抗P-选择素功能域单抗体外抗黏附作用的实验研究

目的观察针对P-选择素的抗P-选择素lectin-EGF功能域单抗(PsL-EGFmAb)体外抗黏附功能.方法常规培养或制备人脐静脉内皮细胞(ECV-304)、中性粒细胞及肾小管上皮细胞(HK2细胞),并对ECV-304和HK2细胞行炎症因子TNF-α刺激,然后观察和比较经PsL-EGFmAb和抗P-选择素全长单抗以及配体拮抗剂N-去硫酸肝素处理前后,中性粒细胞与ECV-304细胞黏附变化,以及HK2细胞的黏附分子(P-选择素)和共刺激分子(CD80)表达情况.结果经PsL-EGFmAb等三种药物处理后,中性粒细胞与受刺激ECV-304细胞黏附量随药物浓度均下降,受刺激后HK2细胞的P-选择素表达及CD80mRNA转录水平也均受到抑制,其中尤以PsL-EGFmAb抗黏附抑制效应更明显.结论抗P-选择素功能域单抗较其他两种药物更具体外抗黏附靶向抑制效应,为进一步研究针对P-选择素抗黏附作用提供了基础.     

P-选择素及其细胞黏附与抗黏附调节

P-选择素是黏附分子选择素家族的重要成分，主要表达在活化的血小板／内皮细胞表面，可介导细胞初始黏附及参与启动白细胞黏附迁移级联过程。研究表明P-选择素与机体免疫防御功能及多种疾病密切相关，尤其在炎症反应、血栓形成及肿瘤转移等多种病生理过程中发挥重要作用。针对P-选择素的早期抗黏附调节，已在抗炎、抗血栓、抗肿瘤转移等方面显示出良好的防治效果。     

阿魏酸川芎嗪抗血栓形成作用及其对血小板中性粒细胞黏附的影响

目的 观察阿魏酸川芎嗪(LF)的抗血栓作用及其对血小板中性粒细胞黏附的影响,并探讨其可能机制.方法 采用电刺激大鼠颈动脉血栓形成法和动静脉旁路法血栓形成法评价LF对血栓形成的对抗作用;运用玫瑰花结黏附试验观察LF对血小板中性粒细胞黏附的影响;采用流式细胞术法检测LF对血小板P-选择素(CD62p)表达的影响.结果 LF能明显抑制大鼠电刺激颈动脉法和动静脉旁路法引起的血栓形成;减少CD62p的表达;抑制血小板与中性粒细胞的黏附,其半数抑制浓度(IC50)为64.3μmol· L-1.结论 LF具有明显的抗血栓形成作用,减少CD62p的表达,从而阻抑血小板中性粒细胞黏附有关.     

抗P-选择素功能域单抗对急性肾损伤防治及免疫防御功能的影响

目的探讨抗P-选择素lectin-EGF功能域单抗(PsL-EGFmAb)对大鼠急性肾损伤防治及机体免疫防御功能影响.方法建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型,观察和比较经PsL-EGFmAb及其配体拮抗剂N-去硫酸肝素处理前后,大鼠肾组织P-选择素及其mRNA表达、组织病理学改变、肾功能变化以及免疫细胞功能状态.结果肾缺血再灌注后,大鼠肾内以肾小管上皮细胞为主P-选择素表达增强,出现明显的组织病理学改变及肾功能损害;同时体内T、B细胞活性受抑,而NK细胞明显激活.经给予PsL-EGFmAb及其配体拮抗剂N-去硫酸肝素处理后,肾组织P-选择素及其mRNA表达受抑,病理学改变及肾功能损害减轻,尤以PsL-EGFmAb治疗效果更为明显;此外大鼠体内三种免疫细胞功能均受到不同程度的调节.结论抗P-选择素功能域单抗对肾缺血再灌注损伤具有防治作用,其抗黏附靶向效果强于N-去硫酸肝素,并对大鼠免疫防御功能可能具有调节作用.     

急性期脑梗死病人外周血中性粒细胞与低氧-复氧内皮细胞的黏附性

①目的探讨急性期脑梗死病人外周血中性粒细胞（PMN）与低氧-复氧（H／R）血管内皮细胞黏附性，以及抗ICAM-1单抗对其的影响。②方法培养的人类脐静脉内皮细胞株ECV-304经（或不经）H／R和抗ICAM-1单抗处理后，分别加入脑梗死病人外周血PMN并检测黏附率。⑧结果ECV-304经H／R处理后与脑梗死病人外周血PMN黏附率明显增高；抗ICAM-1单抗可显著抑制脑梗死病人外周血PMN与H／RECV-304黏附。④结论脑梗死病人外周血PMN活化，H／R使血管内皮细胞与PMN黏附性进一步增强；ICAM-1参与介导脑梗死后PMN与血管内皮细胞黏附，抗ICAM一1单抗可起部分阻断作用。     

复发性脑梗死患者外周血黏附分子的变化

目的:探讨复发性脑梗死患者外周血黏附分子的变化。方法:流式细胞仪和酶联免疫吸附法测定33例复发性脑梗死和42例既往有1次脑梗死发病患者外周血淋巴细胞整合素Mac-1的β亚单位(CD18)、细胞间黏附分子3(CD50)、细胞间黏附分子1(CD54)、非常晚抗原4(VLA-4)的α和β亚单位(CD49d和CD29)、CD44和L-选择素(CD62L)的表达,血小板膜糖蛋白Ⅱb-Ⅲa复合物的α亚单位(CD41)、P-选择素(CD62p)的表达及血清中可溶性P-选择素(sP-选择素)和可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)的水平。结果:与既往有1次脑梗死发病患者相比,复发性脑梗死患者淋巴细胞CD18、CD50、CD54、CD49d、CD29、CD44、CD62L和血小板CD41的阳性百分率无显著性差异;血小板CD62p的表达和血清中sP-选择素和sICAM-1水平显著升高(P<0.05,P<0.01);Logistic多元回归分析证实sICAM-1和sP-选择素是脑梗死复发的危险因素(P<0.05)。结论:血小板和内皮细胞的活化在脑梗死复发中起重要作用。     

P-选择素、血小板内皮细胞黏附分子1与缺血性脑血管病关系的研究

P-选择素(CD62P,颗粒膜蛋白140)与血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1,CD31)是细胞黏附分子家族的重要成员,P-选择素促进血小板的黏附、聚集,血小板源内皮细胞黏附分子1抑制血小板的黏附、聚集,二者在缺血性脑损伤发生发、展过程中起着重要作用,P-选择素、血小板源内皮细胞黏附分子1的研究对急性脑梗死的治疗提供了新的方向。     

CD40L诱导ECV-304细胞VCAM-1表达的分子机制

目的研究人类脐静脉内皮细胞(ECV-304)、CD40/CD40L系统诱导血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的分子机制.方法体外培养ECV-304,免疫印迹分析法及TransAMTM系统分别检测CD40L干预前后转染核因子-кB(NF-кB)P65的表达量及活性.阳离子脂质体介导法短暂转染NF-кB(P65)正反义寡核苷酸(ODN),流式细胞仪检测VCAM-1表达.结果CD40L干预后24 h,VCAM-1的表达显著升高(P<0.05);未干预内皮细胞核内几乎无P65蛋白的表达,CD40L刺激30 min后,P65蛋白表达显著升高(P<0.01);CD40L干预后内皮细胞核抽提物的NF-кB(P65)转录因子活性明显升高.阳离子脂质体转染P65反义ODN至内皮细胞,可以显著抑制rhsCD40L介导的VCAM-1的表达(P<0.05),转染P65正义ODN则不能抑制rhsCD40L介导的VCAM-1的表达.结论NF-кB的活化可能部分参与了CD40/CD40L介导VCAM-1表达的信号转导途径.     

抗P-选择素功能域单抗对急性肾损伤防治及免疫防御功能的影响

目的 探讨抗P-选择素lectin-EGF功能域单抗(PsL-EGFmAb)对大鼠急性肾损伤防治及机体免疫防御功能影响。方法 建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，观察和比较经PsL-EGFmAb及其配体拮抗剂N-去硫酸肝素处理前后，大鼠肾组织P-选择素及其mRNA表达、组织病理学改变、肾功能变化以及免疫细胞功能状态。结果 肾缺血再灌注后，大鼠肾内以肾小管上皮细胞为主P-选择素表达增强，出现明显的组织病理学改变及肾功能损害；同时体内T、B细胞活性受抑，而NK细胞明显激活。经给予PsL-EGFmAb及其配体拮抗剂N-去硫酸肝素处理后，肾组织P-选择素及其mRNA表达受抑，病理学改变及肾功能损害减轻，尤以PsL-EGFmAb治疗效果更为明显；此外大鼠体内三种免疫细胞功能均受到不同程度的调节。结论 抗P-选择素功能域单抗对肾缺血再灌注损伤具有防治作用，其抗黏附靶向效果强于N-去硫酸肝素，并对大鼠免疫防御功能可能具有调节作用。     

树突状细胞在大鼠单侧输尿管梗阻后肾组织中的分布与作用

目的探讨粘附分子P-选择素与树突状细胞(DC)在大鼠单侧输尿管梗阻后肾组织中的表达和分布,以及抗P-选择素单抗的抗粘附凋抑作用.方法建立大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型,随机将大鼠分为手术组和抗P-选择素单抗治疗组各18只,按不同梗阻时间(1、3、7 d)再分为3组,另设假手术组(n=6)作为对照.分别采用免疫组化LSAB法和免疫双染与荧光图像分析法,观察P-选择素及DC在肾组织中表达和分布变化.结果大鼠UUO第l d起即见P-选择素以肾小管上皮细胞为主在肾小管间质中表达上调,伴随CDl a+CD80+DC在以肾间质为主部位的浸润;第3dP-选择素明显表达,且CDla+CD80+DC显著增多;至第7 d P-选择素表达遂下调,而CDla+CD80+DC在肾间质分布聚集达峰,出现了明显的肾小管间质病理损伤.经抗P-选择素单抗处理后,大鼠肾组织P-选择素表达受到抑制,CDla+CD80+DC分布聚集减少,且肾小管间质病理损伤减轻.结论提示树突状细胞参与了肾小管间质纤维化早期病理损伤过程,其肾组织迁移聚集可能与P-选择素早期介导有关,抗P-选择素单抗对此具有抗粘附调抑和肾脏保护作用.     

树突状细胞在大鼠单侧输尿管梗阻后肾组织中的分布与作用

目的 探讨粘附分子P-选择素与树突状细胞(DC)在大鼠单侧输尿管梗阻后肾组织中的表达和分布,以及抗P-选择素单抗的抗粘附调抑作用。方法 建立大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型,随机将大鼠分为手术组和抗P-选择素单抗治疗组各18只,按不同梗阻时间(1、3、7d)再分为3组,另设假手术组(n=6)作为对照。分别采用免疫组化LSAB法和免疫双染与荧光图像分析法．观察P-选择素及DC在肾组织中表达和分布变化。结果 大鼠UUO第1d起即见P-选择素以肾小管上皮细胞为主在肾小管间质中表达上凋．伴随CD1a^ CD80^ DC在以肾间质为主部位的浸润;第3dP-选择素明显表达．且CD1a^ CD80^ DC显著增多：至第7dP-选择素表达遂下凋．而CD1a^ CD80^ DC在肾间质分布聚集达峰,出现了明显的肾小管间质病理损伤。经抗P-选择素单抗处理后,大鼠肾组织P-选择素表达受到抑制,CD1a^ CD80^ DC分布聚集减少,且肾小管间质病理损伤减轻。结论 提示树突状细胞参与了肾小管间质纤维化早期病理损伤过程,其肾组织迁移聚集可能与P-选择素早期介导有关,抗P-选择素单抗对此具有抗粘附凋抑和肾脏保护作用。     

血小板第四因子对CD34+白血病细胞系KG1a粘附功能的影响

目的研究血小板第四因子(PF4)对CD34 白血病细胞系KG1a细胞与人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞之间粘附性及对多种粘附分子表达的影响。方法采用粘附实验、粘附阻断实验、MTT染色、半定量RT-PCR、免疫标记流式细胞仪测定等方法。结果穴1雪PF4可以增加KG1a细胞与ECV-304细胞之间的粘附作用。PF4与KG1a及ECV-304细胞同时孵育或与KG1a或ECV-304细胞单独孵育,均使KG1a细胞粘附能力增加。穴2雪抗粘附分子CD49d、CD106、CD54单克隆抗体可显著减少PF4对KG1a粘附的增加作用,而抗粘附分子CD62L、CD62E、CD62P单抗则对PF4的这种增加粘附的作用没有影响。穴3雪在PF4作用的3h内,半定量RT-PCR检测粘附分子CD49d、CD106、CD54mRNA表达水平有不同程度的上调。(4)PF4作用2h后,流式细胞仪分析显示KG1a细胞上的CD49d、ECV-304细胞上的CD54蛋白表达水平显著增加。结论PF4通过上调粘附分子的表达促进KG1a细胞的粘附功能。     

血管内皮细胞氧化应激损伤对骨髓间质干细胞趋化作用的体外观察

目的 探讨氧化应激损伤血管内皮细胞定向趋化人骨髓间质干细胞(hMSC)的可能性.方法 体外分离和培养hMSC,分别加入不同条件培养基进行成脂肪细胞、成骨细胞和成血管内皮细胞诱导分化;以免疫组织化学染色和流式细胞仪检测hMSC抗原表达.利用人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞建立氧化应激损伤趋化hMSC的细胞模型:在Transwell培养板下腔接种5×105 ECV-304细胞并用3%H2O2(终浓度为0.01 ml/ml)处理1 h后,上腔内接种1×105 hMSC,为损伤细胞+hMSC组;同时设未损伤细胞+hMSC组(Transwell板下腔接种未经H2O2处理的ECV-304细胞,上腔内接种hMSC)和单纯hMSC组(Transwell板下腔不接种ECV-304细胞)作为对照.培养12 h后苏木精染色,倒置相差显微镜下计数各组细胞Transwell上腔迁移的hMSC数.另以酶联免疫吸附试验检测H2O2处理1 h的ECV-304细胞(H2O2处理组)和未予H2O2处理ECV-304细胞(对照组)培养上清液中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)浓度.结果 hMSC经加入不同条件培养基诱导后可以分化为脂肪细胞、成骨细胞和血管内皮细胞.免疫组织化学染色和流式细胞仪检测显示hMSC CD29、CD44、CD90和CD106抗原呈阳性表达,CD31、CD34、CD45和CD49b抗原呈阴性表达.损伤细胞+hMSC组发生迁移的hMSC数为(8.00±0.22)个/高倍视野,明显高于未损伤细胞+hMSC组[(0.20±0.05)个/高倍视野,P<0.01]和单纯hMSC组[(0.00±0.00)个/高倍视野,P<0.01].H2O2处理组细胞培养上清液中MCP-1和VCAM-1浓度分别为(69.2±3.5)、(114.0±7.5)ng/ml,均明显高于对照组[(62.5±3.6)ng/ml,P<0.05;(97.2±5.0)ng/ml,P<0.01].结论 血管内皮细胞氧化应激损伤可趋化hMSC定向迁移到损伤血管,其机制可能与氧化应激损伤导致的趋化因子MCP-1和VCAM-1浓度升高有关.     

从受体角度探讨黄芩苷对肺炎衣原体感染细胞的干预机理

【目的】观察黄芩苷对肺炎衣原体诱导的TOLL受体(TLRs)的影响。【方法】体外培养人脐静脉内皮细胞(ECV-304细胞)，待长成单层后加入肺炎衣原体(CPN)为模型组，不加任何刺激者为正常组，每组设3个复孔，6孔板培养2d后，用单克隆抗体荧光标记和姬姆萨染色检测肺炎衣原体在ECV-304细胞内的生长情况；用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达。另取长成单层的ECV-304细胞，加入CPN为模型组，加入CPN 黄芩苷0．48g／L为黄芩苷高剂量组，加入CPN 0．24g／L为黄芩苷低剂量组，用流式细胞仪检测ECV-304细胞表面TLR2蛋白表达。【结果】CPN能在ECV-304细胞内生长；该细胞检测不出TLR4 mRNA的表达，存在TLR2 mRNA和TLR2蛋白的高表达。中药黄芩苷高剂量可降低TLR2蛋白的表达。【结论】黄芩苷对CPN所刺激的TLR2高表达具有抑制作用。     

巨噬细胞对血管内皮细胞增殖、Hoxb2、血管内皮生长因子受体和整合素ανβ3表达的影响

目的 建立人巨噬细胞系U937与人脐静脉血管内皮细胞系ECV-304体外共培养模型,以刀豆蛋白A(ConA)作为U937激活剂,研究巨噬细胞调节血管生成的机制。方法 实验分4组:ECV-304、ConA+ECV-304、U937+ECV-304和ConA+U937+ECV-304。将ECV-304细胞接种,待60%融合时按照不同的分组进行共培养48h后,流式细胞仪检测细胞周期的变化;采用3H-TdR掺入试验检测内皮细胞DNA合成变化;RT-PCR技术检测内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR和同源盒(homebox)Hoxb2基因mRNA表达水平的变化;免疫荧光在流式细胞仪上检测整合素受体ανβ3表达的变化。结果 ConA激活的U937细胞可使内皮细胞S期、DNA合成明显增加(P<0.01);ConA刺激的U937细胞使内皮细胞VEGF受体KDR(0.879±0.003)、Hoxb2基因mRNA的表达水平(0.947±0.003)和整合素受体ανβ3的表达水平(10.26±1.73)明显上调(P<0.01)。结论 ConA活化的巨噬细胞可通过影响内皮细胞的细胞周期、DNA合成、VEGF受体KDR、Hoxb2及整合素受体ανβ3的表达来促进内皮细胞的增殖、迁移及与基质的黏附,从而调节血管的生成。     

巨噬细胞对血管内皮细胞增殖、Hoxb2、血管内皮生长因子受体和整合素αvβ3表达的影响

OBJECTIVE: To explore the mechanism by which macrophages regulate angiogenesis by co-culturing human umbilical vein endothelial cells (ECV-304) with human macrophage cells (U937) stimulated by concanavalin A (ConA). METHODS: Monolayer ECV-304 cells growing to 60% confluence were co-cultured with 1 x 10(5)/ml U937 cells in the presence or absence of ConA (ConA+U937+ECV-304 and U937+ECV-304 groups, respectively), with non-treated and ConA-treated ECV-304 cells serving as the control groups (ECV-304 and ConA+ECV-304 groups, respectively). Forty-eight h later, U937 cells were removed from the cell co-culture for examining changes in DNA synthesis of ECV-304 cells with (3)H-TdR incorporation assay and for cell cycle analysis with flow cytometry. RT-PCR was employed to assess the influence of macrophages stimulated by ConA on the expression of the target genes. With immunofluorescent method, the changes in the expression of integrin receptor alphavbeta3 of ECV-304 were determined. RESULTS: A significant increase in S-phase ECV-304 cells with enhanced DNA synthesis was observed after co-culture of the cells with ConA-stimulated U937 cells (P<0.01), which also resulted in significant up-regulation of the expressions of KDR mRNA (0.879+/-0.003), Hoxb2 mRNA (0.947+/-0.003) and integrin receptor alphavbeta3 (10.26+/-1.73). CONCLUSION: Macrophages can accelerate the proliferation, migration and adhesion of the vascular endothelial cells to the basilar membrane matrix by affecting their cell cycle, DNA synthesis, expression of KDR mRNA, Hoxb2 mRNA and integrin alphavbeta3, so as to modulate the angiogenetic process of the latter cells.     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的构建人CD40的真核表达载体,建立持续﹑稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后,再克隆到真核表达载体pCDNA3.1中,构建重组质粒pCDNA3.1( )/CD40,并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304,G418筛选转染的细胞。RT-PCR﹑Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果经酶切鉴定,重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实,重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达,流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95%。结论成功构建了真核表达载体pCDNA3.1( )/CD40,并建立了高表达CD40的ECV-304,为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础。     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的 构建人CD40的真核表达载体，建立持续、稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法 将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后，再克隆到真核表达载体pCDNA3．1中，构建重组质粒pCDNA3．1（＋）／CD40，并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304，G418筛选转染的细胞。RT-PCR、Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果 经酶切鉴定，重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实，重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达，流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95％。结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3．1（＋）／CD40．并建立了高表达CD40的ECV-304，为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础.