人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析

目的筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析。方法利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列。结果从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A490值最高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A490为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VHⅠ亚群,轻链可变区(VL)属于VκⅠ和VκⅢ亚群。结论从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsAg噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础。     

人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性抗核抗体(ANA)Fab片段噬菌体抗体库.方法 从4名ANA滴度大于1∶10 000的自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA,用RT-PCR技术扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因.将轻链基因片段克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库,随后将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,形成κ/λ-Fd-pComb3Hss质粒,然后将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue.用辅助噬菌体M13 KO7感染XL1-Blue,随机的重组抗体文库即表达于丝状噬菌体表面.结果 扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为2×104的轻链基因抗体库和库容为4×104的人Fab抗体库,获得了噬菌体滴度为2×109CFU/ml的富含人源性抗核抗体Fab片段的噬菌体抗体库.结论 成功构建了人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,为人源性抗核抗体Fab片段的制备以及进一步评价其在肿瘤免疫靶向治疗中的作用奠定了基础.     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。     

人抗HBsAg噬菌体抗体Fab段基因的序列分析及表达

对已建的噬菌体抗体库分离出来的人抗－ＨＢｓ克隆进行了序列分析和表达研究，发现４个克隆中３个克隆的重链和轻链完全相同，ＤＮＡ序列分析表明ＶＨ分别属于ＶＨ１亚群和Ⅱ亚群，其轻链ＶＬ分别属于ＶλⅡ亚群和ＶλⅠ亚群。构建了可溶性Ｆａｂ段表达载体，显示出在细菌中表达的Ｆａｂ段抗体与ＨＢｓＡｇ特异性结合，这说明所筛选出来的噬菌体抗体具有ＨＢdisplay status     

人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库的构建

为构建人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,从脑胶质瘤患者外周血淋巴细胞 (PBL)中提取细胞总RNA ,经逆转录后用套式PCR分别扩增抗体轻链Vκ和重链VH基因。先构建Vκ基因库 ,并使连接Vκ和VH基因的linker与Vκ基因连接 ,再将VH基因克隆入Vκ基因库 ,即构建成功单链抗体 (ScFv)库。随机挑取菌落鉴定 ,测序表明从PBL中扩增出人源性Vκ和VH基因 ,并构建了库容量约为 2× 10 6的ScFv噬菌体抗体库。随机挑取克隆的测序表明 ,测定的VH基因与Kabat的抗体基因库中人抗体VH基因有较高的同源性 ,证明所克隆的基因属人抗体可变区基因。结果表明实验构建成人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,为进一步筛选人源性抗脑胶质瘤抗体奠定了基础     

抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因的克隆

目的：从一株抗结肠癌细胞系ＬＳ１７４Ｔ的单抗细胞株ＣＬ－４中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因。方法：用一步法提取总ＲＮＡ，逆转录形成ｃＤＮＡ，设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整κ轻链的通用引物，通过ＰＣＲ扩增基因，分别克隆入ｐＵＣ１９，作核苷酸序列分析。结果：用重链引物扩增获得长约３６０ｂｐ的片段；用轻链引物扩增获得约６４０ｂｐ的片段，序列测定获得它们的ＤＮＡ序列。结论：克隆的重链可变区基因长度为３６０ｂｐ，属于小鼠重链可变区Ｉ（Ｂ）亚族；κ轻链长度为６４２ｂｐ，其中可变区为３２１ｂｐ，属于小鼠κ轻链Ⅴ亚族。     

基因工程抗角蛋白人抗体的制备与鉴定

目的　制备亲和力高、性能良好的人源性抗角蛋白抗体。方法　以人表皮角蛋白为抗原从噬菌体抗体库中克隆特异性抗角蛋白抗体 ,采用链替换 (chain shuffling)技术对所获抗体进行亲和力成熟 ,并对其生物学性能进行一系列鉴定。结果　经过筛选半合成噬菌体抗体库 ,成功获得了能与角蛋白特异性结合的人源性抗角蛋白抗体 ;选择其中活性最好的一株抗体 ,通过轻链替换和重链替换使抗体亲和力得到了有效提高 ,达到8× 10 1 0 mol的理想水平。结论　用基因工程的方法可以制备高质量的人源性抗角蛋白抗体 ,为其功能和临床应用的进一步研究打下了基础     

抗地高辛人源小分子抗体的获取

目的 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛抗体,并构建双体抗体.方法 以固相化的地高辛对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,3～4轮后挑取克隆用酶联免疫吸附测定方法鉴定其特异性,对抗地高辛阳性抗体克隆进行DNA指纹分析及测序分析.选取活性好的克隆进行改造,构建双体抗体.结果 在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得了4株可与地高辛特异性结合的人源抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同克隆基因,阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第一亚群,重链分别属于第三和第四亚群.选取4号克隆进行基因改造,构建双体抗体表达载体,获得了活性较好的双体抗体.结论 利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的双体抗体,可能为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源抗体.     

抗结肠癌抗体重链可变区和k轻链基因的克隆

目的：从一株抗结肠癌细胞系ＬＳ１７４Ｔ的单抗细胞株ＣＬ－４中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和ｋ轻链基因，方法：用一步法提取总ＲＮＡ，逆转录形成ｃＤＮＡ，设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整ｋ轻链的通用引物，通过ＰＣＲ扩增基因，分别克隆入ｐＵＣ１９，作核苷酸序列分析，结果：用重链引物扩增获得长的３６０ｂｐ的片段，用轻链引物扩增获约６４０ｂｐ的片段，序列测定获得它们的ＤＮＡ序列，结论：克隆的重链可     

人源宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体的筛选和基因结构特点分析

将纯化的宋内痢疾杆菌脂多糖的鼠单克隆抗体（５Ｂ１２）固相化，然后对混合噬菌体抗体库（ＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ）进行５轮“吸附－洗脱－扩增”的淘筛，使特异性噬菌体抗体得到了富集，阳性率达５３．１３％。竞争抑制试验证明，其中６株与宋内痢疾杆菌脂多糖的竞争抑制率大于５０％。酶切电泳图谱显示，淘筛的阳性克隆均无轻链基因，重链基因约４００ｂｐ。对分离的两株阳性克隆进行序列分析研究，发现这两个克隆ＤＮＡ序列相同，均为人免疫球蛋白重链可变区序列，属人ＩｇＧ基因Ⅲ家族，长度为３８４ｂｐ，与期望的６６０ｂｐ相差２７６ｂｐ。但这种重链部分缺失和轻链完全缺失的抗体片段却有明确的与５Ｂ１２的结合活性。     

单链抗体的研究进展

抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到基因工程抗体,尤其是抗体库技术的出现,将抗体工程发展到了一个新阶段。本文从抗体库技术等方面介绍单链抗体(single-chain Fv antibody,sc Fv)的进展情况。     

体外抗体亲和力成熟的几种策略

抗体在疾病诊断、治疗和预防方面发挥着举足轻重的作用。随着抗体工程技术的不断发展，抗体已经成为生物制药领域中的热点。而抗体工程发展所面临的两大难点问题之一就是如何提高基因工程抗体的亲和力。本文综述了有关基因工程抗体体外抗体亲和力成熟方面的最新进展。     

三种自身抗体与复发性流产的关系研究

目的探讨封闭抗体、抗心磷脂抗体、甲状腺自身抗体与复发性流产之间的关系。方法检测50例复发性流产患者和60例正常分娩者的封闭抗体、抗心磷脂抗体、甲状腺自身抗体并对两组的封闭抗体阴性率、抗心磷脂抗体阳性率和甲状腺自身抗体阳性率进行比较。结果复发性流产组中封闭抗体阴性率为92.00%,抗心磷脂抗体阳性率为30.00%,甲状腺自身抗体阳性率TPO-AB为16%,TG-AB为14%,对照组分别为11.67%,5.00%,5.00%,3.33%,两者比较差异有统计学意义。结论患者封闭抗体、抗心磷脂抗体、甲状腺自身抗体对复发性流产的诊断具有重要的意义。     

Mouse-specific antibody responses to a monoclonal antibody during repeated immunoscintigraphy investigations: Comparison of antibody titres and imaging studies in a rat model

As a model for human mouse-specific antibody responses in patients undergoing immunoscintigraphy, we have investigated in rats the production of mouse-specific antibodies (MA) to the mouse monoclonal antibody 791T/36. At intervals of between 5 and 16 weeks the rats were given repeated cycles of intravenous (IV) injections of antibody with or without a simultaneous intradermal (ID) injection. The IV dose was 60 gmg/kg, a dose similar to that used in many clinical immunoscintigraphy studies. The ID injection was 2 g, which mimicks the skin test dose often given in clinical imaging protocols. The study was carried out with both¹³¹I-labelled antibody and with antibody labelled with¹¹¹In by diethylenetriamine-penta-acetic acid (DTPA) chelation. MA was measured with a passive haemagglutination assay using sheep red blood cells coated with the monoclonal antibody. Of rats given ID injections of unlabelled antibody at the same time as the IV imaging doses, 9/20 produced MA during 4 cycles of injections. In contrast, only 2/16 rats given only the IV dose produced MA. Both¹³¹I- and¹¹¹In-labelled antibody appeared equally immunogenic with 5/18 and 6/18 overall responders, respectively. The production of MA was associated with a significant perturbation in the biodistribution of the IV dose of labelled antibody as seen by gamma-camera imaging of the rats given¹¹¹In-labelled antibody. There was clearance of immune complexes to the liver, this organ accumulating up to 90% of the whole body count rate of radiolabel. MA titres of between 1/100 and 1/78000 caused equal perturbation of biodistribution, although below 1/100 the effect was more variable.     

抗登革病毒单抗的独特型抗体的制备与鉴定

从19种抗登革病毒单克隆抗体(简称单抗)中筛选出4种具有中和活性的单抗。经过纯化免疫新西兰大白兔制备多克隆抗独特型抗体(Ab2)。制备的4种抗独特型抗体血清有很高的特异性,其中具有全交叉反应的3种单抗的抗血青中Ab2的水平较高。采用简便的去除抗血清中的同种型和同种异型抗体的方法,用夹心ELISA法检测Ab2的水平取得了满意的结果。     

胰腺癌的放射免疫治疗进展

胰腺癌是常见的肿瘤,但预后很差,传统治疗的结果令人失望,放射免疫治疗提供了一个新的治疗途径。单克隆抗体具有高度的特异性,放射性核素在肿瘤部位积聚高而达到杀伤瘤细胞的目的。完整的单抗因其分子质量较大而难于达到肿瘤内部,且易诱发人抗鼠抗体反应。基因工程抗体因具有更高的亲和力和更容易进入肿瘤内部,已成为放射免疫治疗的热点及突破胰腺癌临床治疗的关键所在,将在胰腺癌的治疗中发挥重要作用。     

抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

尝试将一株来源于人源性噬菌体抗体库的抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ,转换成完整的抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ。方法：采用重叠ＰＣＲ方法,在抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ的Ｖｋ和ＶＨ基因的５’端接上合工合成的人ｋ链的前导序列,构建表达完整ＩｇＧ１的真核表达载体,转染ＣＨＯ（ＤＨＦＲ＾－）细胞,用ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和免疫印迹检测抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ的表达,通过ＤＨＦＲ／ＭＴＸ体系及金属离子诱导提高Ｉｇ表达。结果：获得表达量     

抗SSA、SSB抗体的荧光特点和临床意义

目的评价SSA、SSB抗体的荧光特点和临床意义,并探索在进行临床抗核抗体(ANA)筛查的过程中,鉴定这些抗体的必要性。方法对所有送检标本进行ANA和可提取性核抗原(ENA)检测,选择SSA、SSB阳性标本进行实验室和临床分析。结果在4 978个送检样本中,259个样本抗SSA、SSB阳性,阳性样本分为SSA+SSB-、SSA-SSB+和SSA+SSB+三组。与SSA+SSB-组和SSA-SSB+组比较,SSA+SSB+组ANA阴性样本比例(0.5%)明显降低(P<0.01),而高滴度样本比例(53.5%)明显增高(P<0.01)。SSA和(或)SSB阳性样本除呈现颗粒型荧光外,还出现各种荧光核型。SSA+SSB+组颗粒型荧光的比例明显高于SSA+SSB-和SSA-SSB+(P<0.01)。与SSA+SSB-组相比,SSA+SSB+组患有干燥综合征(SS)的比例明显增高,患有其他疾病的比例明显降低。SSA-SSB+组共8例患者,所患疾病各不相同。结论临床上检测SSA、SSB抗体具有必要性,联合检测SSA和SSB抗体可以提高SS诊断特异性。     

抗人BlyS嵌合抗体的研制及功能鉴定

目的:在具有中和功能的母本抗体基础上,进行人源化改造,获得具有相同功能的嵌合抗体.方法:本研究以一株具有中和活性的抗人BlyS鼠单抗(B20)为母本,将抗人BlyS鼠单抗B20的轻、重链可变区基因分别插入到含有人κ链和IgG1重链恒定区基因的真核表达载体中,构建了人-鼠嵌合抗体表达载体,转染真核细胞,通过ELISA、RT-PCR、免疫印迹、体外中和实验分别对嵌合抗体(CB20)进行检测.结果:RT-PCR结果显示,转染后细胞系有人-鼠嵌合抗体mRNA的转录;ELISA、免疫印迹实验鉴定表明,该嵌合抗体与人BlyS特异性结合;体外中和实验表明,此抗体能中和BlyS对B淋巴细胞促增殖效应.结论:成功地构建人-鼠嵌合抗体CB20.