蛋白质组学技术分析眼优势柱可塑性相关蛋白

目的利用二维电泳-质谱(2-DE/MS)技术分析Long Evans大鼠初级视皮层中与眼优势柱可塑性相关的蛋白质。方法取22d龄Long Evans大鼠通过向其初级视皮层中灌注放线菌酮建立幼年眼优势柱不移动的动物模型,然后分别提取22d龄大鼠、100d龄大鼠和22d龄放线菌酮灌注大鼠的初级视皮层灰质总蛋白,利用2-DE/MS技术分析与眼优势柱可塑性相关的蛋白质。结果通过2-DE/MS技术鉴定了与眼优势柱终止相关的5种蛋白质,这5种蛋白质与蛋白质的更新相关,分别为proteasome protein p45/sug、Malate dehydrogenase、Proteasome alpha1subunits、adolase A和septin4。结论二维电泳-质谱(2-DE/MS)技术可以有效地分离和鉴定视皮层中的特殊蛋白质。随着蛋白质组学技术的进步和完善,必将在视觉可塑性研究中占有重要地位。     

成年与幼年Long Evans大鼠视皮层蛋白的二维电泳分析

目的 利用双向电泳技术比较正常成、幼年Long Evans大鼠初级视皮层蛋白质组表达差异，探索蛋白质组学技术在视觉发育研究中应用的可能性。方法 22d龄和100d龄Long Evans大鼠各3只，过量戊巴比妥钠处死，切取其初级视皮层的灰质，裂解抽提总蛋白，双向电泳分离总蛋白，比较2组大鼠初级视皮层蛋白质表达差异。结果 胶图差异分析发现幼年鼠初级视皮层中有12个蛋白质点表达较丰富，成年鼠初级视皮层中有16个蛋白质点表达较丰富。结论 正常成、幼年Long Evans大鼠初级视皮层蛋白质组存在明显差异，蛋白质组学技术可以应用于视觉发育方面的研究。     

避光对生长发育期大鼠视觉及视皮层蛋白质组学的影响

背景以往对视皮层发育关键期的研究仅根据已有的神经信号表达系统,就某一种可能是视皮层发育的关键蛋白质进行实验验证,进行视皮层全蛋白质分析对于了解动物进而研究人类视觉发育的可塑性具有重要意义。目的了解避光环境对生长发育期大鼠视觉及视皮层蛋白质组学的影响。方法将2只同日分娩12只仔鼠的SD母鼠分别饲养在2个鼠笼中,分娩日将2个母鼠的仔鼠一半进行对换,对换的仔鼠剪耳进行区分,即时起一个鼠笼的大鼠在避光处饲养,一个鼠笼的大鼠在自然光照下饲养作为对照。避光饲养的大鼠在完全避光环境下更换食物、水和垫料,至仔鼠40日龄时测定两组仔鼠对近眼物体瞬目的次数。各组分别处死3只大鼠,分离双侧初级视皮层（枕叶）,利用二维电泳和质谱分析的方法,检测仔鼠避光环境与自然光照环境下发育和生长的初级视皮层蛋白质组学的差异,经Swissprot与NCBI数据库比对,鉴定差异蛋白。然后将避光饲养的剩余9只大鼠恢复自然光照10d至大鼠50日龄,作为避光40d恢复光照10d组比较与同日龄自然光照组9只大鼠对近眼物体瞬目次数的差异。结果大鼠40日龄时,避光饲养组大鼠对近眼物体的瞬目次数为（0．33±0．35）次,明显少于自然光照组大鼠的（6．42±O．68）次,差异有统计学意义（t=24．38,P〈0．01）;大鼠50日龄时,自然光照组大鼠对近眼物体的瞬目次数为（6．11±0．59）次,避光饲养组大鼠多于避光40d后恢复至（5．00＋1．22）次,但差异无统计学意义（t=2．09,P〉0．05）。二维电泳和质谱分析显示,自然光照组仔鼠与避光40d组大鼠初级视皮层的差异蛋白共36种,避光40d组大鼠缺失26种,增加10种,其中经质谱分析和数据库比对3种为已知蛋白,分别是Eps15同源结构域蛋白3（EHD,）、α-微管蛋白1A链和2’,3’-3’一环核苷酸磷酸二酯酶。结论生长发育期避光环境中饲养可造成大鼠可逆的视觉障碍,并使其初级视皮层蛋白质组学发生变化。     

tPA参与眼优势柱可塑性的研究进展

哺乳动物的初级视皮层神经元具有眼优势，左、右眼优势的双眼细胞是按垂直于皮层表面的柱状交替排列的，即形成眼优势柱。在可塑性关键期内，初级视皮层对视觉输入的变化非常敏感，单眼剥夺将导致眼优势柱由被剥夺眼向开放眼移动。在此之前，双眼视觉输入的差异已经作为始动因素干扰兴奋-抑制平衡，产生一系列与可塑性相关的中介性信使物质，共同作用于组织型纤溶酶原激活剂，增强其蛋白水解效应，为视皮层的结构重组创造有利环境，从而在树突棘水平上．将快速的功能变化和经验依赖性神经环路的重构联系起来。     

Long Evans大鼠视觉可塑性关键期终止前后视皮层tPA表达及活性的研究

目的研究Long Evans大鼠出生后视皮层组织型纤溶酶原激活剂（tPA）分布、表达、活性的变化及与视皮层可塑性关键期终止的关系。方法Long Evans大鼠131只按出生后周龄分为1、3、5、7、14周共5组，免疫荧光组织化学法定位检测tPA的分布，免疫印迹定量法检测视皮层总蛋白中tPA的表达，发色底物酶活性分析法测定视皮层tPA的活性。结果除1周组外，各组视皮层Ⅱ-Ⅲ层、Ⅳ层tPA免疫荧光呈阳性，主要分布在Ⅱ-Ⅲ层（P〈0．01）。Ⅱ-Ⅲ层以5周组tPA阳性细胞密度最高（P〈0．01），14周组最低（P〈0．01）；Ⅳ层以3周组tPA阳性细胞密度最高，14周组最低（P〈0．01）。除1周组外，各组视皮层总蛋白中tPA均有表达，5周组最高（P〈0．05），14周组最低（P〈0．05）。视皮层tPA活性3周组最低（P〈0．01），5周组最高（P〈0．01）。结论tPA参与视皮层可塑性关键期的“终止”，可能是Ⅱ-Ⅲ层、Ⅳ层之间突触可塑性存在异质性的结构基础之一。     

图形视觉诱发电位记录双眼形觉剥夺成年大鼠视皮层可塑性的研究

背景视觉诱发电位（VEP）是记录大鼠成年后视皮层可塑性变化的主要功能性评价指标,单眼形觉剥夺（MD）模型是研究哺乳动物视皮层可塑性存在与否的经典模型,应用上述技术研究成年大鼠模型眼优势移动情况对研究弱视眼的治疗时机有重要的意义。目的应用图形视觉诱发电位（PVEP）的方法评估各周龄正常大鼠和双眼形觉剥夺成年大鼠视皮层可塑性的变化。方法健康SPF级Long—Evens大鼠按其出生后周龄分为3、4、5、6、7周组,3、4、5、6周组每组9只,7周组36只。各周龄大鼠左眼分别遮盖3、5、7d,分别于上述时间点记录大鼠左眼、右眼PVEPP。波振幅,观察左右眼遮盖前后P100波振幅变化,评价眼优势移动情况,确定大鼠视皮层可塑性结束的周龄。7周龄SPF级Long—Evens大鼠行双眼PVEP检测,利用眼睑缝合法分别行双眼形觉剥夺7、10、14d,然后打开右眼,分别于3、5、7d后再打开左眼,再次行双眼PVEP检测,观察眼优势是否发生移动。结果出生后3周龄大鼠,左眼遮盖后3—7d,左眼P100波振幅逐渐下降,而右眼P100波振幅逐渐升高,与术前比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。出生后6周龄大鼠左眼遮盖3d,左眼、右眼P100波振幅与术前相比差异均无统计学意义（P〉0．05）;但左眼遮盖后5d、7d,左眼P100波振幅明显下降,右眼P100波振幅明显升高,差异均有统计学意义（P〈0．01）。出生后7周龄大鼠左眼遮盖后3～7d,左眼、右眼大鼠P100波振幅与遮盖前相比,差异均无统计学意义（P〉0．05）。3、4、5周龄大鼠术前C／I比值分别为2．69~0．45、2．58±0．41和2．62±0．32,左眼遮盖后的对侧眼振幅值／同侧眼振幅值（C／I）比值分别为1．07±0．15、1．16±0．16和1．14±0．15,差异均有统计学意义（P〈0．01）,但6周龄、7周龄大鼠C／I比值分别为2．80±0．48和2．59±0．36,与术前（2．90±0．46）相比差异均无统计学意义（P〉0．05）,视皮层可塑性消失。7周龄大鼠行双眼形觉剥夺14d,再行左眼遮盖3d后C／I比值较术前降低,差异有统计学意义（1．33±0．18口s2．70±0．45,P〈0．01）,视皮层可塑性被再激活。结论PVEP可以在大鼠动物模型上进行记录,并可以作为检测视皮层眼优势移动的指标;双眼形觉剥夺模型可以再激活成年大鼠视皮层可塑性。     

大鼠视觉可塑性关键期终止相关基因的筛选

目的筛选视觉可塑性关键期终止相关基因,探讨视觉可塑性关键期终止的分子机制。方法采用暗饲养及暗饲养后加光照刺激动物模型,应用抑制性消减杂交技术构建大鼠视皮层与视觉可塑性关键期终止相关的cDNA文库。并通过PCR筛选、反向Northem杂交验证、测序及同源性检索对差异表达基因进行分析。结果成功构建了高消减效率的大鼠视皮层与视觉可塑性关键期终止相关的cDNA文库,经筛选、测序及同源性分析,得到14个视觉可塑性关键期终止时视皮层上调表达基因的片段。其中13个为已知基因,除B—Tubulin、Mbp、Cyclophilin基因有文献报道跟可塑性有关外,其余基因与视觉可塑性的关系以往少有报道。结论通过大鼠视皮层与视觉可塑性关键期终止相关的cDNA文库的建立,筛选出一批与视觉可塑性关键期终止相关的候选基因,为进一步阐明视觉可塑性关键期终止的分子机制提供了重要的基础。     

成年及幼年Long-evans大鼠视皮层HSP8基因的表达差异

目的:观察热休克蛋白8(heat shock protein 8,HSP8)基因在幼年和成年Long-evans大鼠视皮层中的表达水平,探讨其在视觉可塑性关键期中的作用。方法:采用半定量RT-PCR方法,分析处于视觉可塑性关键期内的幼年Long-evans大鼠和处于视觉可塑性关键期后的成年Long-evans大鼠视皮层中HSP8基因的表达水平。结果:幼年大鼠和成年大鼠视皮层间HSP8mRNA表达量有显著性差异,成年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.68±0.03,幼年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.14±0.06,HSP8mRNA在成年大鼠视皮层中表达水平显著高于幼年大鼠(P<0.05)。结论:HSP8基因在视觉可塑性关键期后的成年大鼠视皮层中呈高水平表达,是视觉可塑性关键期终止相关的候选基因。     

大鼠视觉可塑性相关cDNA文库的构建及筛选

目的筛选视觉可塑性相关基因,探讨视觉可塑性关键期形成及终止的分子机制。方法应用抑制性消减杂交技术构建幼年和成年大鼠视皮层差异表达的cDNA文库,并通过PCR筛选、反向Northern杂交验证、测序及同源性检索对差异表达基因进行分析。结果成功建立了高消减效率的幼年和成年大鼠视皮层差异表达的cDNA文库,筛选得到42个在大鼠视觉可塑性关键期终止后视皮层上调表达的基因片段、51个在大鼠视觉可塑性关键期视皮层上调表达的基因片段。经测序及同源性分析,共得到16个有效序列,其中15个为已知基因,另一个可能为新基因片段。结论通过对幼年和成年大鼠视皮层差异表达的cDNA文库的建立,筛选出一批与视觉可塑性关键期形成或终止相关的候选基因,为进一步阐明视觉可塑性的分子机制提供了重要基础。     

视觉发育关键期单眼形觉剥夺对大鼠视功能和视皮层PKCζ蛋白表达的影响

目的　探讨视觉发育关键期单眼形觉剥夺对大鼠视功能和视皮层PKCζ蛋白表达的影响。方法　选取出生后13 d SPF级Long Evans大鼠28只,利用随机数字表法将大鼠随机分为两组:正常对照组、弱视模型组,每组14只,以右眼作为实验眼。建立大鼠多维度弱视模型,采用视觉诱发电位验证弱视模型的建立,HE染色观察大鼠视皮层形态结构,视觉悬崖实验检测大鼠立体视功能,计算每只大鼠的辨别指数,Western blot检测大鼠视皮层中PKCζ蛋白的表达。结果　与正常对照组相比,弱视模型组大鼠右眼（剥夺眼）的P2波潜伏期明显延长,P2波振幅明显降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05) 。两组大鼠视觉悬崖实验检测结果显示,正常对照组大鼠探索行为轨迹集中在右侧(非悬崖侧),而弱视模型组大鼠探索行为轨迹紊乱,探索区域大多分布在左侧 (悬崖侧)。弱视模型组大鼠辨别指数明显低于正常对照组 (P<0.05)。正常对照组大鼠视皮层神经元数量丰富,结构完整,未出现明显神经元变性和坏死;弱视模型组大鼠视皮层神经元数量明显减少,结构不完整,出现不同程度的胞体固缩。弱视模型组大鼠左侧视皮层PKCζ蛋白相对表达量明显低于正常对照组（P<0.01）。结论　在视觉发育关键期单眼形觉剥夺可造成大鼠视皮层结构的改变和视功能严重损害,视皮层PKCζ蛋白表达水平下降。     

Proteins Associated with the Termination of Ocular Dominance Column Plasticity in Long Evans Rats

Purpose:To investigate the mechanism of the termination of ocular dominance column plasticity by electrophysiologic analysis and 2-dimensional electrophoresis-mass spectrography(2-DE/MS).Methods:The changes in ocular dominance columns following monocular deprivation were electrophysiologically detected in 22-day-old,100-day-old and chondroitinase-perfused 100-day-old rats.Total protein of grey matter of the primary visual cortex was extracted and studied by 2-DE/MS from the three groups of rats.Results:Monocular deprivation may lead to shifts in ocular dominance columns in 22-day-old and chondroitinase-perfused 100-day-old rats,but not in 100-day-old rats.Four protein spots present in grey matter of the primary visual cortex in 100-day-old,but not in that of 22-day-old and chondroitinase-perfused rats,and mass spectrography identified two of these proteins.Conclusions:The electrophysiologic results show that ocular dominance column plasticity presents in 22-day-old rats,ends up in 100-day-old rats and restored in chondroitinase-perfused 100-day-old rats.2-DE/MS results show that phosphatidylethanolamine binding protein and glial fibrillary acidic protein delta may be associated with the termination of ocular dominance column plasticity in the rat,but need more evidence to confirm it.     

反转缝合与丰富环境联合干预对成年弱视大鼠视皮层可塑性的再激活作用

目的探讨反转缝合与丰富环境联合干预对单眼形觉剥夺成年弱视大鼠视皮层可塑性的再激活作用。方法将14日龄大鼠随机分为8组：1-3组为正常对照组,4-8组为单眼剥夺组。剥夺组在生后14天行右侧眼睑缝合制备单眼剥夺模型,放于实验室标准环境下饲养,1-3组、4-6组分别于生后45天、60天、90天处死;7-8组于60日龄时打开录0夺眼,缝合左侧眼睑行遮盖治疗,第7组放于标准环境中饲养30d,即反转缝合组,第8组放于丰富环境中饲养30天,即反转缝合联合丰富环境干预组,此两组至90日龄处死取材;免疫组化染色检测并分析各组大鼠视皮层PSD-95蛋白表达水平的变化。结果同年龄段弱视组视皮层PSD-95呈阳性神经元密度降低（P〈0．001）;同年龄段反转缝合干预组视皮层较弱视组PSD-95呈阳性神经元密度增加（P〈0．05）,但仍低于正常组（P〈0．05）;同年龄段反转缝合、结合丰富环境干预组视皮层与弱视组、反转缝合组相比,PSD-95呈阳性神经元密度增加（P〈0．05）,与正常组相比,其差异无统计学意义（P〉O．05）。结论单眼剥夺影响了关键期后成年大鼠视皮层PSD-95的表达,提示PSD-95可能参与调节成年视皮层可塑性;反转缝合单纯干预、反转缝合联合丰富环境干预能部分重新激活剥夺性成年弱视大鼠视皮层可塑性,反转缝合与丰富环境联合干预的再激活作用更为明显。     

神经营养因子在视皮层发育和可塑性中的作用

在视皮层发育过程中，受神经元和视觉活动的共同影响，各种神经营养因子mRNA表达和蛋白合成有不同的阶段性变化。不同神经营养因子按一定顺序对视皮层发育和可塑性过程施加不同影响，其作用机制仍在深入研究中。     

Screening of genes associated with termination of the critical period of visual cortex plasticity in rats

PURPOSE: To investigate the molecular mechanism involved in the termination of the critical period of visual cortex plasticity in the rat. METHODS: The rats were divided into two groups, one group was dark-reared for 67 days after birth, while the other group was dark-reared for 60 days and then put under a normal light/dark cycle for 7 days. A subtracted cDNA library was constructed from the visual cortex, and differentially expressed genes were screened by nested PCR, reverse Northern hybridization, sequencing, and homology analysis. RESULTS: Fourteen genes were found to be up-regulated in the visual cortex. These included 13 known genes and a novel fragment (Genbank submission EB174193). Of the known genes, three genes encoding beta -tubulin, myelin basic protein, and cyclophilin were previously reported to be associated with visual cortex plasticity. CONCLUSION: A set of candidate genes related to the termination of the critical period was identified using the subtracted cDNA library. This work provides an important basis for understanding the molecular mechanisms involved in the termination of plasticity in the visual cortex.     

Proteomic analysis of rat retina in a steroid-induced ocular hypertension model: Potential vulnerability to oxidative stress

Purpose To investigate global protein expression profiles in the retinas of normal and glucocorticoid-induced ocular hypertensive rats by proteomic analysis. Methods Ocular hypertension was induced by topical application of dexamethasone (DEX) for 4 weeks. Age-matched untreated rats served as controls. Intraocular pressure (IOP) was monitored by an electronic tonometer. Retinal protein expression profiling was carried out by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Proteins were identified by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. Results In DEX-treated rats, average IOP was elevated significantly compared with controls. With DEX treatment, levels of four proteins were altered, as revealed by 2-D DIGE and MALDI-TOF mass spectrometry: apolipoprotein A1 (apoA1), a lipid-binding protein, upregulated 1.9-fold, P < 0.05; alpha A crystallin (CRYAA), a molecular chaperone, downregulated 2.7-fold, P < 0.01; superoxide dismutase 1 (SOD1), an antioxidant enzyme, downregulated 2.3-fold, P < 0.05; and triosephosphate isomerase 1 (TPI1), a glycolytic enzyme, downregulated 2.3-fold, P < 0.01. Conclusions Downregulation of CRYAA, SOD1, and TPI1, observed here after a short period of DEX-induced ocular hypertension, may be involved in the onset of neural damage in steroid-induced glaucoma.