异基因骨髓间充质干细胞移植对胶原诱导性关节炎大鼠的免疫调节作用

目的 通过对类风湿关节炎(RA)动物模型胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的实验研究,观察异基因骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对早期、晚期CIA大鼠免疫细胞和分子的免疫学作用,并探讨其在体内发挥免疫调节作用的机制.方法 采用密度梯度离心结合贴壁培养法体外分离、培养大鼠MSCs,细胞表型鉴定;建立CIA大鼠模型;MSCs移植均采用尾静脉注射,移植后第42天全部处死动物取脾,通过实时定量-聚合酶链反应(RT-PCR)测定Foxp3 mRNA的表达水平,流式细胞术测定CD4+CD25+调节性T细胞的变化.采用单因素方差分析、LSD-t检验法进行统计学分析.结果 早期、晚期CIA对照组CD4+CD25+调节性T细胞(1.6±0.6,1.4±0.6)和Foxp3 mRNA(0.88±0.20,0.91±0.12)的表达水平低于健康组和治疗组,差异有统计学意义(P＜0.05),早期治疗组CD4+CD25+调节性T细胞(5.0±0.4)比晚期治疗组(3.9±0.4)有所升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 异基因MSCs移植可通过上调CIA大鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞水平,促进Foxp3 mRNA的表达而发挥其在体内的免疫调节作用,早期治疗组的疗效优于晚期治疗组.     

异基因骨髓间充质干细胞移植在胶原诱导性关节炎大鼠体内的归巢

目的 通过对类风湿关节炎(RA)动物模型胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的实验研究,观察异基因骨髓间充质干细胞(MSCs)移植在CIA大鼠免疫器官和关节炎症部位的归巢和分布,并探讨其修复损伤关节的可能机制.方法 采用密度梯度离心结合贴壁培养法体外分离、培养大鼠MSCs,细胞表型鉴定;荧光染料PKH-26和5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs,将64只大鼠随机分成正常组和CIA组,MSCs移植后第3、11、30、42天分别处死8只大鼠,取不同分组大鼠的胸腺、脾脏和关节组织制作病理切片,共聚焦显微镜联合免疫组织化学技术,观察MSCs移植后不同时点在不同脏器的迁移和分布,采用SPSS 12.0软件进行独立样本t检验.结果 异基因骨髓MSCs在CIA大鼠的脾脏、胸腺、关节炎症部位可较长期(42 d)的存在,MSCs移植后42 d,脾脏平均灰度值CIA组37.5±8.8高于正常组16.0±2.3,胸腺平均灰度值CIA组29.9±5.9高于正常组13.2±4.3,关节组织的平均灰度值CIA组78±8低于正常组93±14,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 异基因骨髓MSCs移植优先定位于受损伤的组织和器官而发挥其治疗作用.

Abstract：

Objective To observe homing of mesenchymal stem cells (MSCs) in immune organs and inflammatory joints in collagen induced arthritis (CIA) rats. Methods Rats MSCs were isolated and expanded from bone marrow cells by density gradient centrifugation and adhering to the culture cell walls, and the phenotypes were assessed by flow cytometry. MSCs were labeled by PKH-26 and Brdu. Sixty-four rats were randomly divided into normal group and CIA group. Every 8 rats were sacrificed at 3, 11, 30, 42 days after transplantation of MSCs. At the end of the experiment, the specimens of thymus gland, spleen, ankle joints were exposed, fixed, decalcified, wrapped and cut into slices. Confocal laser scanning microscope and immunohistochemical method were used to observe migration and distribution of MSCs in different organs. Independent samples group t test with SPSS 12.0 software package was used for statistical analysis. Results It was found that allogenic MSCs could stay in spleen, thymus gland and joints of CIA rats for a relatively long period (42days). Forty-two days after transplantation of MSCs, the average grey scale values of spleen and thymus gland in CIA group (37.5±8.8, 29.9±5.9 respectively) were significantly higher than the normal group (16.0±2.3,13.2±4.3 respectively), the average grey scale values of ankle joints in CIA group 78±8 was significantly lower than the normal group 93±14 (P<0.05). Conclusion It has been found that MSCs can stay in the injured tissue and organs preferentially.     

骨髓间充质干细胞移植治疗胶原诱导性关节炎的疗效和机制

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗胶原诱导型关节炎(CIA)疗效及可能治疗机制.方法 分离培养C57BL/6小鼠MSCs.健康对照组DBA-1小鼠3只(第0天和第21天尾静脉输注生理盐水0.2 m1)15只牛Ⅱ型胶原诱导的CIA小鼠随机分为CIA对照组(第0大和第21天尾静脉输注生理盐水0.2 ml)、预防组(第0天输注MSCs1×106细胞数/200 μl)和治疗组(第21天输注MSCsl×106细胞数/200 μl).另设健康对照组(不诱导CIA,第0天和第21天尾静脉输注生理盐水0.2 ml).疗效观察包括关节炎指数(AI)评分,关节病理分析,酶联免疫吸附试验(ELISA)测血清肿瘤坏死因子(TNF)-α,白细胞介素(IL)-1β水平,流式细胞术检测脾脏和淋巴结CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞百分率等.结果 ①预防组和治疗组AI、关节病理评分明显下降(P<0.05);②健康对照组、预防组和治疗组血清TNF-α和IL-1β水平降低(P<0.05),与AI呈显著正相关(P<0.05),TNF-α与关节病理评分呈显著正相关(r=0.61,P<0.01);③治疗组小鼠脾脏和淋巴结中调节性T细胞明显升高(P<0.05).结论 MSCs治疗CIA有效,抑制TNF-α和IL-1β和上调调节性T细胞可能是MSCs治疗CIA有效的机制.     

骨髓间充质干细胞关节腔注射治疗胶原诱导性关节炎的实验研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)关节腔注射治疗胶原诱导性关节炎(CIA)的疗效.方法 体外扩增原代间充质干细胞至P2代.大鼠胶原二次免疫后第7天,将等量0.9％氯化钠注射液及P2代细胞分别注射至CIA不同侧足踝关节处.2,4,8,12周后观测关节炎指数和足爪关节X线分析及指数评估;12周处死动物进行组织学观察.采用配对t检验进行统计学分析.结果 在不同观察时间点间充质干细胞治疗组与对照组的关节炎指数为:(第2周)3.18±0.62与3.84±0.35,(第4周)3.45±0.28与4.06±0.38,(第8周)3.86:±0.23与6.75±0.36,(第12周)4.23±0.43与7.86±0.66;X线放射学指数为:(第2周)2.04:±0.21与2.72:±.0.15,(第4周)2.52±0.47与4.06±0.38,(第8周)3.56±0.29与4.35±0.36,(第12周)3.73±0.43与4.86±0.62;组织学评分为:(第12周)2.34±0.22与3.52±0.55.结论 骨髓间充质干细胞关节腔注射治疗可以抑制CIA大鼠的病情发展,有望成为一种新的临床治疗手段.     

类风湿关节炎干细胞移植现状和展望

类风湿性关节炎(RA)是一种致残率很高的疾病，国外患病率为1％，发病5～10年后50％以上患者失去工作能力和寿命缩短。我国RA至少有400～500万患者，随着病情发展，可造成关节的破坏和致残。美国每例RA患者每年的平均治疗费用超过2．5万美元。早期诊断，联合慢作用药治疗，使部分患者的病情     

异基因骨髓间充质干细胞对类风湿关节炎患者主要细胞因子分泌的影响

目的 探讨在体外环境中,异基因骨髓间充质干细胞( Allo-BM-MSCs)对类风湿关节炎(RA)患者的白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α和转化生长因子(TGF)-β1分泌的影响。方法 采集健康供者的骨髓标本,经密度梯度离心分离、纯化获得其骨髓间充质干细胞(bMSCs),进行体外培养扩增。同时采集RA患者的外周血,分离单个核细胞。将来源于健康供者的bMSCs分别与来源于RA患者的单个核细胞和健康供者的单个核细胞在体外进行共培养,用酶联免疫吸附试验( ELISA)法检测bMSCs与淋巴细胞混合培养液中细胞因子IL-1、TNF-α和TGF-β1的变化。采用方差分析和相关性分析进行统计学分析。结果 经bMSCs与RA淋巴细胞共培养7d后,培养液中IL-1浓度(6.2±1.0) ng/L和TNF-α浓度(4.6± 1.2) ng/L低于单独RA组浓度(38.4±0.5)和(29.4±1.3) ng/L,差异均有统计学意义(P＜0.05);但是单独正常淋巴细胞和bMSCs与正常淋巴细胞共培养后,培养液中IL-1浓度(4.4±l.3)和(4.4±1.1) ng/L及TNF-α浓度(5.3±1.7)和(5.0±1.7) ng/L之间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）;经bMSCs与RA淋巴细胞共培养7d后,培养液中TGF-β1浓度(22.5±2.2) ng/L高于单独RA组(2.6± 1.0) ng/L,差异有统计学意义(P＜0.05);单独正常淋巴细胞和bMSCs与正常淋巴细胞共培养后,培养液中TGF-β1浓度(4.8±1.4)和(10.5±1.2) ng/L比较差异有统计学意义(P＜0.05)。IL-1与TNF-α呈正相关（r=0.896,P=0.000）,TGF-β1 与TNF-α呈负相关（r=-0.356,P=0.019）,TGF-β1与IL-1呈负相关（r=-0.380,P=0.000）。结论 AlloBM-MSCs在体外可以特异性调节RA患者细胞因子的分泌。bMSCs可能在RA发病和发展中起一定的作用,有希望用于RA治疗。     

异基因骨髓间充质干细胞对类风湿关节炎患者淋巴细胞的影响

目的 探讨在体外环境中,异基因骨髓间充质干细胞(BMSCs)对类风湿关节炎(RA)患者T、B淋巴细胞的增殖和功能成熟的影响.方法 采集健康供者的骨髓标本,经密度梯度离心分离、纯化获得其BMSCs,进行体外培养扩增.同时采集RA患者的外周血,分离单个核细胞.将来源于健康供者的BMSCs与来源于RA患者的单个核细胞在体外进行共培养,同时分别加入T淋巴细胞和B淋巴细胞刺激物.分别检测异基因BMSCs对RA患者T、B淋巴细胞增殖的影响;正常BMSCs对RA患者T淋巴细胞增殖周期和凋亡的影响;BMSCs对RA患者外周血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD25表达的影响;以及BMSCs对B细胞分泌IgG的影响.结果 正常骨髓来源的BMSCs对RA患者T、B淋巴细胞增殖均有抑制作用,并且这种抑制作用与BMSCs的剂量呈依赖性;与BMSCs共培养组的T细胞主要处于G0/G1期,而进入细胞增殖周期的细胞比例减少,同叶与BMSCs共培养组的凋亡比例(15.2±0.6)%明显低于单纯T细胞活化组(28.2±1.8)%;与BMSCs共培养后CD3+CD4+T细胞表达阳性率(34±6)较对照组(44±7)降低(P<0.05),CD25+的表达下降,但CD4+CD25+调节性T细胞数(4.9±2.3)增加(P<0.05).在SAC刺激下,健康人BMSCs与RA患者外周血淋巴细胞共培养后IgG分泌升高.结论 异基因BMSCs对RA患者T、B淋巴细胞的增殖和功能成熟均有影响,BMSCs可能在RA发病和病情进展中起一定的作用,同时证明利用MSCs来调节RA的免疫功能紊乱进行生物治疗是可行的.     

异基因脐带间充质干细胞移植治疗类风湿关节炎疗效及安全性

目的探讨异基因脐带间充质干细胞（uhcMSC）移植治疗难治性类风湿关节炎（RA）的疗效及安全性。方法从足月顺产供者脐带中分离培养MSC,给予3例RA患者行MSCs移植治疗,移植细胞数（1×106/kg体重）。评价患者移植前后的临床表现和实验室检查指标的改变。结果异基因MSC移植后,3例RA患者随访9～11个月,所有患者均无移植相关并发症。移植后1月疾病活动评分（DAS-28）由5.13降低为2.16（n=3）,1例血液系统受累患者血细胞（中性粒细胞、红细胞、血小板）均上升。移植前后比较抗环瓜氨酸（CCP）抗体滴度降低。1例患者移植前后比较Th17细胞明显升高,Treg细胞降低。结论异基因脐带MSC移植治疗难治性RA有效、安全。uhcMSC取材方便,扩增迅速,输注安全经济。     

类风湿关节炎骨髓间充质干细胞的体外培养和一般生物学特性的初步研究

目的 建立类风湿关节炎(RA)患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养、扩增方法,了解其一般生物学特性.方法 采集RA患者的骨髓标本,经密度梯度离心加贴壁法分离、纯化获得其BMSCs,进行体外培养扩增,观察原代和传代细胞的形态和生长状况、免疫表型分析及增殖能力检测,并对BMSCs进行成纤维细胞集落(CFU-F)形成分析.结果 来自RA患者的BMSCs呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定CIM5阴性,SH2(CD105)、CD71、CD44阳性,其增殖能力和CFU-F形成能力与源于正常供者的BMSCs相当.结论 RA患者骨髓中存在具有多向分化能力的MSCs,来源于RA患者的BMSCs在体外具有良好的细胞增殖能力,在细胞形态、集落形成能力以及细胞免疫表型方面与正常供者的BMSCs差异无统计学意义.     

异基因间充质干细胞移植治疗多发性肌炎/皮肌炎的临床研究

目的 探讨异基因间充质干细胞(MSC)移植治疗多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)的临床疗效及安全性.方法 8例难治性PM/皮肌炎患者经静脉输注异基因骨髓或脐带来源MSC,评价患者移植前后血清肌酸激酶(CK)、手工肌力评分(MMT8)等实验室及临床指标,采用配对t检验.结果 异基因MSC移植后随访6～12个月.5例患者移植后1周血清CK值由移植前(1681±430)U/L下降至(886±248)U/L(P＜0.05),移植后2周(474±61)U/L、1个月(293±89)U/L、3个月(202±70)和6个月(175±46)U/L继续下降,与移植前比,差异均有统计学意义(P＜0.05).2例患者在随访9个月时病情复发,血清CK上升.MMT8在移植后1个月67±3、3个月64±10、6个月64±4均显著上升,与移植前45±14比,差异有统计学意义(P＜0.05).所有患者移植后2周口服糖皮质激素(甲泼尼龙)用量较移植前显著减少[(18±6)mg与(34±15)mg,P＜0.05].2例以肺间质病变为主的患者,移植后临床症状缓解、肺部高分辨率CT显示间质性肺炎明显改善.1例以皮肤难治性溃疡为主的皮肌炎患者,移植后溃疡明显愈合.所有患者均无移植相关并发症.结论 异基因MSC移植治疗PM/皮肌炎安全有效,其长期疗效有待进一步观察.

Abstract：

Objective To explore the clinical efficacy of allogenic mesenchymal stem cells transplantation (MSCT) in patients with refractory polymyositis/dermatomyositis (PM/DM). Methods Bone marrow derived mesenchymal stem cells (BM-MSC) or umbilical cord derived mesenchymal stem cells (UC-MSC)were infused intravenously in 8 PM/DM patients. The clinical manifestations and laboratory parameters,including serum creatin in kinase (CK) and manual muscle test 8 (MMT8) score, were compared before and after MSCT. Staistically andlyzed by paired t-test. Results The eight patients were followed up for six to twelve months after MSCT. The level of serum CK decreased from (1681±430) to (886±248) U/L one week after MSCT (P＜0.05) and further decreased at week 2 (474±61) U/L, 1 month (293±89) U/L, 3 month (202±70) U/L and 6 month (175±46) U/L, respectively (all P＜0.05). MMT8 score increased to 1 month [(67±3) vs (45±14), P＜0.05], 3 month [(64±10) vs (45±14), P＜0.05], 6 month [(64±4) vs (45±14),P＜0.05] after MSCT. The dosage of glucocorticoid steroid were tapered in all patients 2 weeks after MSCT [(18±6) mg vs (34±15) mg, P＜0.05]. Clinical symptoms of interstitial pneumonia of both patients were relieved after MSCT, which was confirmed by the result of high resolution CT (HRCT) of the lung.The skin ulcers tended to be recovered after the transplantation in one DM patient. All patients did not develop transplantation related complications. Conclusion Allogenic MSCT is an effective and safe approach for the treatment of refractory PM/DM. However, extensive follow-up study is needed for long-term benefit evaluation.     

脐带间充质干细胞对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞基质金属蛋白酶的影响

目的探讨脐带间充质干细胞（UCMSCs）对 RA 滑膜成纤维细胞（FLSs）分泌 MMPs 的影响。方法 Wistar 大鼠制作胶原诱导关节炎（CIA）模型,第17天尾静脉输注1×106 UCMSCs,第42天处死大鼠后收集滑膜组织提取 RNA,实时荧光定量 PCR 检测滑膜组织 MMP-1、MMP-3、MMP-13的表达水平。取行膝关节置换术的 RA 和 OA 患者滑膜组织,分离培养 FLSs,比较 RA 与 OA FLSs 的 MMP-1、MMP-3和 MMP-13的表达水平。将 RA FLSs 与 UCMSCs 用 Transwell 小室共培养72 h,配对 t 检验比较共培养前后 FLSs 的 MMPs 表达水平变化及上清中 MMPs 含量,并检测 UCMSCs 在共培养过程中分泌的可溶性细胞因子水平。向培养体系中加入可溶性细胞因子的抑制剂后观察 FLSs 表达 MMPs 水平变化。2组间比较采用 t 检验,而3组及以上之间比较采用单因素方差分析。结果 CIA 大鼠滑膜组织较正常鼠高表达 MMP-1（6.9±5.4,1.3±1.4,P<0.05）、MMP-3（6.0±6.5,1.4±1.0,P<0.05）和 MMP-13（21.8±20.8,1.5±1.6, P<0.05）,UCMSCs 治疗后与未治疗组及成纤维细胞治疗组比较,滑膜组织 MMP-1（1.3±1.4,6.9±5.4,8.7±6.8,P<0.05）、MMP-3（1.4±1.5,6.0±6.5,6.0±5.7,P<0.05）和 MMP-13（3.0±3.2,22±21,22±26,P<0.05）均表达下调。 RA 患者 FLSs MMP-1（1.8±0.9,0.9±0.7,t=2.44,P<0.05）、MMP-3（2.6±1.7,1.1±1.0,t=2.25,P<0.05）和MMP-13（2.4±2.3,0.6±0.7,t=2.37,P<0.05）水平明显高于 OA 患者。经 UCMSCs 体外共培养后,MMP-13（1.3±1.2,0.9±1.2,t=3.63,P<0.05）水平下调,而 MMP-1（1.5±1.4,6.6±6.0,t=3.90,P<0.05）、MMP-3（7±17,22±35,t=2.86,P<0.05）上调。共培养后 UCMSCs 表达 IDO、肝细胞生长因子（HGF）和 IL-10等可溶性细胞因子水平明显增多。加入 IL-10抗体后 UCMSCs 抑制 MMP-13的能力减弱。结论 UCMSCs 通过分泌可溶性细胞因子 IL-10抑制 RA 滑膜组织 MMPs 分泌,从而改善关节炎病情。     

异体间充质干细胞移植治疗酮症起病1型糖尿病的临床疗效

目的：初步观察异体间充质干细胞（MSCs）移植对以酮症起病的初发1型糖尿病（T1DM）的疗效并探讨移植时病程对疗效的影响。方法筛选2009年1月至2012年1月于南京大学医学院附属鼓楼医院内分泌科就诊的以酮症起病的初发T1DM患者10例进行异体MSCs移植,其中4例行骨髓MSCs移植,6例行脐带MSCs移植。纵向观察患者胰岛素用量、糖化血红蛋白（HbA1c）、C肽的变化。按移植时病程不同将移植患者分为病程≤1个月组（4例）和病程>1个月组（6例）并作进一步分析。采用方差分析比较移植后不同周期各指标的变化,分层及协方差分析比较移植时病程对移植疗效的影响,生存分析比较胰岛功能衰竭速度。结果与移植前比较,移植后不同周期时10例T1DM患者平均胰岛素用量及HbA1c水平不同程度地降低,其中HbA1c于6、12个月时降低显著（7.2%±2.1%、7.2%±1.7%比10.3%±3.5%,F=4.435,P<0.05）;空腹C肽（FC?P）及餐后2 h C肽（2h C?P）较移植前无明显变化;移植后不同周期时,病程≤1个月组患者胰岛素用量的减少（6、12个月时）及2 h C?P的增加（6个月时）均显著高于病程>1个月组患者[（-0.40±0.64）比（0.08±0.23）U·kg?1·d?1、（-0.50±0.46）比（0.08±0.17）U·kg?1·d?1和（191±258）比（-244±276）pmol/L,F=7.94、16.21、8.69,均P<0.05];移植后各周期时,病程≤1个月组患者胰岛功能衰竭速度低于病程>1个月组患者（χ2=3.74,P=0.05）。结论异体MSCs移植能够改善酮症起病初发T1DM患者的糖代谢水平,减少胰岛素用量;移植时的病程可能是移植疗效的重要影响因素。     

骨髓间充质干细胞移植对心力衰竭大鼠心功能的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对心衰大鼠心功能的影响及其机制。方法腹腔注射阿霉素（2mg／kg,每周1次,连续6周）至近交系F344大鼠体内,建立心衰大鼠模型。存活大鼠（32只）随机分为2组：心衰组（16只）和细胞移植组（16只）。分离纯化大鼠MSCs进行体外培养,予4,6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）进行标记;经股静脉注射MSCs或DMEM至心衰大鼠体内。细胞移植后4周,应用多导生理记录仪测量大鼠心功能;通过免疫组织荧光及化学染色,观察移植细胞存活情况,并计算血管数量;通过天狼猩红染色计算心肌胶原容积分数（CVF）和血管周围胶原面积（PVCA）。结果移植后4周,细胞移植组大鼠心肌组织见到DAPI标记的移植细胞存活,并表达心肌特异性抗原心肌肌球蛋白重链（β—MHC）。与心衰组相比,细胞移植组最大左室收缩末压（LVSP）、左室内压最大（最小）变化速率（LV＋dp／dtmax）均明显升高（P〈0．05）,而左室舒张末压（LVDP）明显下降（P〈0．05）;细胞移植组左室血管数量明显高于心衰组[（11．83±1．40）个比（7．78±1．39）个,P〈O．05],细胞移植组左心室内膜CVF及PVCA明显低于心衰组（4．53±1．98比7．79±1．99,10．91±2．31比14．17±2．49,P〈0．05）。结论MSCs移植可改善心衰大鼠心功能,其机制可能与MSCs归巢至心脏,分化为心肌样细胞,并且促进血管新生、抑制心肌纤维化有关。