长双歧杆菌NCC2705 ATP结合蛋白BL0034表达与活性检测

目的克隆长双歧杆菌NCC2705中ATP结合蛋白BL0034的基因,利用大肠杆菌表达并纯化GST-BL0034融合蛋白,测定其结合ATP的活性。方法以长双歧杆菌NCC2705基因组为模板PCR扩增BL0034基因,双酶切后连接到pGEX-4T-1表达载体上,转入大肠杆菌BL21中表达;用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂对可溶性的GST-BL0034融合蛋白进行纯化,并用Western印迹验证。结果将BL0034基因克隆至质粒pGEX-4T-1,构建表达载体pGEX-4T-1-BL0034。BL0034经0.05 mmoL/L IPTG诱导,16℃过夜表达,SDS-PAGE可见相对分子质量约为82×103的可溶性表达条带;亲和纯化GST-BL0034,Western印迹结果为阳性。对纯化后的融合BL0033蛋白结合ATP的能力进行了定量测定,每毫克BL0034蛋白能结合约40 nmol/L ATP。结论成功克隆了BL0034蛋白的基因,表达并纯化GST-BL0034蛋白,证实了BL0034与ATP具有较强的结合能力,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705 BL0034蛋白的功能奠定了基础,为阐明其在果糖ABC转运系统中如何通过水解ATP产生能量提供了前提。     

长双歧杆菌NCC2705中胆盐水解酶基因的克隆表达及其特性的研究

目的克隆并过表达胆盐水解酶基因,研究胆盐水解酶对茵体胆盐耐受性和胆固醇降解率的影响等特性。方法采用常规原核表达方法在大肠杆菌BL21（DE3）和长双歧杆菌NCC2705中过表达胆盐水解酶基因,并进行长双歧杆菌NCC2705和pMgap—bsh／NCC2705的胆盐耐受性和降胆固醇实验。结果在大肠杆菌中成功表达了NCC2705的胆盐水解酶基因,经纯化的GST空标签和GST融合蛋白的SDS—PAGE电泳结果显示,胆盐水解酶的相对分子质量约为35×103;构建的过表达bsh的菌株pMgap—bsh／NCC2705比标准菌株NCC2705表现出了略高的胆盐耐受性和胆固醇降解率。结论所构建的高效表达胆盐水解酶菌株可能有利于提高茵体的胆盐耐受性和降胆固醇能力,益生菌的降胆固醇途径不是单一的,培养基中是否含有胆盐对胆固醇的降解率影响较大。     

Cloning of bile salt hydrolase in Bifidobacterium longum NCC2705 and description of its characteristics

目的 克隆并过表达胆盐水解酶基因,研究胆盐水解酶对菌体胆盐耐受性和胆固醇降解率的影响等特性.方法 采用常规原核表达方法在大肠杆菌BL21(DE3)和长双歧杆菌NCC2705中过表达胆盐水解酶基因,并进行长双歧杆菌NCC2705和pMgap-bsh/NCC2705的胆盐耐受性和降胆固醇实验.结果 在大肠杆菌中成功表达了NCC2705的胆盐水解酶基因,经纯化的GST空标签和GST融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果显示,胆盐水解酶的相对分子质量约为35×103;构建的过表达bah的菌株pMgap-bsh/NCC2705比标准菌株NCC2705表现出了略高的胆盐耐受性和胆固醇降解率.结论 所构建的高效表达胆盐水解酶菌株可能有利于提高菌体的胆盐耐受性和降胆固醇能力,益生菌的降胆固醇途径不是单一的,培养基中是否含有胆盐对胆固醇的降解率影响较大.     

阿托伐他汀通过PPARα信号通路抑制老年大鼠心肌TNF—α的表达

目的观察阻断过氧化物酶体增殖物激活物受体仪（PPARα）信号通路对阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达作用的影响。方法分离培养24个月龄大鼠的心肌细胞,将培养的细胞分为空白对照组、溶剂对照组、阿托伐他汀组、PPAR拮抗剂GW6471＋阿托伐他汀组。各组细胞分别加入细胞培养液、二甲基亚砜、阿托伐他汀、阿托伐他汀＋GW6471处理。分别用RT—PCR和Western blot方法检测各组大鼠心肌细胞的TNF-α mRNA表达水平和蛋白含量。结果（1）与空白对照组相比,溶剂对照组细胞的TNF-α mRNA表达水平和蛋白含量均无显著差异（P〉0．05）;（2）与空白对照组相比,阿托伐他汀组的TNF—α mRNA表达水平和蛋白含量均显著降低（P〈0．01）;（3）GW6471＋阿托伐他汀组的TNF-α mRNA表达水平及蛋白含量均显著高于阿托伐他汀组（P〈0．05）,但仍低于空白对照组（P〈0．05）。结论阿托伐他汀可通过激活PPARα信号通路来抑制老年大鼠心肌细胞炎性因子TNF-α表达。     

HLA-B＊ 2705分子结构对其在原核细胞可溶性表达影响的研究

目的研究人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-B＊ 2705分子结构对其在原核细胞可溶性表达的影响。方法采用RT-PCR法将HLA-B＊ 2705基因的全长、胞外区和α1、α2功能区分别进行克隆并连接到pET-32a（＋）表达载体。经IPTG诱导表达,并经超声破碎、层析和透析纯化蛋白,再经体外微量细胞淋巴毒反应检测蛋白质活性。结果成功构建3种pET-32a（＋）表达载体,经IPTG诱导后,HLA-B＊ 2705基因全长和胞外区主要以包涵体的形式表达,可溶性蛋白的量较低;而α1和α2功能区则以高效可溶性形式表达,通过体外微量细胞淋巴毒实验证实,HLA-B＊ 2705的α1和α2功能区可溶性蛋白可与HLA-B27抗体特异性结合,并成功阻断补体介导的细胞毒作用。结论α1和α2功能区能够在原核细胞中高效表达可溶性蛋白,并具有蛋白功能,而HLA-B＊ 2705基因全长和胞外区主要以包涵体的形式表达,表明蛋白质的大小和空间结构对于其可溶性表达具有重要影响。     

PFT-α在调控热化疗损伤结肠上皮细胞增殖和周期中的作用

目的：探讨p53抑制剂PFT-α（p-fifty three inhibitor-alpha，PFT-α）对热化疗损伤肠上皮细胞增殖、周期的影响，及对热化疗损伤肠上皮细胞的保护作用。方法：MTT法分析PFT-α对结肠上皮细胞增殖及其对热化疗杀伤DLD1细胞的影响。顺铂联合温热处理结肠上皮细胞，对比加入不同浓度的PFT-α，Annexin V-FITC／PI和PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡和周期。结果：PFT-α在低于50μmol／L时，对于结肠上皮细胞增殖无影响，高于60μmol／L则抑制细胞增殖（P＜0．01）。PFT-α在5～40μmol／L之间。PFT-α不影响DLD1细胞生长，达50μmol／L时，则对肿瘤细胞的生长有一定的抑制效应（P〈0．05）。达60μmol／L，这种抑制效应更明显（P〈0．01）。PFT-α呈浓度依赖性降低热化疗诱导的结肠上皮细胞凋亡率，使细胞G2／M延长。结论：PFT-α可使细胞G2／M期延长而保护结肠上皮细胞。     

安宫牛黄注射液对大鼠脑外伤后炎性反应的干预作用

目的观察安宫牛黄注射液对脑外伤后脑内炎性反应因子白细胞介素（IL）-1β、细胞间黏附分子（ICAM）-1、血清S100B蛋白和神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平的影响，探讨其对外伤脑组织的保护作用。方法采用Feeney法造成鼠脑挫裂伤模型，在伤后不同时相点用酶联免疫法检测治疗组和对照组脑组织IL—1β、ICAM—1水平、血清S100B蛋白和NSE水平变化。结果除外IL-6β伤后6h外，伤后6—48h治疗组脑组织IL—1β、ICAM—1、血清S100B蛋白和NSE均比对照组低（P〈0．05）。结论安宫牛黄注射液能减轻脑外伤后脑组织的炎症反应，对脑组织起一定的保护作用。     

双歧杆菌四联活菌片预防小儿抗生素相关性腹泻的疗效

目的：探讨应用双歧杆菌四联活菌片预防小儿抗生素相关性腹泻（ ADD）的效果及安全性。方法将150例住院并应用广谱抗生素的患儿随机分为2组,对照组（ n＝75）常规抗感染治疗及服用乳酶生,观察组（ n＝75）在常规治疗的基础上加用双歧杆菌四联活菌片,观察ADD发生情况及不良反应发生情况。结果两组小儿原发病的病程无显著差异（P＞0．05）;对照组小儿ADD发生率高于观察组（P＜0．05）;两组患儿均未见明显的药物不良反应。结论预防性应用双歧杆菌四联活菌片对应用广谱抗生素治疗的肺炎、支气管炎患儿的原发病无明显影响,且能有效预防ADD发生,具有推广价值。     

谷氨酰胺对缺血再灌注肝脏热休克蛋白70基因表达的影响

目的探讨谷氨酰胺（Gln）对缺血再灌注肝脏热休克蛋白70（HSP70）基因表达的影响及其对肝脏的保护作用。方法雄性Wistar大鼠120只,随机分为3组（n=40）：假手术组（1组）、生理盐水组（2组）和谷氨酰胺组（3组）。术前3组大鼠连续5天腹腔注射Gln,2组仅给予等量的生理盐水。2、3组采用Pringle＇s法阻断入肝血流,35分钟后开放复流,1组仅行麻醉、开腹。分别于阻断前及再灌注后2、4、24小时,取血及肝组织,测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及肝组织丙二醛（MDA）的含量,采用RT-PCR法检测肝组织HSP70mRNA的表达。结果再灌注后2、4、24小时,3组MDA、ALT、AST、LDH及TNF-α水平与2组相比均显著降低（P〈0．05）,而3组肝组织HSP70mRNA表达显著高于2组和1组（P〈0．05）。结论Gln能够促进肝组织HSP70基因的表达,减轻肝缺血再灌注损伤,抑制炎症因子释放。     

幽门螺杆菌分泌与重组表达的VacA蛋白的分离纯化及其致细胞空泡效应与凋亡的对比研究

目的：分离纯化幽门螺杆菌分泌和重组表达的细胞空泡毒素抗原（ VacA）蛋白,并评价其致细胞空泡效应及致细胞凋亡效应。方法分别从幽门螺杆菌ATCC26695菌株培养上清和重组表达VacA蛋白的pQE30-VacA-E．coliM15基因工程菌中分离纯化VacA蛋白,经酸化后,以不同终浓度（5,10 ng／ml）分别与人胃腺癌AGS细胞共孵24 h,观察致空泡效应,并通过流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功分离纯化出幽门螺杆菌分泌和重组表达的VacA蛋白;幽门螺杆菌分泌的VacA蛋白能显著引起AGS细胞的空泡样改变及凋亡（P＜0．01）,而重组表达的VacA蛋白致细胞空泡样改变及凋亡不显著（ P＞0．05）。结论幽门螺杆菌分泌的VacA蛋白有良好的空泡毒性及致凋亡效应,而重组表达的VacA蛋白无致空泡及凋亡效应,幽门螺杆菌分泌的VacA蛋白可用于VacA作用机制的研究。     

2型糖尿病患者血清脂联素、肿瘤坏死因子-α水平变化及其临床意义

目的 探讨2型糖尿病患者体重指数（body mass index,BMI）、胰岛素敏感指数（insulin sensibitity,SI ）和血清脂联素、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平变化及其临床意义.方法 采用放射免疫分析法（RIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）分别测定100例2型糖尿病组,101例正常对照组的空腹血清脂联素及TNF-α水平,同时测定BMI、空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、空腹血胰岛素（fasting insulin FINS）、胰岛素抵抗指数（Homa-IR）等相关指标.结果 糖尿病组BMI、FBG、FINS、Homa-IR均明显高于正常对照组（均P〈0.05）,血清脂联素、SI均低于正常对照组（P〈0.05）.血清TNF-α两组间无统计学意义（P＞0.05）.单因素相关分析显示,血清脂联素与SI呈正相关（r=0.247,P〈0.05）,与BMI呈负相关（相关系数为：r=-0.313,P〈0.05）,与TNF-α无相关性.结论 血清脂联素与肥胖、SI相关,与TNF-α无相关性,脂联素的增高可能是有益的.     

长双歧杆菌BL0033与BL0034的相互作用研究

目的克隆表达B.longum NCC2705果糖ABC转运系统中BL0033、BL0034及其截短突变体,验证两蛋白的体外相互作用,并确定介导彼此相互作用的功能区域。方法将bl0033与bl0034基因克隆至载体pGEX-4T-1和pET32a并在E.coli中表达,采用谷胱甘肽-Sepharose 4B和镍柱分别对GST和His融合的蛋白进行纯化,GST pull-down验证BL0033与BL0034蛋白之间的相互作用。为了进一步确定BL0033和BL0034的作用位点,根据BL0033和BL0034基序特征构建截短突变体,GST pull-down实验检测截短体与完整蛋白结合的能力,确定介导相互作用的区域。结果在大肠杆菌中实现了融合蛋白的可溶性表达,经亲和层析获得了融合蛋白。GST pull-down实验证实BL0033与BL0034存在相互作用,其中BL0033的截短体1～23 aa能与BL0034结合,而截短体36～314 aa丧失了与BL0034的结合能力;BL0034的3个截短体中BL0034/8～244 aa、BL0034/33～220 aa能与BL0033相互作用,而BL0034/289～481 aa与BL0033没有作用。结论证实了BL0033与BL0034之间的相互作用,并确定BL0033的1～23 aa基序与BL0034的33～220 aa基序是这种相互作用的结构域,为进一步研究B.longum NCC2705果糖ABC转运系统的分子机制奠定了理论基础。     

早期强化胰岛素治疗对心肺复苏后部分炎症因子的影响

目的 探讨早期胰岛素强化治疗对心脏骤停（CA）复苏后炎症因子的影响.方法 67例无糖尿病史的CA患者随机分为对照组（B组,n=34）和强化胰岛素治疗组（A组,n=33）,同期健康体检人群为正常组（C组,n=34）.B组复苏后给予常规药物治疗;A组在常规治疗基础上加用胰岛素,将血糖维持在4.3～6.1 mmol/L.分别于复苏即刻和治疗24 h后时测定两组患者的血糖、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、C-反应蛋白（CRP）水平,并与C组进行比较.结果 A、B组治疗前后TNF-α、IL-6、CRP均较C组升高（P＜0.05）;A组治疗24 h后,血糖、TNF-α、IL-6、CRP减低,与B组比较有显著差异（P＜0.05）.结论 在心肺复苏再灌注早期,TNF-α、IL-6、CRP均不同程度增高,说明炎症反应明显;早期强化胰岛素治疗可抑制TNF-α、IL-6、CRP水平的升高,减轻复苏后炎症反应.     

心脏神经官能症炎性反应因子与内皮功能的研究

目的：探讨心脏神经官能症患者心、脑血管疾病风险。方法心脏神经官能症（cardiac neurosis,CN）42例作为CN组,健康体检者41例作为对照组,比较两组心率变异性（ HRV）、超敏C反应蛋白（ hs-CRP）、肿瘤坏死因子-α（ TNF-α）和肱动脉内皮依赖性舒张功能（EDD）。结果两组HRV各项参数比较有统计学差异（P＜0．05）;CN组hs-CRP、TNF-α和EDD分别为（1．96±0．37） mg/L、（21．3±6．5） ng/ml、（5．25±0．53）％,对照组为（1．09±0．24） mg/L、（9．6±2．3） ng/ml、（9．12±2．16）％,两组间两两比较均有统计学差异（P＜0．05）。结论心脏神经官能症患者存在多种心、脑血管疾病发病危险因素。     

老年糖耐量低减者TNF-α及一氧化氮水平与微量白蛋白的发生

目的：探讨老年糖耐量低减者（IGT）血液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及一氧化氮水平与微量白蛋白尿发生的关系。方法：IGT微量白蛋白尿组和正常白尿组各35例,分别测定TNF-α和一氧化氮含量。结果：IGT微量白蛋白尿组TNF-α和一氧化氮含量较正常白蛋白尿组显著升高（P〈0.05）。结论：结论TNF-α和NO共同参与IGT者微量白蛋白尿的发生。     

吸入肝素对哮喘患者诱导痰液中ECP、TNF-α、sIL-2R水平的影响

目的：诱导测定哮喘患者痰液ECP、TNF—α、sIL-2R水平，评价吸入肝素防治哮喘的作用。方法：采用酶联免疫法及荧光免疫法对40例轻中度哮喘患者在吸入肝素前后测定痰液中嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）、肿瘤坏死因子α（TNF—α）、可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R）水平。结果：吸入肝素后诱导痰液ECP水平由（298±150）μg／L降至（147±95）μg／L、TNF—α由（287±147）ng／L降至（139±59）ng／L、sIL-2R由（498±127）kU／L降至（358±107）kU／L。哮喘患者吸入肝素前ECP与TNF—α，sIL-2R均呈显著正相关（r=0．58，0．62，P〈0．05）。吸入肝素后各指标间无明显相关性。结论：吸入肝素后哮喘患者诱导痰液中ECP、TNF—α、sIL-2R浓度比吸入肝素前明显降低。吸入肝素可明显抑制气道炎性反应，其作用理机可能与抗炎作用有关。     

人参皂苷Re对肿瘤坏死因子-α诱导的白细胞活化的抑制作用及机制

目的研究人参皂苷Re对肿瘤坏死因子-α诱导的白细胞活化的作用及其机制。方法提取并培养人外周血中性白细胞,用酶标仪和流式细胞仪体外观察肿瘤坏死因子-α(20 ng/ml)对中性白细胞黏附相关指标MPO的分泌以及白细胞表面黏附分子CD11b和CD18的表达的诱导作用,同时观察肿瘤坏死因子-α(20 ng/ml)对中性白细胞跨内皮细胞迁移的诱导作用,并测定不同浓度人参皂苷Re对以上变化的影响。结果人参皂苷Re可以剂量依赖性地明显抑制肿瘤坏死因子-α诱导的黏附于内皮细胞表面白细胞MPO的分泌和黏附分子CD11b、CD18的表达,明显抑制肿瘤坏死因子-α诱导的中性白细胞跨内皮细胞的迁移。结论人参皂苷Re可以抑制由肿瘤坏死因子-α诱导的白细胞的活化,包括白细胞与内皮细胞的黏附和游出,该作用与抑制白细胞表面黏附分子CD11b和CD18的表达相关。     

环磷酸腺苷葡胺对心脏瓣膜置换术患者心肌缺血/再灌注损伤心肌保护作用的研究

目的：研究环磷酸腺苷葡胺（M-cAMP）对体外循环下换瓣手术患者心肌缺血/再灌注损伤的保护作用。方法：选择30例在体外循环下行换瓣手术的患者,随机分为M-cAMP组（A组）和对照组（B组）,A组入预充液中经转机进入体内;测定切皮前（T0）、主动脉开放后5min（T1）、术毕（T2）、术后6h（T3）和术后18h（T4）血浆CK-MB、TNF-α、SOD、MDA含量。结果：两组血浆中SOD均明显下降,以对照组更为明显（P〈0.05）,血浆CK-MB、TNF-α、MDA含量较术前上升,以对照组为明显（P〈0.05）。结论：M-cAMP可保护缺血/再灌注损伤心肌SOD活性,减少心肌细胞MDA产生,有效保护心肌功能。