炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析

目的:构建pET-32a( )-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a( )载体的Trx编码区融合产生pET-32a( )-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a( )-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2 金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a( )-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.     

登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

新型重组人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体的制备及活性分析

目的：利用大肠杆菌表达新型人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体ScFv,并验证其活性。方法：采用基因融合获得ScFv基因,构建重组表达质粒pET-22b（＋）-ScFv,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达。结果：Western印迹显示目的蛋白表达正确,表达产物以包涵体形式存在,经Ni-NTA柱纯化和体外复性,获得纯度达90%的ScFv蛋白。ELISA结果显示在PBS及人血清中ScFv的结合稳定性有所提高,流式细胞术证明目的蛋白能靶向结合狂犬病毒,通过中和效价测定实验测得ScFv的中和效价为40 U/mg。结论：成功利用原核表达系统实现了对人源抗GPRV ScFv的表达,并且具有一定的中和活性。     

人源性抗食管癌细胞单链抗体的表达纯化及活性鉴定

目的研究噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体的功能,对单链抗体进行包涵体表达纯化。方法将从噬菌体抗体库中筛选到的2个单链抗体基因分别连接到pET-28a、pET-SUMO原核表达载体中,分别构建原核表达重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化。采用盐酸胍稀释滴定复性方法对抗食管癌肿瘤细胞表面抗原的抗体进行复性,并用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果成功构建了重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,对重组菌株pET-NFC20b、pET NFC70a蛋白表达进行鉴定,诱导条件为0.5 mmol/L IPTG、时间3 h、温度18 ℃,重组蛋白均以包涵体形式表达,经滴定复性后均获得了相对分子量为30 kD和40 kD的重组蛋白。细胞ELISA实验鉴定2种蛋白NFC20b、NFC70a能与KYSE-170、KYSE-150、SMMC7721、A549等细胞结合,具有生物学活性。结论噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体NFC20b和NFC70a,可以成功地构建到pET28a和pET-SUMO载体内进行包涵体表达,纯化后具有蛋白活性,可为后续实验及检测试剂的研发奠定基础。     

铜绿假单胞菌碱性蛋白酶AprA及其抑制剂AprI的表达、纯化和初步的活性验证

目的：利用大肠杆菌BL21（DE3）重组表达铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PAE）重要毒力因子碱性蛋白酶（AprA）、碱性蛋白酶抑制剂（AprI）和鞭毛蛋白（flagellin）,并检测AprA和AprI的生物学活性。方法以该菌PAO1的基因组为模板,PCR扩增aprA、aprI和flic基因,构建重组表达载体pET-28a-AprA、pET-28a-AprI和pET-28a-鞭毛蛋白,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导表达,将包涵体变性、复性后纯化获得AprA蛋白,通过镍亲和树脂纯化获得AprI和鞭毛蛋白。利用SDS-PAGE检测AprA裂解鞭毛蛋白活性。结果重组蛋白AprA以包涵体的形式表达,AprI和鞭毛蛋白以可溶性形式表达。 AprA能裂解鞭毛蛋白,加入AprI可抑制AprA裂解鞭毛蛋白。结论 PAE分泌的AprA蛋白具有裂解鞭毛蛋白的活性,该活性能被AprI抑制。该研究为深入研究PAE的AprA的致病机制奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析

目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶ H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析.方法:应用PCR从EHEC O157∶ H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体.克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b( ).表达质粒测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western 印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价.结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b( )-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%.变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上.免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗体效价达1∶ 106.结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶ H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础.     

类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因的克隆表达及表达产物抗原性鉴定

目的：克隆表达类鼻疽伯克霍尔德菌外膜蛋白Omp38,并对重组Omp38（rOmp38）蛋白的抗原性进行鉴定。方法：应用PCR技术对类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-28a（＋）。重组表达载体经鉴定后,对重组蛋白进行诱导表达纯化,利用Western印迹对重组蛋白的抗原性进行鉴定。结果与结论：构建了pET-28a/Omp38重组表达载体,Omp38基因得到高效表达,Western印迹显示rOmp38蛋白具有较好的抗原性。     

艰难梭菌毒素AC端结构域在大肠杆菌中的可溶性表达与卵黄抗体的制备

目的重组表达艰难梭菌毒素A的C端结构域,制备针对艰难梭菌毒素A C端结构域的卵黄抗体。方法将优化合成的艰难梭菌毒素A的C端结构域DNA片段克隆到表达载体pET32b（＋）上,重组质粒转入大肠杆菌中诱导表达,经高亲和镍离子树脂纯化得到融合蛋白,凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。检测目的蛋白的生物学活性,用目的蛋白免疫产蛋鸡制备针对艰难梭菌毒素A受体结合区的鸡卵黄抗体,分离纯化鸡卵黄抗体并用ELISA测定卵黄抗体的效价。结果获得了优化的艰难梭菌毒素A受体结合区的基因片段,继而制备了具有生物学活性的毒素A C端结构域重组蛋白。免疫产蛋鸡后获得了效价1∶50 000的抗艰难梭菌毒素A的卵黄抗体。结论获得了具有生物学活性的艰难梭菌毒素A C端结构域重组蛋白,为建立艰难梭菌基因工程疫苗打下了基础,并制备了针对艰难梭菌毒素蛋白A的卵黄抗体,可用于艰难梭菌相关性腹泻的诊断和治疗。     

人乳酸脱氢酶A基因的原核表达及其蛋白的纯化

目的 构建带有His标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)基因原核表达载体,并进行蛋白纯化,为研究LDHA蛋白功能奠定基础.方法 以人乳腺文库作为模板,通过PCR技术扩增得到LDHA基因的编码序列,插入到pET-28a(+)载体中并测序.LDHA在大肠杆菌中进行诱导表达并纯化蛋白,SDS-PAGE及Western印迹检测蛋白纯化效果.采用His pull-down技术检测纯化蛋白与沉默信息调节因子2(SIRT2)的相互作用.结果 PCR扩增获得长度约1000 bp的LDHA编码序列,并插入到pET-28a(+)载体中,序列测定结果显示重组质粒构建成功.SDS-PAGE及Western印迹结果显示获得带有His标签的LDHA蛋白.His pull-down实验证明His-LDHA能与SIRT2体外结合,证实其生物学活性良好.结论 成功构建带His标签的LDHA基因原核表达载体,并得到纯化蛋白,为进一步研究LDHA蛋白的功能奠定了基础.     

人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

目的：在大肠杆菌系统中表达有活性的人β-防御素3(hBD3)。方法：从pGE-T-hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因，插入pGEX-4T-1构建pGEX-4T-1-hBD3融合表达载体，转化E．coli DH5α宿主菌，进行IPTG诱导，诱导菌经超声裂解后获得包涵体，包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST-hBD3融合蛋白，再经凝血酶切割。获得纯化的重组hBD3(rhBD3)。对rhBD3采用最小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。结果：以与GST融合表达的方式，运用pGEX-4T-1系统在大肠杆菌中表达了hBD3，融合蛋白以包涵体形式存在。融合蛋白经凝血酶处理使删释放出来，其对金黄色葡萄球菌的MIC为4μg/ml；对大肠杆菌的MIC为8μg／ml。结论：采用pGEX-4T-1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0463的表达与抗原性鉴定

目的表达梅毒螺旋体（Tp）重组蛋白Tp0463（rTp0463）并鉴定其抗原性,为进一步探讨其在梅毒血清学诊断和免疫保护中的作用奠定基础。方法 PCR扩增Tp0463基因,构建原核表达重组体pET-28a（＋）/Tp0463,转化宿主菌诱导表达重组蛋白,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,Westernblot鉴定表达产物的抗原性。结果成功构建了原核表达重组体pET-28a（＋）/Tp0463,经诱导高效表达了一分子量大约为16KDa的重组蛋白,以包涵体表达形式为主,纯化蛋白的纯度〉90%;Westernblot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者混合血清特异性识别。结论高效表达了rTp0463,该重组抗原有良好的抗原性。     

利用免疫蛋白质组学鉴定炭疽杆菌蛋白MetK及其免疫原性验证

目的验证免疫蛋白质组中鉴定到的S-腺苷甲硫氨酸MetK蛋白的免疫原性。方法免疫蛋白质组学的方法鉴定到MetK蛋白,通过PCR方法扩增metK基因全长,然后将其克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌DH5α,测序正确后提取质粒转入BL21（DE3）中进行诱导表达。再通过Ni-NTA柱纯化MetK蛋白,纯化后的蛋白免疫SPF级的BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,通过多克隆抗体与炭疽芽孢杆菌A16R全菌蛋白Western印迹检测,验证MetK蛋白的免疫原性。结果与结论成功表达了MetK蛋白,制备了其多克隆抗体,为免疫蛋白质组学鉴定到的蛋白点进行验证,也为研究MetK蛋白的生物学功能研究提供了条件。     

乙型脑炎病毒NS5蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化乙型脑炎病毒非结构蛋白NS5,并制备其多克隆抗体。方法通过PCR法扩增编码NS5蛋白的全长基因,将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,并通过Ni柱亲和层析纯化重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体。采用间接免疫荧光法检测抗体效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果与结论成功获得了可溶性表达的NS5蛋白,制备了多克隆抗体,效价为1∶1000,能够特异性识别乙型脑炎病毒感染细胞中表达的NS5蛋白,为进一步研究NS5蛋白的生物学功能奠定了基础。     

CT抗原NY-ESO-1基因克隆、表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达人CT抗原NY-ESO-1,对表达产物进行Western印迹鉴定和纯化,为今后利用其进行肿瘤疫苗的研究奠定基础.方法:通过全基因拼接获得NY-ESO-1基因,构建重组表达载体NY-ESO-1-pET28a( ),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导获得表达,利用单克隆抗体进行Western印迹鉴定,通过Ni柱亲和纯化获得纯化蛋白.结果与结论:拼接的NY-ESO-1全基因经测序证明与GenBank中人的NY-ESO-l全基因完全相符;构建的原核表达载体NY-ESO-1-pET28a( )可稳定地可溶性表达NY-ESO-1蛋白;经Ni柱亲和纯化获得较好的纯化结果;利用鼠抗人单克隆抗体对表达的蛋白进行验证,结果显示阳性.本研究成功利用原核表达系统实现了对CT抗原NY-ESO-1的可溶性表达.     

一个高效表达且纯化简单的重组蛋白载体系统

目前已发展了几种快速、有效地纯化细菌表达重组蛋白的方法。谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）融合表达系统是通过非变性条件下亲和吸附到谷胱甘肽－琼脂糖上，从细菌粗提物中纯化融合蛋白的。为便于从融合蛋白中解离出目的多肽，这个载体中含有特异的蛋白酶裂解位点。本研究比较了这个系统中的两个不同的载体。结果表明，它们都能高效表达谷胱甘肽转硫酶－白介素１受体拮抗剂（ＧＳＴ－ＩＬ－１ｒａ）融合蛋白，但凝血酶对融合蛋白的裂解效率有很大区别，ｐＧＥＸ－ＫＧ载体不仅大大提高了凝血酶的裂解效率，而且简化了纯化过程。因此，它为大批量用细菌表达真核蛋白的制备纯化提供了一种简便、廉价而有效、可行的方法     

新预测的Ⅲ型分泌系统毒力蛋白Z3672的基因克隆、表达及纯化

目的：克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7新预测毒力蛋白Z3672,以进一步开展其结构与功能的研究。方法：利用PCR方法从EHECO157：H7基因组中扩增出基因z3672,构建重组表达质粒,经测序证实后,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现诱导表达,采用质谱分析法和Western印迹试验进行鉴定,通过洗涤包涵体纯化目的蛋白。结果：构建了pET-24a-z3672重组质粒,经酶切及测序鉴定与预期序列一致,实现了目的蛋白的融合表达,并且对蛋白条带的质谱分析证实了表达蛋白即为Z3672蛋白。纯化后目的蛋白的纯度〉90％。结论：得到了新预测的毒力蛋白Z3672,为下一步研究蛋白功能,并进一步研究EHECO157：H7的致病机制奠定了基础。     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

重组人乙酰肝素酶在大肠杆菌中的表达、纯化

目的：表达纯化重组的人乙酰肝素酶（heparanase,HPA）。方法：以表达乙酰肝素酶全长质粒pcDNA3.1-HPA为模板,扩增不包括信号肽的乙酰肝素酶片段,将其插入pET-28a（＋）载体,转化到大肠杆菌BL21（plysS,DE3）中,在起始诱导菌密度、诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度4个方面对诱导条件进行了优化,实现了重组人乙酰肝素酶的可溶性表达。采用HisTrapTMcrude亲和层析对目的蛋白进行了初步纯化。结果：得到了初步纯化的HPA蛋白,Western印迹证实表达产物可被乙酰肝素酶抗体和His标签抗体识别,证明表达产物具有乙酰肝素酶的免疫学特性。结论：表达纯化的人HPA蛋白为特异性单抗的制备和鉴定提供了实验材料。