巨噬细胞移动抑制因子与大肠癌肝转移的关系

目的检测巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）在大肠癌组织、大肠癌肝转移灶中的表达以及大肠癌患者血清中的水平,初步分析MIF与大肠癌肝转移的关系。方法应用免疫组化技术,检测49例大肠癌组织及其癌旁相对正常肠组织,与10例大肠癌肝转移组织及转移灶旁相对正常肝组织,以及5例正常肝组织中MIF的表达。应用ELISA法测定30例大肠癌患者和17例健康志愿者血清MIF水平。采用Logistic回归分析大肠癌肝转移与各种临床病理因素、血清MIF水平的关系。结果（1）大肠癌组织中MIF的表达有肝转移者高于没有肝转移者,大肠癌患者有肝转移者血清MIF水平也高于无肝转移者。（2）肝内大肠癌转移组织中MIF表达阳性。（3）大肠癌肝转移灶旁相对正常肝组织与正常肝组织MIF表达阴性。（4）Logistic回归分析结果显示,大肠癌患者血清MIF水平是影响大肠癌肝转移的独立危险因素（OR=1.245,OR的95%CI为1.017～1.524,P=0.034）。结论MIF在大肠癌肝转移中可能发挥着重要的作用。     

巨噬细胞移动抑制因子与泌尿系统疾病

巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种多功能细胞因子,因与多种炎症性疾病及肿瘤等密切相关而倍受关注.本文就MIF结构特点、来源,生物学特征、与多种泌尿系统疾病(如肾炎、前列腺癌、膀胱癌)的研究现状以及临床应用前景作一综述.     

巨噬细胞移动抑制因子小干扰RNA对肝癌细胞表达血管内皮生长因子的抑制效应

目的 观察巨噬细胞移动抑制因子(MIF)小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法 Western blot检测MIF和VEGF在肝癌和癌旁组织的表达情况;人工化学合成MIF siRNA和对照siRNA,将其转染PLC、HepG2肝癌细胞株,定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测MIF和VEGF mRNA及其蛋白的表达.结果 MIF、VEGF mRNA和蛋白在肝癌组织中高表达.MIF siRNA(50、100 nmol/L)转染肝癌细胞株后,PLC细胞MIF和VEGFmRNA水平分别下调(78.8±7.2)%、(90.4±2.9)%和(60.6±2.6)%、(79.8±1.2)%;HepG2细胞MIF和VEGF mRNA水平分别下调(74.3±8.9)%、(88.4±4.6)%和(65.6±4.6)%、(80.7 ±2.2)%.MIF蛋白分别下调(57.3±3.4)%、(78.7±1.2)%和(54.8±6.8)%、(77.9±2.3)%,并呈剂量依赖关系;伴随MIF mRNA和蛋白的表达下调VEGF蛋白分别下调(52.6±12.9)%、(87.4±2.3)%和(52.4±11.1)%、(68.5±2.8)%,亦呈剂量依赖关系,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),两干预组间的差异也有统计学意义(P<0.05).结论 MIF siRNA能特异性阻断PLC及HepG2细胞MIF mRNA和MIF蛋白的表达,并且同时有效下调VEGF mRNA及其蛋白的表达,MIF可能通过调控VEGF基因和蛋白的表达,参与肿瘤血管的生成和促进肿瘤细胞的转移.     

RNA干扰抑制胰腺癌细胞XIAP表达对化疗敏感性的影响

目的 ：探讨运用载体介导的RNA干扰技术对X-连锁的凋亡抑制蛋白的抑制效率，以及观察抑制XIAP后胰腺癌细胞对化疗药物敏感性的变化。方法 ：应用PBSHHI质粒构建针对XIAP的RNA干扰载体，转染胰腺癌细胞系SW1990;用RT-PCR和Western blot检测XIAP的抑制效率，以gemcitabine处理细胞，流式细胞仪和荧光显微镜观察细胞凋亡的变化;分析XIAP的表达与细胞凋亡之间的关系。结果 ：成功构建4个XIAP的RNA干扰载体，其中2个载体对XIAP的瞬时抑制效率达50％以上。XIAP被抑制后，细胞对化疗药物诱导的凋亡敏感性增强 ( P <0.05),XIAP的表达水平与细胞的凋亡指数之间呈负相关性( r =-0.809, P <0.05)。结论 ：运用针对XIAP的RNA干扰载体可以有效地抑制XIAP的表达，提高胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性。     

靶向丝氨酸/苏氨酸激酶15基因小片段干扰RNA抑制胃癌细胞生长的实验研究

目的观察丝氨酸／苏氨酸激酶15基因(serine／threonine kinase15,STK15)沉默后对胃癌细胞系MKN45体内外生长的抑制作用,探讨STK15基因作为胃癌靶点治疗的可行性。方法应用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)抑制STK15基因的表达;Western blot检测STK15蛋白质的表达变化;体外侵袭实验检测MKN45细胞侵袭能力的变化;MTT法检测MKN45细胞增殖速度的变化。将裸鼠随机分成2组,每组10只,皮下移植经STK15siRNA处理的MKN45细胞,观察其成瘤性的改变。结果 MKN45细胞经STK15 siRNA作用后,蛋白表达水平均明显降低;STK15-组与对照组比较体外侵袭能力明显下降[平均4值为(182±27)比(308±38),P<0．05];更多的MKN45 细胞聚集于G2／M期附近[G2期DNA含量细胞为(30±5)％比(14±3)％,P<0．05];增殖速度明显减缓(P<0．05);在裸鼠体内成瘤性明显减低[平均肿瘤重量为(0．15±0．07)g比(0．29±0．16)g, P<0．05]。结论靶向STK15的siRNA可在体内外抑制胃癌MKN45细胞的增殖,STK15有可能成为胃癌治疗的靶点。     

一氧化氮在巨噬细胞移动抑制因子抑制大鼠糖皮质激素受体活性中的作用

目的 探讨一氧化氮(NO)在巨噬细胞移动抑制因子(MIF)抑制大鼠糖皮质激素受体活性中的作用.方法 实验Ⅰ原代培养新生SD大鼠肝细胞,随机分为3组(n=48):对照组(C组)、重组鼠MIF组(rMIF组)及rMIF+一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)组,分别于1640培养液、含rMIF20 ng/ml的1640培养液、含rMIF 20ng/ml及L-NAME 100 μmol/L的1640培养液中孵育3 h,随后采用配体结合实验计算大鼠肝细胞糖皮质激素受体的平衡解离常数(Kd),糖皮质激素受体活性与Kd值呈反比.实验Ⅱ健康成年雄性SD大鼠32只,250～300 g,随机分为4组(n=8),对照组(C组)经右侧股静脉注射生理盐水1 ml;rMIF低剂量组(rMIF-L组)、rMIF中剂量组(rMIF-M组)及rMIF高剂量组(rMIF-H组)分别经右侧股静脉注射rMIF 50、100、200 ng(用生理盐水稀释至1 ml).于给药前即刻(T_0)、给药后5min(T_1)、3 h(T_2)、6 h(T_3)、12 h(T_4)及24 h(T_5)时测定血清NO_2~-/NO_3~-水平.结果 实验Ⅰ与C组比较,rMIF组和rMIF+L-NAME组Kd值增大(P＜0.05);rMIF组和rMIF+L-NAME组Kd值比较差异无统计学意义(P＞0.05).实验Ⅱ T_0～5时4组大鼠血清NO_2~-/NO_3~-水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 MIF抑制大鼠肝细胞糖皮质激素受体活性的机制与NO无关.     

RNA干扰转录因子激活蛋白4基因表达对结肠癌细胞株SW480的影响

目的观察转录因子激活蛋白4（AP-4）基因对结肠癌细胞株SW480生物学行为的影响。方法设计合成针对AP-4基因外显子7的小分子干扰RNA（siRNA）表达质粒,用脂质体转染SW480细胞,通过RT-PCR技术、Western印迹、四甲基偶氮唑盐实验（MTT法）、流式细胞仪和Transwell体外侵袭实验等检测该siRNA对SW480细胞基因表达、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡能力和浸润转移能力等生物学行为的影响。结果AP-4siRNA转染SW480细胞96h后,其AP-4mRNA水平下降了58%,培养液上清AP-4蛋白浓度下降了75%（P〈0.01）。细胞增殖受到明显抑制,抑制率达61%～78%;流式细胞仪检测结果显示,AP-4siRNA组SW480细胞凋亡率为（21.70±2.51）%,显著高于阴性对照组的（2.31±0.14）%（P〈0.01）,G0-G1期细胞比例增加（P〈0.01）,G2-M期细胞减少（P〈0.05）;Transwell体外侵袭实验显示,AP-4siRNA能明显抑制SW480细胞的体外侵袭力（P〈0.01）。结论应用siRNA技术沉默AP-4基因能有效抑制SW-480细胞AP-4的表达,进而抑制细胞的生长、增殖及诱导细胞的凋亡,为以AP-4为靶向的结肠癌基因治疗提供了新的思路和手段。     

RNA干扰靶向抑制胃癌细胞血管内皮生长因子C表达的实验研究

目的 构建针对血管内皮生长因子C（VEGF-C）的RNA干扰质粒表达载体pSIH1-H1-copGFP,并评价其转染胃癌细胞后对VEGF-C表达的抑制作用.方法 设计并合成针对VEGF-C基因mRNA序列的3条短发夹RNA及1条阴性对照序列,克隆到pSIH1-H1-copGFP载体,重组构建RNA干扰质粒,并将其转染胃癌细胞（SGC7901）,采用RT-PCR分析转染后VEGF-C基因的表达情况.结果 重组构建pSIH1-H1-copGFP载体经双酶切及插入片断序列分析,表明其成功插入设计位点,并且序列完全一致.3种siRNA质粒表达载体的转染效率均为60%～70%,对VEGF-C mRNA表达的抑制率分别为35.4%、33.8%和81.5%.结论 RNA干扰质粒表达载体介导对VEGF-C基因的RNA干扰可明显抑制胃癌细胞中VEGF-C的表达,可能成为抑制胃癌淋巴管生成的一种有效手段.     

RNA干扰对肝癌细胞巨噬细胞移动抑制因子基因表达的抑制作用

目的 观察特异性小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因表达的抑制作用.方法 脂质体方法将siRNA转染肝癌细胞PLC、Hep3B.定量RT-PCR、Western blot检测MIF mRNA和蛋白、MAPK信号分子的表达.噻唑蓝(MTY)比色法、体外细胞侵袭实验检测细胞增殖和对重组基底膜(matrigel)穿透能力.结果 100 nmol/L的MIF siRNA使MIF mR-NA表达下调81.3%和89.1%,蛋白水平降低69.50%、72.31%,与对照组比较其差异有统计学意义(P均＜0.01).细胞增殖率下降16.79%和47.14%(P均＜0.05).穿透matrigel的细胞数为51.00±11.27和18.56±4.72,与对照组比较差异有统计学意义(P均＜0.05).磷酸化MAPK下调.结论 MIF siRNA有效抑制MIF表达及肝癌细胞增殖和迁移,可能部分通过抑制MAPK磷酸化起作用.     

巨噬细胞移动抑制因子在大鼠急性坏死性胰腺炎模型中的作用研究

目的初步探讨巨噬细胞移动抑制因子（MIF）在大鼠急性坏死性胰腺炎（ANP）发病中的作用。方法健康雄性SD大鼠60只,随机分成三组,分别为对照组（腹腔注射生理盐水）、ANP组（腹腔注射左旋精氨酸）和干预组（腹腔注射左旋精氨酸＋单克隆抗MIF抗体）,每组20只。采用左旋精氨酸改良方法建立ANP模型,分别于3、6、12、24h四个不同时点处死5只大鼠,剖腹后从肠系膜上静脉取血,ELISA法测定血清MIF、TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8水平 碘比法测定血淀粉酶 切取胰腺组织依据Kusske标准行胰腺病理学评分 Western blot法测定胰腺组织NF-κBp65蛋白的表达。结果ANP组血淀粉酶及胰腺组织病理学评分各时点㈦对照组相比均显著升高,干预组㈦ANP组相比均显著降低（P〈0.01） 胰腺组织NF-κBp65蛋白的表达于造模后3h开始呈持续性上调,与对照组相比其表达显著增多,在干预组其表达水平㈦ANP组相比明显下调（P〈0.01） 血清MIF、TNF-α、IL-1、IL-6各时点在ANP组与正常对照组相比其水平均有明显升高,在干预组其水平㈦ANP组相比显著降低（P〈0.05） 血清IL-8在6、12、24h不同时点水平变化同上述因子,但在3h时点其水平无明显升高 MIF、胰腺组织病理学评分及胰腺组织NF-κBp65蛋白的表达,两两之间均成正相关（P〈0.05）。结论腹腔注射左旋精氨酸建立ANP的模型是稳定的 MIF可能通过调控核因子NF-κB的途径影响血清TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8水平而在大鼠急性胰腺炎发病过程中起一定的作用。     

靶向突变K-ras基因的小干扰RNA体内外抑制肺癌细胞生长的研究

目的探讨应用小于扰RNA（siRNA）敲除突变K-ms基因对肺癌细胞H441体内外生长的抑制作用。方法构建真核表达载体pSilencer3．1-K-ras^v12,转染H441细胞后应用半定量RT-PCR及Westernblotting检测突变K-l＇as基因mRNA及蛋白质的表达变化,噻唑蓝法检测H441细胞增殖速度的变化,流式细胞仪检测H441细胞凋亡率的变化。裸鼠皮下移植pSilencer3．1-K-ras^v12。处理的H441细胞,观察其成瘤性的改变。结果测序证实pSilencer3．1-K-ras^v12。真核表达载体构建成功。RT-PCR灰度比值结果示空载体组、阴性对照组、实验组K-rasmRNA相对表达量分别为：93．7％±2．2％、95．1％±2．5％、43．6％±3．1％,差异有统计学意义（F=78,P〈0．01）;Westernblotting结果示空载体组、阴性对照组、实验组K-ms蛋白相对表达量分别为：98．1％±2．4％、97．5％±2．0％、33．5％±3．7％,差异有统计学意义（F=93,P〈0．01）;经pSilencer3．1-K-ras^v12。作用的H441细胞生长受到明显抑制（P〈0．05）,凋亡率较对照组明显升高（F=8．9,P〈0．01）,H441细胞在裸鼠体内生长受到明显抑制。结论靶向突变K-ras基因的siRNA可以抑制肺癌H441细胞在体内外的生长速度,诱导细胞凋亡,为肺癌的基因治疗提供了新的思路和方法。     

不同途径裸鼠大肠癌肝转移模型的比较

目的建立并比较四种不同途径的裸鼠大肠癌肝转移模型,从而根据不同需要选择较为理想的裸鼠模型。方法 BALB/c(nu/nu)裸鼠共80只随机分为4组(每组20只),分别经脾脏背膜下、肝脏背膜下、盲肠浆膜下、门静脉注射5×10~6个HCT116细胞建立大肠癌肝转移模型,观察并记录各组小鼠生存状态,小鼠死亡后进行剖腹探查观察腹腔内肿瘤生长、肝脏转移情况,对肿瘤组织进行常规病理组织学观察。结果脾脏被膜下注射组、肝被膜下注射组、盲肠浆膜下注射组注射位置均成功成瘤;肝转移率:脾被膜下注射组为94.7%,盲肠浆膜下注射组为44.4%,门静脉注射组为66.7%;各模型的原发肿瘤及转移瘤均为典型的低分化腺癌。肝被膜下注射组肿瘤进展迅速,门静脉注射组围手术期死亡率高,盲肠浆膜下注射组生存时间较长。结论四种模型具有各自的优势和缺点,应根据实验需要来选择恰当的动物模型。     

电穿孔法介导雄激素受体基因沉默抑制裸鼠膀胱癌移植瘤生长的研究

目的 观察电穿孔法转染靶向雄激素受体(AR)的小干扰RNA(siRNA)对裸鼠人膀胱癌移植瘤生长的影响.方法 建立人膀胱癌细胞124的荷瘤裸鼠模型,于肿瘤直径0.5 cm大小时,瘤体接受AR-siRNA的电转染治疗,转染无效序列siRNA为阴性对照组,瘤体未受电穿击为空白对照组.观察裸鼠肿瘤生长;4周后处死,绘制肿瘤生长曲线;肿瘤组织石蜡包埋,常规切片,TUNEL法检测移植瘤凋亡.结果 电转染AR-siRNA后瘤体组织AR基因的表达显著被抑制,也能明显抑制裸鼠移植瘤的生长;TUNEL检测凋亡率为(13.1±6.9)%,显著高于阴性对照组(P＜0.01).结论 电穿孔法靶向AR的siRNA可有效阻断种植瘤内AR表达,阻断雄激素受体途经信号传导,进而诱导细胞凋亡,能明显抑制人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的生长.

Abstract：

Objective To investigate the antitumor efficacy of small interfering RNA (siRNA)mediated inhibition of androgen receptor (AR) gene expression in T24 bladder tumor xenografts using electroporation. Methods Athymic mouse human bladder cancer transplantation tumor model was established by injecting T24 cells subcutaneously. When tumor diameter was exceeded 0. 5 cm, AR-siRNA was deliered into tumor xenografts by electroporation. The cells with nonspecific siRNA delivery and un-treatment served as control groups. Tumor volumes were measured weekly. The animals were sacrificed after the treatments, and the histological changes of xenografts were observed by Hematoxylin and Eosin ( HE) staining and TUNEL assay. Results The athymic mouse exnograft tumor model was established successfully.After AR-siRNA treatment, tumor growth was inhibited as compared with the controls. The number of TUNEL-positive cells was significantly increased in AR-siRNA group as compared with the nonspecific siRNA group ( P ＜ 0. 01). Conclusion siRNA targeting AR gene could inhibit obviously the growth of athymic mouse human T24 bladder carcinoma transplantation tumor by inducing apoptosis.     

siRNA干扰沉默GS基因抑制胃癌细胞生长的研究

目的：利用RNA干扰技术,研究靶向Glutamine Synthetase（GS）基因的小干扰RNA（siRNA）在体外对胃癌细胞生长的影响,探索胃癌基因治疗并了解GS在胃癌发生、发展中的作用。方法：合成GSsiRNA,并用脂质体法将GSsiRNA转至胃癌BGC-823细胞中;采用实时定量PCR和Western印迹法观察GSsiRNA转染前后胃癌细胞GS基因及相应蛋白表达的变化;用CCK8、流式细胞检测技术分别检测胃癌细胞增殖及凋亡的变化。结果：转染GSsiRNA后的胃癌细胞BGC-823与对照组相比,生长明显变缓（P〈0.05）,细胞凋亡率明显增高（P〈0.05）。结论：靶向GSsiRNA可明显下调靶基因GS的表达,在体外可抑制胃癌BGC-823细胞的生长并促进其凋亡。     

SiRNA干扰LI-cadherin对荷人肝癌裸鼠移植瘤的影响

目的 研究肝肠粘连蛋白(liver intestine cadherin,LI-cadherin)在荷瘤裸鼠体内对肝癌细胞Hep3B侵袭转移能力的作用.方法 体外培养肝癌细胞株Hep3B,并进行针对LI-cadherin的SiRNA转染.将Hep3B细胞及转染后的肿瘤细胞接种入裸鼠脾脏,建立裸鼠荷瘤模型.观察成瘤及转移效果,免疫组化检测转移灶组织结构,Western blot方法检测转染前后荷瘤裸鼠体内肿瘤转移灶中LI-cadherin的表达.结果 (1)SiRNA质粒转染入Hep3B肝癌细胞,转染率达到80％.(2)建立裸鼠荷人肝癌模型,30只裸鼠移植手术后均成活,荷瘤率达到60％以上.SiRNA转染组荷瘤率为80％,转移灶个数为26个,明显高于空白对照组和空质粒转染组.(3)裸鼠体内转移灶中Ll-cadherin 的含量SiRNA转染组明显低于空白对照组和空质粒转染组.结论 LI-cadherin对肝癌细胞的黏附能力有重要作用,对LI-cadherin进行SiRNA干扰可增强肝细胞癌在裸鼠体内的侵袭转移能力.     

小干扰RNA抑制雄激素受体基因表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制雄激素受体(AR)基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响.方法 化学合成针对AR的siRNA,用脂质体转染T24细胞.采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测AR mRNA和蛋白的变化.转染细胞48 h后用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖活性的变化,流式细胞术检测细胞的凋亡状况.结果 成功的转染T24细胞,实时荧光定量RT-PCR筛选出一条AR mRNA抑制效率最高的siRNA,行Western blot检测可抑制AR蛋白表达至70.3%.转染细胞48 h后,T24细胞增殖活性抑制率达到(25.9±5.4)%,细胞凋亡率达到21.61%.结论 应用siRNA干扰技术能有效的抑制AR基因的表达,同时可抑制人膀胱癌T24细胞的体外增殖活性及促进其凋亡的发生.     

靶向保罗样激酶的小干扰RNA体内外抑制胃癌细胞生长的研究

目的 观察敲除保罗样激酶（plk）1基因对胃癌细胞MKN45体内外生长的抑制作用,探讨plk1基因作为胃癌基因治疗靶点的可行性及有效性。方法 应用RNA干扰技术（RNAi）抑制MKN45细胞plk1基因的表达,实时定量PCR（real—timequantitative PCR）及蛋白印迹（western blotting）检测plk1 mRNA及蛋白质的表达变化,流式细胞仪检测MKN45细胞周期分布及凋亡率的变化,噻唑蓝（MTT）法检测MKN45细胞增殖速度的变化。裸鼠皮下移植plk1小干扰RNA（siRNA）处理的MKN45细胞,观察其成瘤性的改变。western blotting检测成瘤标本的plk1蛋白质的变化。结果 MKN45细胞经plk1 siRNA作用后,plk1 mRNA及蛋白质水平在一定时间内均明显降低,更多的MKN45细胞聚集于G2／M期附近（P〈0．05）;经plk1 siRNA作用的MKN45细胞在48及72h凋亡率高于对照组（P〈0．05）;生长速度亦明显缓于对照组（P〈0．05）;在裸鼠体内成瘤性明显减低（P〈0．05）;但各组体内成瘤标本的plk1蛋白表达无明显改变。结论 靶向plk1的siRNA可以抑制胃癌MKN45细胞在体内外的生长速度,plk1有可能成为新的胃癌治疗靶点。     

小分子干扰RNA诱导HTB-94软骨肉瘤细胞凋亡的研究

目的 利用小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒转染HTB-94软骨肉瘤细胞,观察其在人体软骨肉瘤细胞HTB-94中对肿瘤细胞生长的影响.方法 设计并合成高泳动家族性别决定基因9(Sox9)siRNA,将其转染HTB-94肿瘤细胞,观察肿瘤细胞的Sox9基因的mRNA和蛋白表达、生长曲线和细胞凋亡情况.结果 Sox9 siRNA的插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致,Sox9基因的mRNA和蛋白表达降低,HTB-94肿瘤细胞的生长繁殖受到抑制,细胞凋亡增加.结论 Sox9 siRNA表达质粒可以通过稳定转染HTB-94肿瘤细胞,抑制Sox9基因的mRNA和蛋白的表达,抑制肿瘤细胞的生长繁殖,同时使肿瘤细胞凋亡.