EB病毒LMP1 CTAR23蛋白特异性结合短肽的筛选

目的 利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒(EBV)LMP1 CTAR23蛋白高效结合的短肽.方法 利用亲和层析柱加酶切的方法 纯化CTAR23蛋白,并用其筛选噬菌体12肽库.通过夹心ELISA法分析噬菌体克隆与CTAR23蛋白的亲和力.通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析.结果 对12肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果.ELISA提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR23蛋白高效结合.硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100%,测序结果 显示噬菌体上的短肽有共同序列HVSLHKHYPTAS.结论 噬菌体短肽HVSLHKHYPTAS为研究LMP1致瘤机理、开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物奠定坚实的基础.     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

利用噬菌体肽库筛选Survivin结合肽

目的：将纯化的Survivin蛋白作为诱饵,从噬菌体肽库中筛选出结合肽。方法：用纯化的Sur-vivin蛋白包被35 mm的塑料培养皿,加入随机12肽的噬菌体肽库,用靶分子溶液竞争性洗脱结合的噬菌体,通过测定噬菌体滴度检测Survivin蛋白的吸附、富集效果,筛选阳性噬菌斑,制作DNA测序模板进行测序。结果：经3轮筛选,噬菌体显示有良好的富集效果。从第3轮筛选产物中挑取8个蓝色噬菌斑（阳性克隆）进行测序,DNA测序结果表明,具有一致性序列GIANNFFTLKIS。结论：从噬菌体随机肽库中,筛选到能与Survivin蛋白特异性结合的一段短肽,为Survivin蛋白的进一步研究奠定基础。     

从噬菌体展示肽库中筛选与人精子蛋白17结合的短肽序列

目的：随机从噬菌体12肽库中筛选与人精子蛋白17（Sp17）特异性结合的短肽序列,并进行鉴定.方法：以基因工程制备的人Sp17为钓饵蛋白,采用亲和淘筛法对噬菌体肽库进行三轮亲和淘筛.富集Sp17特异结合噬菌体,用ELISA鉴定其结合活性并进行DNA测序分析.结果：随机挑出20个噬菌体克隆进行鉴定,ELISA显示其中5个克隆与Sp17有较强结合活性,其氨基酸序列分别为QLMSNIHRRMII、RKMMNQTKRHLP、NTMKTMRIMMTR、RRRLLLMQRRMKR和SPRPMMRRIRKQ.结论：从噬菌体展示肽库中筛选鉴定出5个与人Sp17结合的12肽序列.     

脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的初步筛选

目的 应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)与CD14结合位点的多肽序列.方法 以CD14为固相筛选分子,对噬菌体12肽库进行4轮亲合筛选,采用酶联免疫吸附(ELISA)法鉴定筛选后的噬菌体克隆与CD14的结合活性,取结合活性较高的克隆进行DNA测序,推导其多肽序列并与LBP序列比对,再进行竞争抑制实验检测筛选噬菌体与LBP竞争结合CD14的效力.结果 挑取的20个噬菌体克隆中,16个结合实验鉴定阳性,取6个亲和力最高的克隆测序,得到3条不同编码的12肽序列(FHRWPTWPLPSP、MHRHPPPITLPL和AAFHRAHHLTSP),3条多肽与LBP一级结构同源性低,为模拟肽.6个噬菌体克隆有较高的竞争抑制率.结论 用噬菌体12肽库成功筛选出LBP与CD14结合位点的模拟肽.     

EB病毒LMP1 CCT蛋白特异性结合短肽的筛选

目的筛选能与EBVLMP1CCT蛋白高效结合的短肽。方法利用亲和层析和酶切的方法纯化CCT蛋白,并用CCT蛋白筛选噬菌体12肽库。通过夹心ELISA方法分析噬菌体克隆与CCT蛋白的亲和力。通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定。并对阳性克隆进行测序分析。结果对肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果。ELISA方法提示筛选出来的噬菌体克隆能与CCT蛋白高效结合。硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100%,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列:IQMPPKWPWPAA。结论从噬菌体肽库中筛选到的噬菌体短肽IQMPPKWPWPAA为探讨LMP1致瘤机理、开发抗鼻咽癌短肽药物及基因疫苗奠定了实验基础。     

噬菌体随机肽库筛选日本血吸虫22.6kDa蛋白有效抗原表位的初步研究

目的：从噬菌体随机12肽库中筛选出中国大陆株日本血吸虫22.6kDa蛋白（Sj22.6kDa抗原表达的短肽分子，探讨其抗血吸虫的交叉免疫保护效果。方法：以纯化的抗日本血吸虫22.6kDa的多克隆抗体IgG为配基，对噬菌体12肽库进行5轮亲和筛选，富集特异性噬菌体，挑取克隆，经序列分析，免疫识别和动物初筛后获得阳性克隆。结果：经过5轮筛选，特异性噬菌体得到有效富集。随机挑选的24个噬菌体克隆中获得4个有效抗原表位。结论：利用噬菌体随机肽库筛选可获得类似日本血吸虫22.6kDa有效抗原表位的短肽分子，这些短肽分子能诱导抗血肿虫的保护性免疫。     

应用噬菌体展示技术筛选缺氧诱导因子-1α相关肽

目的：应用噬菌体展示12肽库筛选低氧诱导因子—α(HIF—α)相关肽。方法：以抗HIF—α单克隆抗体(HIF—αmAb)为配基，采用亲和免疫法从随机12肽库中筛选与抗体特异结合的噬菌体。在筛选过程中，逐轮提高HIF—αmAb的稀释度并增强洗脱强度。3轮筛选后，随机挑取10个克隆测序。通过膜斑点印迹(Dot-ELISA)进行特异性结合鉴定。结果：经过3轮筛选后，特异性结合的噬菌体得到有效的富集，并且Dot-ELISA反应阳性逐轮增强。测序后发现有4个克隆的序列完全相同，其12肽氨基酸序列为GPHHYWYHLRLP。结论：噬菌体展示肽库技术可以用于筛选HIF—1相关肽，并为后续的活性鉴定打下基础。     

噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽

目的 用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽.方法 采用酶联免疫吸附测定法(EUSA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,根据序列测定结果合成阳性小肽,四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测合成小肽刺激UT-7细胞增殖的活性.结果 经3轮筛选获得11个来源于环七肽库和8个来源于十二肽库与rc-kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体克隆,DNA测序结果显示环七肽库筛选到1个共有序列DPSSPHTH,十二肽库没有筛选到共有序列.序列比对分析显示,这些小肽与hSCF没有同源序列.MTT法测定结果表明,合成的4个小肽均能促进UT-7细胞增殖,其中CE16和LE20刺激效果明显.结论 获得4个具有较高hSCF生物学活性的模拟肽.     

CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

目的筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列,为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序,并推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力,经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。     

靶向肿瘤干细胞标记CD133特异性结合肽的筛选和初步鉴定

摘要：目的筛选可与人肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合的短肽并进行初步鉴定。方法首先合成人肿瘤干细胞
表面标记物CD133 细胞外片段的生物素化蛋白,以此为靶,利用噬菌体肽库技术,高通量液相淘选CD133 的特异性短
肽。应用夹心EL ISA选择出结合较强的克隆。提取DNA测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性,根据噬菌体基因序
列推导出多肽序列。通过免疫荧光技术初步验证合成多肽和人大肠癌细胞的结合情况。结果4 轮液相筛选后,与
CD133特异性结合的噬菌体得到有效富集,第4轮与第1轮相比,富集了388倍。经ELISA 鉴定的20个噬菌体单克隆中,
有13个与CD133有较高亲和力,具有阳性意义。经比对得到11条完全一致的氨基酸序列TISWPPR,2条完全一致的氨
基酸序列STTKLAL,竞争性阻断ELISA实验表明第一条特异性较强。结论成功利用噬菌体肽库技术,淘选出1条可和
人CD133特异性结合的高亲和力短肽,为后续CD133的研究奠定了基础,表明从噬菌体肽库中液相淘选生物素化小分子
的高亲和力多肽的方法切实可行。     

人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证

目的获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础。方法应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽。酶联免疫法进行靶向性验证。应用荧光染色技术初步探讨短肽细胞受体位置。制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性。结果经过四轮一步有机相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数最多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示该短肽有较强的特异性。结论应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了其靶向性。可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物。     

人纤溶酶原Kringle 5区的基因克隆的表达及纯化

目的克隆人纤溶酶原Kringle5(K5)区基因,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定.方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因,构建K5的原核表达载体pET-22b(+)-K5-6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+-树脂亲和层析进行纯化,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性.结果经PCR成功扩增出了243 bp的K5区基因,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET-22b(+),重组质粒在BL21中成功表达出分子量为14 000的蛋白质,纯化后的蛋白纯度达95%,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能,K5蛋白浓度为4 μg/mL时抑制率达50%.结论纤溶酶原K5的成功克隆、表达及纯化可能在肿瘤和动脉粥样硬化的抗血管生成治疗中具有一定作用.     

一氧化氮合酶在糖尿病大鼠视网膜中表达模式的研究

目的 研究一氧化氮合酶(NOS)在8周糖尿病大鼠视网膜的表达,探讨其与一氧化氮在糖尿病视网膜病变(DR)中可能的分子作用机制.方法 采用限制片段差异显示PCR(RFDD-PCR)技术建立正常和8周糖尿病大鼠视网膜基因表达谱,经生物信息学分析两者差异,初步确定NOS三种亚型-eNOS、nNOS和iNOS为DR相关基因,并以半定量RT-PCR和免疫组化方法进行验证.结果 RFDD-PCR结果显示,糖尿病组eNOS和nNOS表达下调,iNOS表达上调.RT-PCR结果显示,糖尿病组eNOS和nNOS表达比正常组明显降低(eNOS:0.23±0.03,0.32±0.03,P＜0.05;0.25±0.02,0.36±0.02,P＜0.05),iNOS比正常组明显增高(0.27±0.02,0.20±0.03,P＜0.05).免疫组化结果显示,正常组eNOS、nNOS和iNOS阳性细胞均见于内核层(INL)和节细胞层(GCL),eNOS阳性细胞也分布于血管内皮层;糖尿病组eNOS和nNOS阳性细胞较正常组明显减少(eNOS:14.33±3.19,22.13±3.60,P＜0.05;nNOS:21.87±3.62,34.40±7.09,P＜0.05),iNOS较正常组明显增多(17.60±2.58,11.73±2.70,P＜0.05).结论 eNOS、nNOS和iNOS表达变化与DR发生发展有关.     

噬菌体肽库中筛选NMDA受体模拟抗原

目的：研究发现脑缺血患者体内存在N甲基－D－门冬氨酸（NMDA）受体自身抗体，了解共滴度与疾病程度的相关性。方法：用NMDAR1单克隆抗体淘筛噬菌体展示随机12肽库，获得NMDR1模拟表位抗原。结果：细胞竞争ELIA结果显示，该模拟抗原可以竞争细胞表达天然抗原与抗体的结合，具有抗原模拟性。结论：噬菌体肽库中筛选NMDAR1受体模拟抗原可以用于临床病人血清检测，本研究为下一步临床检验准备了必要条件。     

精氨酸类似物对一氧化氮合酶的影响

目的 研究新精氨酸类似物对一氧化氮及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的影响。方法 脂多糖刺激巨噬细胞，检测不同浓度新精氨酸类似物对诱导型iNOS的抑制程度；胰岛素刺激脐静脉内皮细胞，检测新精氨酸类似物对于内皮细胞的iNOS的抑制作用。结果 （1）新精氨酸类似物可显著抑制脂多糖刺激的巨噬细胞产生一氧化氮，并呈剂量依赖性。而对胰岛素刺激的内皮细胞一氧化氮产生无明显影响。（2）新精氨酸类似物可显著降低巨噬细胞iNOS的活性，对于巨噬细胞的结构型iNOS活性及内皮细胞的iNOS活性无明显影响。（3）新精氨酸类似物对于巨噬细胞iNOS的蛋白表达无明显影响。结论 新精氨酸类似物是一种具有高度选择性的iNOS抑制剂。     

能结合HCV E2蛋白的人CD81模拟肽的筛选与活性鉴定

目的用CD81单克隆抗体筛选噬菌体随机展示十二肽库,以期得到可模拟人CD81功能位点、能抑制HCVE2与其受体—人CD81分子结合的小肽。方法用CD81单抗从噬菌体随机展示十二肽库中筛选人CD81模拟肽,用ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;以阳性噬菌体免疫BALB/c小鼠,分析小鼠免疫血清对阳性噬菌体与HCVE2结合的阻断作用;以HCVE2蛋白包被酶标板,检测阳性噬菌体对HCVE2与人CD81分子结合的抑制作用。结果对十二肽库进行3轮筛选后,经ELISA和DNA测序,鉴定出3个(C4,C13和C16)阳性克隆,与人CD81无同源序列。阳性噬菌体克隆C16免疫小鼠血清能阻断该克隆与HCVE2的结合。C16克隆能以剂量依赖的方式竞争性抑制HCVE2蛋白与人CD81的结合。结论用人CD81单抗从噬菌体随机展示肽库中筛选出的阳性噬菌体克隆所编码的小肽在功能上能模拟人CD81与HCVE2的结合活性,能竞争性抑制HCVE2与人CD81分子的结合,在抗HCV药物及疫苗研究中具有潜在应用价值。     

人NKp46基因克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的：对人NKp46进行基因克隆并探讨其在大肠杆菌中重组表达和纯化。方法：用RT PCR法自人外周血单个核细胞总RNA扩增hNKp46片段（约900?bp）,克隆至质粒载体pMD18 T,并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18 T hNKp46重组质粒,分离hNKp46片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载pET30a(+) hNKp46。转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组蛋白。采用His·Bind Purification Kit对重组蛋白进行纯化。结果：RT PCR扩增的DNA片段与hNKp46 cDNA大小一致。重组质粒pMD18 T hNKp46的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp46的cDNA序列一致。SDS PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为38.5?kD,其表达量达菌体总蛋白的40％左右。Western Blotting分析显示,重组蛋白能特异地与抗His·Tag抗体结合。纯化得到纯度为95.5％的重组蛋白,纯化回收率达40％。结论：成功构建了人NKp46表达载体,并获得了稳定表达的工程菌株,纯化了重组蛋白。