xCT调节乳腺癌细胞转移的作用机制研究

目的：探讨xCT调节人类乳腺癌细胞株MDA－MB－231转移的作用及其机制。方法采用细胞划痕实验和Transwell实验分析xCT受到抑制和敲低后,人类高转移乳腺癌细胞株MDA－MB－231迁移及侵袭能力的改变。用Western印迹法和RT－PCR检测其自噬相关标志物LC3,上皮细胞间充质化（ EMT）过程相关标志物钙黏蛋白E （E－cadherin）、波形蛋白（vimentin）以及Snail表达水平的改变。结果抑制和敲低MDA－MB－231细胞株中xCT的表达后,钙黏蛋白E表达升高,波形蛋白表达降低,转录因子Snail的蛋白水平降低,但其 mRNA水平无明显变化,自噬相关蛋白LC3－Ⅱ／LC3－Ⅰ的比值升高。结论抑制和敲低xCT的表达可使MDA－MB－231细胞株发生自噬,降解转录因子Snail,从而抑制EMT,降低MDA－MB－231细胞株的转移能力。     

Bcl-2家族对骨骼肌细胞运动适应性的调控机制研究进展

运动性骨骼肌细胞自噬、凋亡能将氧化应激产生的活性氧(ROS)、受损细胞器、错误折叠蛋白质以及损伤严重的细胞组织等转运到溶酶体中消化降解,以维持肌细胞正常能量代谢、控制炎性损伤,进而提高骨骼肌细胞运动适应性。B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)家族是控制细胞凋亡的主要调节蛋白,也可定位在内质网上靶向调控细胞自噬。近些年,多项研究显示Bcl-2家族协同胞内Ca2+信号、氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化通路、P53基因以及泛素蛋白Atg12等串流在自噬和凋亡之间。本文在总结Bcl-2家族调控骨骼肌运动适应性基础上,重点论述它们对运动性骨骼肌自噬、凋亡的定位和串流调控机制,以期为运动性骨骼肌相关代谢疾病、运动损伤等提供新思路。     

缺氧肠上皮细胞自噬的变化及意义

目的：研究缺氧条件下肠上皮细胞自噬的变化。方法将培养的人肠上皮细胞株Caco-2分为常氧处理组（正常对照组）及缺氧组,缺氧组细胞分别缺氧培养0.5、1、2、6、12及24h。采用蛋白质免疫印迹法检测自噬相关（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）及P62蛋白表达,透射电子显微镜镜观察细胞自噬溶酶体变化,绿色荧光蛋白（GFP）-LC3B融合蛋白示踪肠上皮细胞自噬体形成的变化。结果与正常对照相比较,肠上皮细胞Beclin1和LC3的蛋白表达水平在缺氧0.5h即开始逐渐增加,12h达高峰,24h仍显著高于正常; P62蛋白表达则逐渐降低,24h降至最低;透射电镜下观察到缺氧后肠上皮细胞自噬溶酶体显著增多; GFP-LC3B融合蛋白示踪也显示缺氧后肠上皮细胞自噬体形成非常明显。结论缺氧后肠上皮细胞自噬作用显著增强,可能参与缺氧引起肠上皮细胞损害的调控。     

九节龙皂苷诱导胶质瘤细胞SHG-44MG发生自噬性细胞死亡及其机制研究

目的研究九节龙皂苷（A·DS）诱导人脑胶质瘤细胞SHG-44MG细胞发生自噬性细胞死亡及其机制研究。方法 MTT法检测A·DS对人胶质瘤细胞SHG-44MG增殖的影响,Western blot定量分析自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3的表达。免疫细胞化学定位、定性检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3的表达。结果随着A·DS浓度的增加,SHG-44MG细胞的生存率降低;Western blot结果表明,随着A·DS浓度的增大,SHG-44MG细胞中的自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3的表达明显增加。免疫组化实验结果显示,A·DS可剂量依赖性的促进自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3的表达。结论 A·DS可剂量依赖性的抑制SHG-44MG细胞增殖,通过促进自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3的表达,诱发SHG-44MG细胞发生自噬性细胞死亡。     

DAPK1调控砷化物诱导的细胞自噬反应机制研究

目的 探究死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)在砷化物As203诱导细胞自噬反应中的作用及分子机制.方法 应用As203刺激HepG2细胞后,蛋白质免疫印迹和逆转录PCR实验检测DAPK1、自噬标志性信号分子和DNA损伤调节自噬相关蛋白1(DRAM1)的表达水平及p53活化能力;采用双荧光素酶报告分析实验检测敲低DAPK1后p53的转录激活能力变化情况,流式细胞术检测敲低DAPK1对As203诱导细胞自噬反应的影响.结果 As203刺激能诱导HepG2细胞中DAPK1表达;敲低DAPK1表达显著抑制了细胞自噬反应水平;同时p53的诱导活化反应强度显著下调,但自噬反应特异性p53靶基因DRAM1的表达水平无明显变化.此外,敲低p53表达可显著抑制砷化物刺激作用下DAPK1的诱导表达水平.结论 DAPK1在As203诱导细胞自噬反应中可通过与p53形成正反馈通路实现对自噬信号的放大效应.     

p53凋亡刺激蛋白2在HepG2215细胞中通过抑制自噬来发挥抗乙型肝炎病毒的作用

目的 研究p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)对乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）和乙型肝炎E抗原（hepatitis Be antigen,HBeAg）表达的影响。方法 HepG2.215细胞用3-甲基腺嘌呤处理来抑制自噬,或用人ASPP2重组腺病毒感染来诱导ASPP2过表达,或转染GFP-LC3质粒后观察绿色LC3-Ⅱ颗粒（自噬标志物）的变化。酶联免疫吸附测定检测培养上清和胞内HBsAg和HBeAg的水平、免疫荧光检测LC3-Ⅱ颗粒的水平、免疫印记检测自噬相关蛋白的水平、免疫沉淀检测ASPP2与自噬相关蛋白的结合。结果 ASPP2过表达明显下调了绿色LC3-Ⅱ颗粒的水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比例、以及明显上调p62的水平,说明ASPP2过表达可抑制HepG2.215细胞的自噬。但是ASPP2并非通过抑制Atg5、Atg14和Beclin-1等自噬相关基因的表达来抑制自噬,而是通过与Atg14结合来抑制Atg14与Beclin-1的结合,阻断自噬体膜的形成,从而抑制自噬。抑制自噬和ASPP2过表达均导致培养上清和细胞内的HBsAg和HBeAg水平明显下调,表明在Hep2.215中,ASPP2通过抑制自噬来抑制HBsAg和HBeAg的产生。结论 ASPP2通过抑制自噬的作用具有抗乙型肝炎病毒感染的潜力。     

miR-34a调控HEK293细胞自噬作用的初步研究

目的探讨miR-34a对HEK293细胞自噬作用的影响。方法采用miR-34a模拟物(模拟物组)和miR-34a抑制剂(抑制剂组)分别转染HEK293细胞,并设空白对照(对照组)。采用定量PCR检测miR-34a、p53基因表达的变化,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ及p53表达的变化,并采用生物信息学方法分析miR-34a对自噬相关基因(Atg6/beclin1、sestrin2、FoxO3等)的可能作用。结果定量PCR结果显示,模拟物组miR-34a表达显著上调(P<0.05),抑制剂组miR-34a表达显著下调(P<0.05)。与对照组相比,miR-34a模拟物可显著抑制HEK293细胞LC3Ⅱ蛋白的表达(P<0.05),而miR-34a抑制剂则显著上调HEK293细胞LC3Ⅱ蛋白的表达(P<0.05)。定量PCR和Western blotting结果显示,各组p53mRNA及蛋白表达无统计学差异。生物信息学分析显示,Atg6/beclin1、sestrin2、FoxO3等自噬相关基因是miR-34a潜在的靶基因。结论miR-34a能抑制HEK293的自噬作用,可能是通过直接抑制...     

骨骼肌自噬及运动对其影响机制研究进展

自噬是真核细胞特有的生命现象,它在维持运动骨骼肌蛋白质代谢平衡、代谢废物清除、结构重建等细胞环境稳态方面具有重要作用。研究骨骼肌自噬及其相关基因的上游和下游靶点在调控运动性骨骼肌蛋白质代谢过程中的作用,旨在进一步了解运动性骨骼肌质量变化的分子机制,为治疗与预防骨骼肌萎缩及其相关疾病提供一定的理论依据。     

DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在电离辐射诱发HeLa细胞自噬中的作用

目的：了解DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（ DNA-PKcs）在电离辐射诱发细胞自噬中的作用。方法通过慢病毒载体（ pSicoR ）构建DNA-PKcs短发夹RNA （ shRNA ）表达载体,并转染HeLa细胞敲低DNA-PKcs表达。CCK-8实验检测细胞增殖活性及细胞放射敏感性,免疫印迹检测自噬相关蛋白表达,免疫荧光实验检测自噬标志物GFP-LC3的表达。结果成功构建shRNA敲低DNA-PKcs表达的HeLa细胞模型,通过该细胞模型观察到抑制DNA-PKcs蛋白表达导致细胞增殖能力降低、放射敏感性增高。 P62和LC3蛋白表达变化,以及细胞内绿色荧光蛋白（ GFP）-LC3免疫荧光斑检测结果显示,DNA-PKcs基因敲低后,明显增加X射线诱发细胞自噬。抑制DNA-PKcs导致哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白（ mTOR）第2481位丝氨酸磷酸化水平降低。结论抑制DNA-PKcs增强受照射宫颈癌HeLa细胞的自噬及放射敏感性,mTOR信号通路可能参与DNA-PKcs对自噬的调节作用。     

PERK参与调控砷化物诱导细胞自噬反应的信号转导机制研究

目的 探索PERK是否参与调控砷化物诱导的细胞自噬反应.方法 体外培养人肝癌细胞HepG2,以砷化物为刺激源,采用Western印迹方法检测自噬反应标志性蛋白的表达水平、PERK诱导活化状态以及敲低PERK表达水平后砷化物诱导细胞自噬反应和p53诱导活化水平变化情况;采用双荧光素酶报告基因技术检测敲低PERK表达水平后p53的转录激活活性变化.结果 砷化物刺激HepG2细胞后自噬反应相关蛋白Beclin-1诱导表达、LC3发生剪切、p62发生降解反应,同时PERK活化水平显著增强;敲低PERK表达水平后,砷化物刺激作用下Beclin-1的诱导表达、LC3的剪切以及p62的降解均被显著抑制;同样条件下p53在Ser15和Ser392位的磷酸化修饰反应水平和转录激活活性显著下降、p53下游靶基因DAPK1的诱导表达水平被显著抑制.结论 PERK能通过调节p53活化及其下游靶基因DAPK1表达从而介导砷化物诱导的细胞自噬反应.     

脑脊液中S100B蛋白与昏迷患者预后的关系

目的比较患者昏迷与苏醒时脑脊液S100B蛋白水平,探讨脑脊液S100B蛋白指导治疗昏迷患者的临床意义及入院时GCS评分与脑脊液S100B蛋白变化之间的相关性。方法用双抗体夹心ELISA检测17例患者昏迷初期与苏醒时脑脊液S100B蛋白水平。结果 17例患者苏醒时脑脊液中S100B蛋白水平显著降低（t=3.735,P=0.002）,昏迷初期脑脊液S100B蛋白含量与GOS之间有显著的负相关关系（r=-0.64,P=0.006）,与入院时GCS之间有显著的负相关关系（P=0.002,r=-0.689）。57例患者入院时GCS与GOS存在显著的正相关关系（rp=0.416,P=0.001）。结论脑脊液S100B蛋白检测可早期有效评估脑损伤程度,指导昏迷患者的临床治疗及评估昏迷患者的预后。     

Spred的结构及生物学特性

Spred家族是一组Sprouty相关的酪氨酸激酶结合蛋白,它对多种生长因子诱导的Ras-ERK信号途径有负调控作用。Spred家族各成员在染色体上定位和体内表达均不相同,但都具有保守的结构域：C端Sprouty相关结合域（SPR）、中央c-Kit结合域（KBD）和N端Enabled／VAsP同源结构域（EVH-1）。Spred调节细胞发育、运动以及增殖等生命活动,参与肿瘤的转移、造血调控、过敏反应以及骨的形成等病理生理学过程。本文主要综述Spred家族的结构及功能特点以及对细胞增殖信号途径的调节作用。     

S100蛋白表达与鼻咽癌临床关系的研究

目的探讨S100蛋白家族在鼻咽癌组织中的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学方法研究S100蛋白家族成员（S100A2、A4、A9、A11）和肿瘤侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶-2（MMP～2）在58例低分化鼻咽癌患者的癌组织及16例正常鼻咽组织中的表达。结果58例癌组织中S100A4和S100A9阳性的表达率分别是78％和81％．明显高于其在正常鼻咽组织中的表达（尸〈0．01）,而S100A2在鼻咽癌组织中的表达明显低于正常鼻咽组织（P〈0．01）,S100A11则在鼻咽癌组织中的表达同正常鼻咽组织相比无明显差异（P〉0．05）。在S100A4／S100A97S100A2一的癌组织中MMP一2的表达明显高于其他组织（Pl〈O．05）。结论S100A4和S100A9蛋白的高表达与鼻咽癌的发生发展呈正相关,而S100A2蛋白则能抑制鼻咽癌的发生,S100A11蛋白与鼻咽癌的发生无相关性。S100A4、S100A9和S100A2可能是通过MMP一2的上调促进了鼻咽癌细胞的恶性侵袭能力。     

炭疽芽孢杆菌A16R株无菌培养滤液的蛋白质组学分析

目的：初步分析由我国炭疽疫苗株A16R所生产的无菌培养滤液中的主要成分。方法：运用免疫蛋白质组学的手段,从炭疽A16R疫苗株无菌培养滤液的二维凝胶电泳中选择与保护性抗体结合和不与该血清结合但丰度高的蛋白质点,进行质谱鉴定和信号肽分析。结果：共选择73个点,从炭疽芽孢杆菌数据库中鉴定出66个。在66个点中,有43个点与保护性血清结合;23个为高丰度蛋白,不与该血清结合。在与保护性血清结合的43个点中,13个点为不同大小的PA分子,其中相对分子质量83×10^3和63×10^3占主导,相对分子质量较小的片段仅4个。其余成分包括炭疽表面蛋白EA1、Sap、胶原黏附蛋白、伴侣分子DnaK等。结论：我们制备的炭疽无菌培养滤液中含有PA成分,PA是炭疽疫苗的重要保护性抗原。但PA以外的其他成分在抗炭疽免疫中起何种作用,是否参与诱发机体免疫应答有待进一步研究。     

髋关节置换术后异位骨化的蛋白质组研究

目的使用蛋白质组方法,通过比较髋关节置换术后并发异位骨化与未并发异位骨化患者血清蛋白,寻找差异表达蛋白,筛选蛋白质标志物。方法收集2009年8月～2012年3月14例髋关节置换术后患者血清,以髋关节置换术后并发异位骨化（heterotopic ossification,HO）记为HO组,以未并发异位骨化为正常组,蛋白质芯片联合表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI—TOF—MS）技术检测分析两组蛋白质表达谱,寻找差异蛋白。对每个质荷比峰值进行Wilconxon秩和检验,筛选P〈0．05的差异蛋白质峰。结果检测到154个高质量质谱蛋白质峰,其中质荷比为2748的蛋白点的峰值较正常组明显下调,匹配蛋白质为“一2一HS糖蛋白B链（Alpha一2一HS．glycoproteinchainB,AHSGB一链）。结论AHSGB一链的低表达与髋关节置换术后并发HO密切相关,可能为HO的敏感蛋白质标志物。     

中度失血性休克对大鼠重型脑损伤后S-100β表达的影响

目的：观察伴有休克大鼠重型颅脑损伤后颈静脉血清S-100β蛋白水平的变化。方法：雄性Wistar大鼠70只，采用Feeney法制作颅脑损伤模型，股动脉放血造成休克模型。随机分为7组。采用双抗体夹心酶联免疫分析单纯重型颅脑损伤组（SBI）及重型颅脑损伤伴休克组（SBIS）S-100β蛋白水平变化。结果：单纯颅脑损伤组及损伤加休克组均在伤后6h，S-100表达达到高峰，其余各时间点损伤加休克组均比单纯颅脑损伤组表达高，而且具有显著性差异（P〈0．01）。结论：失血性休克能引起重型颅脑损伤后严重继发性损伤，积极纠正休克对减轻脑伤后继发性病理损害意义重大。     

S100A2在喉鳞状细胞癌中的表达及其意义

目的研究S100A2蛋白在喉鳞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,lscc）中蛋白表达的情况,探讨其在喉鳞癌发生、发展、浸润转移中的作用。方法收集40例泸州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科2005年1月至2007年5月手术切除经病理诊断证实为喉鳞癌（LSCC）患者病理组织石蜡标本作为实验组,另取40例同期手术切除经病理证实无肿瘤浸润的癌旁喉粘膜组织标本作为对照组。所有石蜡标本按4μm连续切片2张,其中1张HE染色,另外1张用免疫组织化学染色SP法检测S100A2蛋白的表     

白藜芦醇促进γ射线照射小鼠造血系统损伤修复的作用

目的观察白藜芦醇对60Coγ射线照射小鼠造血系统损伤修复的影响。方法 ICR小鼠随机分成5组,即正常对照组、照射对照组以及白藜芦醇50、100、200 mg.kg-1照射组,照射前3 d灌服给药,每天1次。除正常对照组外,所有小鼠60Co射线全身5.5 Gy辐照1次,照射后第7天小鼠取骨髓细胞和脾脏,对骨髓单个核细胞和脾集落形成单位进行计数,测定骨髓细胞DNA含量和细胞周期。结果与正常对照组比较,照射对照组小鼠骨髓单个核细胞数和骨髓细胞DNA含量显著降低（P〈0.05）,脾集落形成单位数和S和G2/M期细胞百分率显著增多（P〈0.05）;与照射对照组比较,白藜芦醇100、200 mg.kg-1照射组小鼠照射骨髓单个核细胞数、骨髓细胞DNA含量、脾集落形成单位数和S和G2/M期细胞百分率显著增多（P〈0.05）,白藜芦醇50 mg.kg-1照射组有增多趋势。结论白藜芦醇可以促进60Coγ射线照射小鼠造血系统损伤的恢复,防护效果与给药剂量相关。     

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记（SILAC）技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。