双功能逆转录病毒载体介导耐药基因转染人脐血CD34+细胞能增强联合化疗抗性

目的　为探讨转染醛脱氢酶基因 (ALDH1)和多药耐药基因 (MDR1)的人脐血CD34 细胞能否同吮增强对活性环磷酰胺 ( 4 HC)和P gp转运泵靶药的抗性。方法　构建了同时含ALDH1和MDR1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na ALDH1 IRES MDR1,经LipofectAMINE介导转染GP E86和PA317包装细胞 ,采用含长春新碱 (VCR)和 4 HC的培养基克隆选择后 ,收集重组病毒上清于单向型与双嗜型包装细胞行乒乓交互感染 ,获得PA317重组病毒生产细胞 (最高滴度达 5 6× 10 5CFU ml) ,将含ALDH1和MDR1耐药基因重组病毒上清在细胞生长因子刺激下重复感染人脐血CD34 细胞。结果　经PCR ,RT PCR ,Southernblot,Northernblot,FACS和MTT方法检测显示外源ALDH1与MDR1基因已经整合入转染靶细胞中基因组并获得有效表达 ,同时传递不同的耐药表型。经耐药基因修饰的脐血CD34 细胞对 4 HC和P gp转运泵靶药同时产生抗性 ,其IC50值分别比未转染细胞高 4倍 ( 4 HC) ,5 5倍 (柔红霉素 DNR)和 7 2倍 (VCR)。结论　双功能逆转录病毒载体介导两种不同耐药基因转染人脐血CD34 细胞能增强联合化疗抗性 ,本基因转移系统的建立为开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础。     

人野生型p53基因与逆转录病毒载体的构建及转染

应用逆转录病毒为载体构建了含人野生型ｐ５３基因的重组质粒，并成功地转染ψｃｒｉｐ包装细胞。本实验应用ＰＬＸＳＮ为载体，１．８ｋｂ野生型ｐ５３基因作为插入片段，通过Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶进行连接。用〔α—￣（３２）Ｐ〕ｄＣＴＰ标记野生型ｐ５３基因片段（１．８ｋｂ）为探针进行原位杂交。筛选出重组体，将其命名为ＰＬＸＳＮ－５３，然后用该重组体对ψｃｒｉｐ包装细胞进行转染。收集转染后的细胞，准备下一步感染ｐ５３突变细胞株研究之用。该质粒的构建和细胞转染实验为进一步研究野生型ｐ５３基因的抑癌作用及其表达与调控原理奠定了基础。     

MDR1基因RNAi逆转录病毒载体的构建及表达

目的：构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA（MDR1）,并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法：根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和测序分析后,再转染293T包装细胞产生病毒颗粒后感染MCF-7/ADR细胞。 用RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,Western blotting测定转染后MCF-7/ADR细胞中P-gp蛋白的表达量。结果：重组MDR基因沉默载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析证实插入60 bp序列与原序列一致,位置正确;与对照组比较,转MCF-7/ADR细胞后RT-PCR结果显示MDR mRNA水平明显下降,Western blotting显示P-gp蛋白表达量明显降低。结论：逆转录病毒MDR1基因沉默载体构建成功,并在MCF-7/ADR细胞中起到抑制MDR1基因表达的作用。     

携HBx基因逆转录病毒载体的构建

【目的】构建携HBx基因的逆转录病毒载体 ,为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因 ;将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX ,构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙 DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317,检测培养上清病毒滴度。【结果】应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株PA317/HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9× 10 4 CFU ,PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。     

人MCPH1基因shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法: 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSiRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSiRNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

表达人生长激素的逆转录病毒载体的构建

目的：建立一个表达人生长激素（hGH)的重组逆转录病毒载体转移系统，为下一步研究做准备工作。方法:通过重组DNA技术，用Eco R I酶切载有人生长激素的质粒pNMG3，获得约3.9kb的小鼠金属硫蛋白启动子（mMT-1)和人生长激素（hGH)基因片段，将其亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN中。对阳性重组子LXSNhGH进行酶切和PCR鉴定。利用目的基因片段上的Bg/Ⅱ和载体pLXSN的多克隆位点中的Bam H I酶切位点双酶切，正向重组子pLXSNhGH^ 应能产生约0.8kb和9.0kb2个片段；同时，应用巢式PCR鉴定目的片段，扩增片段大小约1.119kb，与预期结果相符。结果：表明人生长激素逆转录病毒表达载体构建成功。结论：人生长激素逆转录病毒表达载体的构建成功为GHD基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

逆转录病毒载体介导的人IFN—r基因在膀胱癌细胞中的表达

逆转录病毒载体介导的人ＩＦＮ－ｒ基因在膀胱癌细胞中的表达辛军王晓雄王鑫冯东晓李春海孟书礼本课题为“九五”全军医药卫生科研基金资助项目作者单位：１００８５３北京中国人民解放军总医院泌尿外科（辛军、王晓雄、孟书礼）；中国人民解放军军事医学科学院基础医学研...     

以逆转录病毒为载体进行肝脏基因转染的研究进展

自 1992年对家族性高胆固醇血症病人进行第 1例肝脏疾病基因治疗以来 ,对肝脏疾病基因治疗的研究已经成为目前国内外研究的热点之一。肝脏是体内多种物质的主要代谢场所 ,并能合成多种血浆蛋白质 ,且具有强大的再生能力 ,因而肝脏是基因治疗理想的靶器官。许多肝脏疾病 ,特别是由于单基因缺陷所致的代谢性疾病 ,为肝脏基因治疗的理想疾病 ,如α1 胰蛋白酶缺陷症、遗传性酪氨酸血症、Ｃｒｉｇｌｅｒ Ｎａｊｊａｒ综合征等 ,为肝脏疾病的基因治疗提供了广阔的应用前景。1　基因转染的载体载体是治疗性遗传物质的携带者或运输工具 ,理想的治疗…     

含人白细胞介素-2基因逆转录病毒载体系统的建立及转染人白血病细胞株的研究

应用逆转录病毒载体LNCIL－2介导人白细胞介素（IL）－2基因经包装细胞PA317包装成重组病毒后，转染人白血病细胞株K562、HL－60，经G418筛选获阳性克隆，阳性克隆上清表达IL－2活性。转染后细胞经Southern检测存在新霉素抗性基因（neoR）。转染IL－2基因的白血病细胞生长速度、克隆形成率均落后于转染空载体或未转染基因的细胞。表明含人IL－2基因逆转录病毒载体系统已成功建立，转染人IL－2基因的白血病细胞增殖活性下降。     

人midkine基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建人中期因子(MDK)基因重组逆转录病毒载体,转染人胃癌SGC7901细胞株,为探讨MDK的生物学功能奠定基础.方法 扩增人MDK编码序列基因片段,经限制性内切酶酶切后将目的 片段插入pLXSN逆转录病毒载体.经酶切及测序鉴定后与pVSVG共转染GP293包装细胞,收集病毒上清感染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得阳性细胞株.,结果酶切及DNA测序证实MDK基因重组逆转录病毒载体构建正确.病毒上清感染SGC7901细胞,G418筛选出阳性克隆,经实时定量PCR及Western blot检测发现SGC7901细胞中MDK mRNA及蛋白表达水平明显上调.结论 成功构建了高表达MDK的SGC7901细胞株,为进一步探讨其生物学功能奠定实验基础.     

逆转录病毒介导的野生型p53基因转入对慢粒多药耐药细胞？…

以Ｋ５６２／ＨＨＴ细胞为模型,采用重组逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将人野生型Ｐ５３ｃＤＮＡ转入该细胞系,研究外源性野生型Ｐ５３基因在白血病多药耐经细胞表达的意义。结果显示,外源性野生型Ｐ５３基因抑制细胞增殖,一般形态学观察见细胞明显向成熟发化,流式细胞仪分析还显示Ｐ５３基因诱导Ｋ５６２／ＨＨＴ细胞死亡且伴有细胞周期Ｇ１基因的生长阻滞,结果表明,野生型Ｐ５３基因对多药耐药的白血病细胞能部分降低     

HBx基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础.方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因.将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中.酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达.Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达.结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体.     

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的构建葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础.方法质粒pCMV4-GKZ1经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX-GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染PLX-GK至包装细胞PA317,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定.结果构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX-GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317/GK,其培养上清平均病毒滴度为6.8×105cfu/ml,最高为1.8×106cfu/ml,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA317/GK细胞基因组并有GK的表达.结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系.     

含HSV—tk基因的人大肠癌特异性逆转录病毒载体的构建

为使自杀基因在大肠癌细胞中特异性表达，以达到靶向基因治疗的目的，首先构建以ＣＥＡ基因转录调控序列驱动的重组逆转录病毒载体。将目的基因片段ＨＳＶ－ｔｋ定向克隆入ｐＵＣ１１８质粒载体中，以相应的内切酶取出原酶切片段后，与来自ｐＣＥＡ４２４／２ＣＡＴ质粒的ＣＥＡ５‘Ｌ志录调控充列相连接，克隆入逆转录病毒载体中。     

表达反义N－myc基因逆转录病毒载体的构建

表达反义Ｎ－ｍｙｃ基因逆转录病毒载体的构建陈杰，刘彤华，王志永，崔全才，李和伟，郭洪涛，高洁（中国医学科学院，中国协和医科大学协和医院，北京１００７３０）关键词逆转录病毒载体；Ｎ－ｍｙｃ基因中图号Ｒ７３０．２Ｎ－ｍｙｃ癌基因是ｍｙｃ族癌基因的重要成员...     

携带HSV—tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体。切除逆转录病毒病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ＰＭＮＭ；从真核表达载体ＰＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ＰＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮＰ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ＰＧＥＭ，７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ＰＭＮＰ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建