺癌细胞阻滞于G0/G1,凋亡率分别为8.96%、17.40%、10.34%,均显著高于生理盐水组(P＜0.05).结论 在体内外,KDI对Lewis肺癌均有明显的抑制作用,可能与其诱导细胞凋亡并使细胞周期阻滞于G0/G1期有关.     

高压氧联合顺铂对肺腺癌A549/DDP细胞增殖的影响

目的 观察高压氧(HBO)联合顺铂(DDP)对肺腺癌A549/DDP细胞增殖的影响以及高压氧对细胞周期和凋亡的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测高压氧和顺铂对A549/DDP细胞是否有协同抑制作作用,流式细胞法(FCM)分析高压氧对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 单纯高压氧对A549/DDP细胞的抑制率为2.90％,与常压对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).不同浓度(3、6、12、24μg/ml)的顺铂对A549/DDP细胞的抑制率分别为1.87％、4.62％、11.15％、30.45％,各组间比较差异均有显著性(P＜0.01);高压氧联合不同浓度顺铂对A549/DDP细胞的抑制率分别为4.37％、8.92％、21.88％、48.71％,与顺铂组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).FCM结果显示,A549/DDP细胞经高压氧干预后,G0/G1期细胞减少,S期细胞增多,与对照组比较差异均有极显著性(P＜0.01).凋亡率由2.8％增至7.9％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 高压氧与顺铂可起到协同抑制A549/DDP细胞增殖的作用,高压氧能阻滞细胞于S期,并促进细胞凋亡.     

柴胡皂甙-d对人肝癌HepG2细胞周期的阻滞作用及p27表达的影响

目的 观察柴胡皂甙-d(SSd)对人肝癌HepG2细胞周期的阻滞作用及对其p27基因表达的影响.方法 常规培养人肝癌HepG2细胞至对数生长期,随机分为两组,实验组10 mg/L的SSd作用48 h,设空白对照;流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞p27基因mRNA表达;免疫组织化学SP法检测p27蛋白的表达.结果 实验组HepG2细胞G1期百分率为(69.43 ±3.01)％较对照组(62.83±2.72)％明显增加(P＜0.05),S期细胞百分率为(22.30±0.82)％较对照组(27.23±0.59)％明显减少(P＜0.01);p27基因mRNA相对表达量(0.566 ±0.001)较对照组(0.335±0.000)明显增多(P＜0.05);p27蛋白表达阳性率为(33.9±3.1)％较对照组(21.9±1.7)％亦明显增多(P＜0.01).结论 SSd可导致人肝癌HepG2细胞周期阻滞于G1期,其机制可能与上调p27基因表达有关.     

RASSF1A基因表达对人肝癌细胞株QGY-7703生长的影响

目的观察RASSFlA基因的表达对人肝癌细胞株QGY-7703在体内外生长的影响。方法利用已构建成功的稳定表达RASSFlA基因的肝癌细胞株QGY-7703，通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、细胞周期的测定和裸鼠致瘤性试验对各稳定表达株的生物学行为进行检测。结果以未转染的QGY-7703为对照，RASSFlA基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长速度，使肝癌细胞周期阻滞在G1／S期，显著降低肝癌细胞在软琼脂中形成的克隆数目（P〈0．01）和大小，显著减慢裸鼠皮下瘤的生长速度和重量（P〈0．01）。空载体的表达对肝癌细胞的生长影响不明显。结论RASSFlA的重表达抑制肝癌细胞在体内外的生长；RASSFlA基因是一个新的肝癌相关的抑癌基因。     

紫龙金对前列腺癌细胞系DU-145的体外作用

目的　探讨中药紫龙金 (ZLJ)对雄激素非依赖型人前列腺癌细胞系DU 14 5的体外作用及其机制。方法　应用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法、软琼脂集落生长试验和流式细胞术测定ZLJ对DU 14 5的增殖抑制、集落生长抑制、周期阻滞和诱导凋亡作用 ,应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和Westernblot方法检测对凋亡相关基因 /蛋白bcl 2和bax ,抑癌基因 /蛋白p16表达的影响。结果　ZLJ具有时间和剂量依赖性增殖抑制、G0 /G1期阻滞和诱导凋亡作用 ,作用 72hIC50 为 0 .42g/L ,ZLJ 0 .1g/L作用 14d对DU 14 5细胞集落生长抑制率为 87.9% ,ZLJ 0 .5 g/L作用 2dG0 /G1期细胞比例从 41.3 0 %增高至 76.70 %。ZLJ可以下调bcl 2基因 /蛋白 ,上调bax和p16基因 /蛋白的表达。 结论　ZLJ可能通过抑制DU 14 5细胞的集落生长、增殖抑制、G0 /G1期阻滞、诱导凋亡、下调bcl 2基因 /蛋白 ,上调bax和 p16基因 /蛋白表达等作用机制发挥抗肿瘤作用。     

槲皮素及其7-OH衍生物对膀胱癌细胞增殖抑制作用及细胞周期的影响

【摘要】 目的 通过细胞试验及裸鼠移植瘤实验,研究槲皮素及其7-OH衍生物对人膀胱癌BIU-87细胞的增殖抑制作用及细胞周期的影响。方法〓体外实验:培养BIU-87细胞,分别加入槲皮素(QUE)及槲皮素单硫酸酯钠盐(SQMS),MTT实验测定并计算生长抑制率及半数抑制浓度IC50;流式细胞仪检测细胞周期。体内实验:观察不同剂量SQNS及槲皮素对BIU-87细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用;瘤体组织切片行HE染色和免疫组化染色检测Ki-67,CyclingB1,CyclingD1蛋白表达情况。结果〓槲皮素及SQMS体外均能抑制BIU-87细胞的增殖,相同浓度两药物间对比差异无统计学意义(P>0.05)。槲皮素使BIU-87细胞周期明显阻滞于G2/M期,而SQMS则主要阻滞于G0/G1期。在体内实验中,中等剂量的SQMS组抑瘤率与槲皮素组相近(P>0.05),CyclingD1表达比槲皮素组下调更明显(P<0.01),而槲皮素组CyclingB1表达比中剂量SQMS组下调更明显(P<0.05)。两组Ki-67表达无显著性差异(P>0.05)。结论〓槲皮素及其衍生物SQMS对膀胱癌细胞BIU-87有抑制增殖作用;中剂量的SQMS对成瘤生长的抑制作用与槲皮素作用相近;槲皮素对人膀胱癌细胞增殖抑制作用可能是通过下调CyclingB1的表达,阻滞细胞周期于G2/M期,而SQMS则可能是通过下调CyclingD1的表达,阻滞细胞周期于G0/G1期。     

5-氮-2-脱氧胞苷体内外抑制胆管癌细胞生长的研究

目的研究甲基化抑制剂 5 氮 2 脱氧胞苷在体内、体外对胆管癌细胞株生长的抑制作用。方法应用MTT法检测 5 氮 2 脱氧胞苷及其他抗肿瘤药物对胆管癌细胞株QBC939存活率的影响 ,应用流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。观察 5 氮 2 脱氧胞苷对裸鼠皮下移植肿瘤生长的影响。结果 5 氮 2 脱氧胞苷抑制胆管癌细胞QBC939的增殖 ,细胞周期阻滞于G1期 ,凋亡增加。以上作用与药物浓度及所用时间在一定范围内呈正相关。 5 氮 2 脱氧胞苷与其他肿瘤化疗药物协同可增强对胆管癌细胞的杀伤作用。经 5 氮 2 脱氧胞苷处理后 ,QBC939在裸鼠体内成瘤率下降 ,肿瘤体积缩小。结论 5 氮 2 脱氧胞苷诱导胆管癌细胞凋亡 ,抑制肿瘤生长 ,与其他肿瘤化疗药物有协同作用。