CD14高表达单核细胞系白血病细胞体外诱导培养树突细胞及其免疫功能研究

树突细胞(DC)作为一种功能最强的抗原呈递细胞，具有很强的激发初始T细胞(naive T cell)应答能力。利用细胞因子组合将白血病细胞分化为DC或DC样细胞，对克服白血病细胞的免疫逃避机制，逆转机体的免疫耐受，诱导特异抗白血病免疫等具有重要意义。但由于白血病细胞所属系列及分化程度的异质性，存在多方面的缺陷，并不能从所有的白血病细胞中成功诱导出DC。正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中CD14^ 胞可以在GM-CSF IL-4的诱导下分化为CD1α^ CD14^-的DC，称单核细胞衍生的DC(Mo-DC)，我们推测高表达CD14的单核系白血病(包括M4、M5)细胞是否同样可在该细胞因子组合作用下诱生出单核系白血病细胞来源的树突细胞(Mo-LDC)。我们选择CD14高表达的M4、M5患分离骨髓单个核细胞(BMMNC)，比较在GM-CSF TNF-α或GM-CSF IL-4 TNF-α组合作用下，CD14^ 黏附细胞与CD14^-的非黏附细胞向DC分化的能力。     

Daudi细胞CD40和CD40配体的共表达及其生物学意义

CD40抗原是属于TNFR超家族的细胞表面分子，广泛表达于B淋巴细胞的所有发育和分化阶段和一些其它特定细胞类型上。B细胞表达的CD40分子主要通过与表达在活化CD4T细胞上的CD40配体（CD40L）相互作用传递信号，从而调控B细胞的分化，特别是免疫球蛋白（Ig）的同型转换和生发中心（GC）的形成。我们首先检测CD40抗原和CD40L在细胞表面的表达和分布情况，然后分别用CD40和CD40L的阻断性抗体阻断这对信号，观察对细胞生长、增殖和凋亡的影响。     

激发型CD28单抗参与诱导的CIK细胞及其表型特征

目的研究激发型CD28单抗参与诱导的CIK的扩增能力及细胞表型特征。方法采用Ficoll分离法获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),调整浓度为2×106/mL后,接种于24孔培养板,1mL/孔。按以下2组添加诱导剂:1)抗-CD3+IL-2+IFN-γ;2)抗-CD3+抗-CD28+IL-2+IFN-γ。诱导剂的终浓度抗-CD3为1μg/mL、抗-CD28为0.5μg/mL、IL-2为0.1万U/mL、IFN-γ为100ng/mL。隔2d换液,培养至d7,经全自动血细胞计数仪计算各孔细胞总量。采用免疫荧光单标记法分析CIK表面CD4+、CD8+及CD56+的表达,免疫荧光双标记法分析CIK表面CD4+/CD25+、CD8+/CD25+、CD4+/FasL+、CD8+/FasL+的表达。结果培养至d7,激发型CD28单抗组CIK的细胞总量为(78.2±7.3)×106/孔,明显高于对照组的(27.8±2.7)×106/孔,差异具有统计学意义(P<0.05)。单标记法的分析结果显示,激发型CD28单抗参与的CIK中CD4+细胞、CD8+细胞及CD56+细胞分别为(68.4±6.1)%、(34.6±7.2)%及(15.1±3.9)%,与对照组的(52.5±3.6)%、(26.9±2.7)%及(7.7±1.2)%比较均具有显著统计学差异(P<0.05)。双标记法的分析结果显示,激发型CD28单抗参与诱导的CIK细胞中CD4+FasL+T细胞、CD8+FasL+T细胞、CD4+CD25+T细胞及CD8+CD25+T细胞比例分别为(36.6±4.7)%、(40.7±3.2)%、(60.1±5.3)%及(58.5±4.1)%。与对照组的(21.9±3.9)%、(24.3±5.1)%、(45.6±4.6)%及(44.6±3.4)%比较均具有统计学意义(P<0.05)。结论激发型CD28单抗可增强CIK的扩增能力及上调细胞活化膜型分子的表达,提示激发型CD28单抗可具有提高CIK杀瘤能力。     

Flt3配体诱导急性淋巴细胞白血病来源树突细胞及其功能的研究

树突细胞 (DC)是迄今为止已知功能最强的抗原呈递细胞 (APC) ,白血病细胞来源的DC因能表达与异常染色体相关的白血病抗原 ,产生特异性的抗白血病细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)效应而成为新型的DC来源[1] 。fms样酪氨酸激酶3配体 (Flt3 L)具有强大的刺激多能造血干细胞增殖的能力 ,是又一新兴的解决骨髓造血功能衰竭状态和肿瘤生物治疗的生长因子[2 ] 。我们收集急性淋巴细胞白血病 (ALL)初治及复发患者骨髓单个核细胞 (MNC) ,采用Flt3 L单因子培养 ,并分别加用TNF α和IFN α活化 ,通过流式细胞仪分析其表型特点 ,并行染色体检查DC…     

CD40激发对恶性B淋巴细胞体外生物学行为的影响

目的 观察重组人可溶性CD40配体（rhsCD40L)及CD40L基因转染细胞（CD40L-TC）对恶性B淋巴细胞体外生物学行为的影响，探讨rhsCD40L在肿瘤生物治疗中的可能作用。方法 利用基因工程技术获得了rhsCD40L和CD40L-TC，分别与恶性B淋巴细胞株XG2，XG7，U266，8226，Raji及Daudi共同作用，分析了CD40激发对肿瘤细胞的体外增殖（锥虫蓝计数法），细胞周期（碘化丙锭掺入法），细胞表面共刺激分子的表达（免疫荧光标记法）以及细胞凋亡（Anexin-V-ETTC法）的效应。结果 （1）恶性B淋巴细胞株CD40表达呈异质性，XG2高表达CD40，8266，Raji和Daudi中度表达，而XG7和U266不表达CD40。显微镜下观察发现，rhsCD40L(5μg/ml）可引起XG2或Daudi细胞的同型聚集，该效应在作用6-8h后即可出现；与CD40L-TC细胞共育后（肿瘤细胞；CD40L-TC=5：1），XG2，Raji和Daudi细胞可粘附于CD40L-TC表面；（2）rhsCD40L和CD40L-TC均可显著抑制XG2，Raji和Daudi细胞的体外增殖，导致XG2细胞呈现G1期阻滞，而Raji和Daudi细胞阻滞于G2期，并诱导XG2，Raji,Daudi细胞的凋亡，凋亡率分别为：XG2细胞23.3%和18.8%,Raji细胞阻滞于G2期，并诱导XG2，Raji,Daudi细胞的凋亡，凋亡率分别为：XG2细胞23.3%和18.8%,Raji细胞11.6%和8.9%,Daudi14.2%和15.9%;(3)表型分析显示；rhsCD40L/CD40L-TC可明显上调XG2,Raji和Daudi细胞CD95的表达水平以及Raji细胞CD80的表达，而下调Raji细胞CD18的表达。结论 rhsCD40L能直接并显著地抑制恶性B淋巴瘤细胞株Raji,Daudi和多发性骨髓瘤细胞株XG2的体外增殖，诱导其凋亡，并上调Raji细胞免疫共刺激株Raji,Daudi和多发性骨髓瘤细胞株XG2的体外增殖，诱导其凋亡，并上调Raji细胞免疫共刺激分子CD80的表达，具有膜型CD40L的同样生物学功能，故rhsCD40L具有潜在的抗恶性B淋巴细胞肿瘤的作用。     

虫草多糖对慢性粒细胞白血病来源的树突细胞发育的影响

能否通过免疫途径清除慢性粒细胞白血病（CML）恶性克隆，已引起许多学者重视。树突细胞（DC）作为体内功能最强的抗原呈递细胞（APC），在体内外均能够刺激辅助性T细胞及细胞毒性T细胞显著增殖，在白血病的免疫治疗中发挥关键作用，我们已经在前期的研究中成功地诱导了CML来源的DC，但是其功能较弱，限制了其应用。我们将虫草多糖与DC结合起来，试图从DC的角度阐明虫草抗白血病的机制，探讨白血病治疗的新途径。     

CD34阳性慢性粒细胞白血病细胞生物学特征及其意义

慢性粒细胞白血病是源于骨髓造血干细胞恶性增殖的克隆性疾病。其CD34抗原阳性伴bcr／abl融合基因阳性的白血病细胞具有独特的生物学特征，并与病情进展及转归相关。清除CD34阳性慢性粒细胞白血病细胞有助于防止疾病复发。本文就其近年来的研究进展作一综述。     

流感疫苗对急性髓系白血病患者骨髓细胞来源树突细胞功能的影响

树突细胞(DC)因其强大的抗原呈递功能,具有激活针对肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用,已成为白血病及肿瘤生物治疗的重要研究领域。白血病细胞来源的DC携带有自体已知或未知的多个肿瘤抗原,在HLA限制性和肿瘤特异性上具有独特的优势。将白血病DC作为疫苗回输体内以清除微量残留病(MRD)已显示出可喜的临床效果。但DC的抗原呈递功能依赖其成熟,应用有效佐剂组合对DC进行成熟调控从而增强其抗肿瘤效应是目前需要     

CD3AK细胞对耐药白血病细胞的体外杀伤作用

肿瘤生物治疗是近年来肿瘤治疗中的重要进展之一 ,其中采用免疫效应细胞 ,如ＬＡＫ细胞、ＴＩＬ、ＣＤ3 ＡＫ、ＣＩＫ、ＣＴＬ等进行的过继免疫治疗在某些肿瘤的治疗中取得了一定疗效。ＣＤ3 ＡＫ细胞是由抗ＣＤ3 单抗联合小剂量ＩＬ 2激活的Ｔ细胞 ,增殖能力和杀伤力较强。我们在实验中观察了ＣＤ3 ＡＫ细胞对耐药的白血病细胞株及慢性髓系白血病 (ＣＭＬ)急变患者原代肿瘤细胞的体外杀伤作用。材料和方法1　材料　正常人外周血由健康男性提供 ;ＣＭＬ急变患者骨髓由附属医院血液科提供。Ｋ5 6 2、ＨＬ 6 0、Ｋ5 6 2 ＶＣＲ细胞系由上海血…     

环孢素对小鼠树突细胞体外成熟及同种免疫刺激活性的影响

目的：观察环孢素（cyclosprine A，CSA）对小鼠树突状细胞（dendritic cell，DC）体外成熟和免疫学功能的影响，以期进一步探讨CSA免疫抑制作用机理。方法：在小鼠DC体外培养时加入两种剂量（0．5μg／ml和1．0μg／ml）的CSA处理，观察DC的生成情况，以流式细胞仪分析各处理组细胞的免疫表型，并作体外混合淋巴细胞反应观察其对同种T细胞的刺激增殖能力。结果：经CSA培养后，DC的生成和形态没有影响，表达低水平的共刺激分子CD40，CD80，DC的抗原呈递功能和刺激同种T细胞的功能显著下降。绪论：CSA在早期阶段干扰免疫应答是通过影响DC的活化而实现，DC是CSA最初的作用位点。     

人参皂苷Rg3促树突状细胞诱导作用的实验研究

目的 研究人参皂苷Rg3联合细胞因子对单核细胞来源树突状细胞(DC)的诱导及其免疫功能的影响.方法 选取8例健康志愿者分离外周血单核细胞,利用人参皂苷Rg3联合细胞因子(GM-CSF、IL-4、TNF-α)培养14 d诱导DC,光镜和电镜观察细胞形态,用流式细胞仪检测细胞免疫表型,同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)检测其抗原呈递能力.结果 (1)单核细胞经人参皂苷Rg3联合细胞因子诱导均产生了不同比率的具有树突状细胞形态学特征的DC.这些细胞表达DC的表面分化抗原,能刺激产生MLR反应.(2)Rg3(5.0 μg/ml)联合细胞因子(GM-CSF 150 ng/ml,IL-4 50 ng/ml,TNF-α 40 ng/ml)使单核细胞-DC获得率(以CD80、CD86双阳性定义DC)由43.31%提高到59.75%,并提高了DC刺激淋巴细胞的增殖能力.结论 人参皂苷Rg3联合细胞因子可以将正常人单核细胞体外诱导成为形态、表型和功能符合DC特征的细胞,可使单核细胞诱导DC产率增加,并提高其抗原呈递功能.     

树突细胞分泌的exosomes生物学特性及功能的初步研究

目的建立树突细胞（DC）分泌的exosomes的制备方法，分析其生物学特性及其在抗肿瘤免疫中的功能。方法从正常人外周血单个核细胞中诱导未成熟DC（imDC），并使其负载K562细胞的抗原，然后用脂多糖（LPS）诱导DC成熟（mDC），通过超速离心结合膜超滤的方法分别提取imDC和mDC分泌的exosomes。检测exosomes的粒径并通过电子显微镜分析exosomes的形态，Western blot法检测exosomes的表面分子。比较mDC和imDC分泌的exosome8引起的针对K562抗原特异性T细胞的增殖、CD69的上调、细胞因子IFN．1的分泌及对肿瘤细胞的杀伤能力。结果制备的exosomes为碟状小囊泡，平均直径为72．3nm，表达CD80、CD86、HLA．DR、FasL、CD54和乳脂肪球-表皮生长因子-因子Ⅷ（MFG-E8）。与imDC相比，mDC分泌的exosomes CD80表达较高而MFG-E8的表达较低，并且在体外mDC分泌的exosomes能够更显著地引起特异性T细胞的增殖和免疫应答：在exosomes最适浓度下，T细胞增殖的吸光度值为O．50±0．01，激活T细胞的CD69上调，并且有（13．4±5．8）％T细胞扩增，（22．8±2．4）％的T细胞产生细胞因子IFN-1，对肿瘤细胞的杀伤率为（21．3±8．6）％。结论建立了简便、快速的exosomes分离纯化方法，所分离的exosomes具有引起抗肿瘤免疫应答的功能     

抑制VEGF表达对白血病来源树突状细胞免疫功能的影响

目的：探讨抑制血管内皮生长因子（VEGF）对白血病来源树突状细胞（Dc）免疫功能的影响。方法：利用反义寡核苷酸下调K562白血病细胞VEGF表达，K562细胞经细胞因子作用诱生白血病DC。利用MTT法检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤活性；ELISA法检测DC培养上清液中IL-12及DC与外周血单个核细胞（PBMNC）共同培养液中IFN-γ的含量。结果：K562细胞经5μmol／LVEGF反义寡核苷酸处理24h后VEGF蛋白分泌下降59％，其诱生的DC与正常K562来源的DC相比，实验组DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL-12和协同刺激外周血单个核细胞分泌TNF-γ的能力明显增强。结论：抑制VEGF表达可促进白血病来源DC免疫功能的成熟。     

可溶性抗CD47单抗对人树突细胞分化与功能的影响

目的探讨抗CD4 7可溶性单抗B6H12对树突细胞分化及功能的影响。方法利用rhGM CSF、IL 4、细菌脂多糖 (LPS)组合在体外诱导人外周血单核细胞为树突细胞 ,并在培养体系中添加单抗B6H12。以透射电镜观察树突细胞形态 ,流式细胞术分析树突细胞膜表面分子表达。半定量RT PCR法及ELISA法分别检测树突细胞IL 12mRNA表达水平及蛋白质含量。Brdu ELISA法检测树突细胞刺激同种异型淋巴细胞增殖能力。结果树突细胞膜表面有CD4 7高表达 (94 %～ 98% )。B6H12单抗处理的树突细胞组与未加B6H12单抗组比较 ,CD80 细胞为 (6 8.14± 7.4 1) %vs(89.17± 8.5 9) % ;CD86 细胞为 (6 7.33± 4 .71) %vs(87.2 7± 3.5 6 ) % ;CD83 细胞为 (40 .0 8± 14 .80 ) %vs(72 .77± 8.6 8) % ;CD1a 细胞为 (6 6 .4 5± 4 .0 6 ) %vs(95 .93± 3.0 3) % ,HLA DR 细胞为 (40 .6 7± 13.4 8) %vs(98.97± 1.0 1) %。B6H12单抗显著地下调树突细胞IL 12mRNA及IL 12 P70 表达水平 (P <0 .0 5 ) ,且Brdu掺入量也显著的降低 (P <0 .0 1)。结论　可溶性CD4 7单抗能影响人树突细胞向成熟分化 ,并抑制其功能。     

树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞增殖和抗白血病作用影响的研究

目的探讨树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平以及抗白血病细胞作用的影响。方法健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)的水平。结果DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05);DC、CIK细胞共培养后,CD3 CD8 、CD3 CD56 双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05);共培养3d,DC-CIK细胞上清液中IL-12I、NF-γ分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01,P<0.05);在5∶1~40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关。结论DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性。可作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略。     

咯利普兰对哮喘小鼠肺部树突状细胞数量的影响

目的:研究选择性磷酸二酯酶4抑制剂(咯利普兰)对哮喘小鼠肺部树突状细胞(DC)数量的影响。方法:BALB/c小鼠24只随机分为3组,即对照组、哮喘组、咯利普兰组。采用免疫组织化学染色技术检测小鼠肺、气道树突状细胞;计算机图像分析技术对树突状细胞进行定量测定。结果:对照组小鼠的气管、支气管、肺泡和脏层胸膜构成了一个完整的NLDC-145+DC网络,对照组肺内NLDC-145+DC数量为(60±14.6)个/mm2上皮面积;哮喘组小鼠肺内NLDC-145+DC数量(210±35.6)个/mm2,较对照组显著增加(P<0.01);哮喘小鼠经咯利普兰处理后,肺内DC数量明显低于未处理的哮喘组犤(88±24.3)个/mm2vs(210±35.6)个/mm2犦。结论:树突状细胞参与了哮喘的气道炎症过程;咯利普兰可以下调肺哮喘小鼠肺部DC的数量,对哮喘的治疗具有潜在的应用前景。     

人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究

目的探讨从人外周血中大量培养树突状细胞(DC)的方法,并在表型、形态、结构等方面进行鉴定。方法采用5步法从人外周血中大量培养DC:①Ficoll不连续密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC);②RPMI-1640培养基离心洗涤去除血小板;③利用DC前体细胞的短暂粘附性去除悬浮细胞及粘附性较强的细胞;④用重组人白介素4(rhIL-4)、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)自外周血单个核细胞诱导分离DC;⑤用重组人肿瘤坏死因子诱导产生成熟的DC。用荧光显微镜检测DC表面分子的表达,在扫描电镜下观察DC的形态。结果获得了具有典型特征的DC前体细胞,在GM-CSF和rhIL-4协同诱导9 d后,荧光显微镜下可见DC表面CD83、CD40、HLA-DR的表达。扫描电镜观察可见:DC细胞形态不规则,从胞体辐射状伸出数个粗细不等的突起,有的长度可达胞体的2～3倍,长突起存在分叉及汇合现象。在长突起的基部存在大量短小的圆形或椭圆形突起。结论人外周血来源DC的5步培养法可获得较高数量的典型DC,且该法稳定、简便、经济,为DC的临床免疫治疗提供了实验依据。     

The generation of leukemic dendritic cells from acute myeloid leukemia cells is potentiated by the addition of CD40L at the terminal maturation stage

Leukemic dendritic cells (DCs) that are derived from acute myeloid leukemia (AML) cells display low-level expression of several key molecules. We investigated the optimal combination of cytokines needed to generate potent leukemic DCs from AML cells in vitro. AML cells were cultured in the presence of the following combinations of cytokines: Group A, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + interleukin-4 (IL-4) + tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha); Group B, GM-CSF + IL-4 + CD40L; and Group C, CD40L addition at the terminal maturation point of cells that were grown as for Group A. The AML cells showed clear upregulation of CD80, CD83, CD86, CD40, and HLA-DR expression under all culture conditions, without significant differences between these groups. However, the addition of CD40L (as in Group C) showed a slight upregulation in the expression of CD83 and CD86 on leukemic DCs. The leukemic DCs in Groups A and B had higher allogeneic T-cell stimulatory capacities than untreated AML cells, and the addition of CD40L (Group C) enhanced this effect. The function of the cytotoxicity-stimulating autologous T cells was also augmented by the addition of CD40L (Group C). These results suggest that AML cells may be used to generate leukemic DCs using various cytokine combinations, and that the most potent, mature leukemic DCs are generated by the addition of CD40L to terminal-stage AML cultures that are grown in the presence of conventional cytokine combinations.     

慢性粒细胞白血病树突状细胞瘤苗对T淋巴细胞刺激作用的研究

目的　观察细胞因子联合培养诱生的白血病树突状细胞 (DC)表型和抗原提呈功能。方法　慢性粒细胞白血病细胞和K5 6 2细胞应用GM CSF IL 4 TNF α联合培养后进行细胞表型和激活淋巴细胞对白血病细胞杀伤活性的检测。结果　CML DC和K 5 6 2 DC具有DC的形态特征和超微结构 ,表达CD1a、CD80和CD86等DC相关抗原 ,并可激活淋巴细胞产生增殖反应 ,并产生针对白血病细胞的特异性细胞毒性 ,同时此种DC可不同程度地分泌IL 12并协助淋巴细胞产生IFN γ。结论　慢性粒细胞白血病细胞和K5 6 2细胞在细胞因子的诱导下 ,可分化为具有DC形态和功能的特异性抗原提呈细胞。     

新维甲类化合物对早幼粒细胞白血病和正常造血增殖分化作用的体外研究

目的：发掘维甲１号、维甲２号、维甲３号和维甲４号（与全反式维甲酸结构不同的新维甲类化合物）应用价值。方法：在体外研究其对人急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）细胞株ＮＢ４和原代ＡＰＬ细胞诱导分化和克隆增殖的抑制及其对正常造血细胞的促增殖作用。结果：细胞形态学、ＮＢＴ反应、细胞周期动力学和ＣＦＵ－Ｌ克隆形成抑制率等多参数研究表明，新维甲类化合物具有诱导ＮＢ４细胞株和原代ＡＰＬ细胞分化成熟及抑制ＣＦＵ－Ｌ克隆生长的作用，作用强度与结构有关，维甲２号活性较强，明显高于全反式维甲酸及其它新维甲类化合物（Ｐ＜０．０１）。半固体造血祖细胞集落培养研究表明，新维甲类化合物能促进ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｍｅｇ增殖。结论：研制的新维甲类化合物对ＡＰＬ细胞具有诱导分化并对其克隆生长有抑制作用，且能促进正常造血，其中以维甲２号分化作用为突出，进一步研究开发它的临床应用有一定的价值。