同源盒基因Pax-6在晶状体发育过程中的表达分析

目的 建立晶状体连续发育模型，检测Pax—6基因在小鼠晶状体发育的不同阶段的表达情况，探讨该基因在小鼠晶状体发育中的作用。方法 利用RT—PCR法和westernblot法，检测Pax—6在小鼠晶状体发育不同阶段中的表达状况。结果 在鼠胚9．5d(E9．5)即可检测到Pax—6的表达，在其连续发育阶段的E12．5，E17．5及新生10、20、60d均可检测到Pax—6的表达。westernblot法同样发现在体外培养的原代细胞，传第1、第2及第3代的晶状体上皮细胞(LECs)中均能检测到Pax—6蛋白水平的表达。结论小鼠晶状体发育的各个阶段均具有Pax—6基因，该基因的正常表达是晶状体发育的必要条件。     

晶状体上皮细胞增生与Pax-6表达的相关分析

目的检测Pax-6基因在体外培养的不同阶段小鼠晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)中的表达,分析其与LECs增生特性的关系。方法 利用囊膜组织块贴壁法及胰酶消化法体外培养不同阶段LECs;免疫组织化学法检测LECs中Pax-6蛋白表达情况;并利用RT-PCR法检测其mRNA水平的表达情况。结果 在原代培养细胞、传第1代及传第2代的LECs中明显检测到Pax-6mRNA水平的阳性表达,LECs相应各泳道有一与227 bp相一致的扩增片段;RT-PCR法同样发现在原代培养细胞、传第1代及传第2代、传第3代的LECs中均能检测到Pax-6蛋白水平的表达,Pax-6标记指数分别为11.75%、20.00%、26.75%、5.25%,Pax-6阳性物质染色呈弥漫性、均一性分布于LECs细胞核内。阴性对照组在各阶段均未见Pax-6的表达。结论 LECs中有Pax-6基因存在,该基因的正常表达与LECs增生特性相关。     

晶状体上皮细胞凋亡及bcl-2、bax表达与年龄相关性白内障形成的关系

目的：探讨晶状体上皮细胞凋亡与年龄相关性白内障发生的关系。方法：用透射电镜观察2例年龄相关性白内障患者和1例正常人晶状体上皮细胞的超微结构。用脱氧核苷酸末端转移酶缺口标记原位细胞检测法(the terminal deoxynucleotidyl transferasa(TdT)-medinted dUTP nick-end labeling TUENl)检测晶状体上皮的凋亡细胞。采用链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶标免疫组织化学法(streptavidin-peroxidase,SP)染色，镜下检测46例年龄相关性白内障患者和13例健康成年人、7例胚胎的晶状体上皮细胞的bax基因与bc1—2基因的表达情况。结果：在年龄相关性白内障患者的晶状体上皮细胞的超微结构中可见凋亡之细胞，健康成年人晶状体上皮细胞正常。年龄相关性白内障患者的晶状体上皮细胞凋亡百分率为21．20％，健康成年人的晶状体上皮细胞凋亡百分率为0．25％。年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞的bax基因表达为100％，bcl—2基因表达为0％，健康成年组和胚胎晶状体上皮细胞的bax基因表达为0％，Lcl—2基因表达为100％。结论：晶状体上皮细胞的凋亡在年龄相关性白内障的发生中起重要作用。     

骨桥蛋白在白内障晶状体上皮细胞中的表达

目的：探讨骨桥蛋白（osteopontin，OPN）在白内障晶状体上皮细胞中的表达水平及作用。方法：采用免疫组织化学法检测22例前囊下性白内障、17例核性白内障、14例皮质性白内障患者和11例正常晶状体上皮细胞中OPN的表达，并进行阳性细胞计数和各组间比较。结果：OPN在前囊下白内障患者晶状体上皮细胞中的表达明显增多，其阳性表达率与核性白内障、皮质性白内障及正常人晶状体比较，差异有显著意义（P〈0．01）。结论：OPN在前囊下性白内障晶状体上皮细胞中表达阳性，在前囊下白内障的形成过程中可能起重要作用。     

老年性白内障晶状体上皮细胞凋亡及相关基因蛋白的表达

目的 探讨老年性白内障与晶状体上皮细胞凋亡的关系。方法透射电镜下观察老年性白内障晶状体上皮细胞的超微结构；Tunel法检测凋亡细胞百分率；并对其晶状体上皮细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳；免疫组化法检测P53、bcl-2在老年性白内障晶状体上皮细胞中的蛋白表达。结果 透射电镜下发现老年性白内障晶状体上皮细胞中有凋亡细胞；凋亡细胞百分率为8．4％～37．8％，琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带；P53在老年白内障晶状体上皮细胞中蛋白表达率为16．9％～19．1％，bcl-2无蛋白表达。结论 老年性白内障的发生可能与其晶状体上皮细胞凋亡有关。     

新基因c24的克隆及其在正常及白内障晶状体上皮细胞中的表达

目的克隆新基因c24并研究其在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞(LECs)中的表达,并比较二者表达的差异。方法用改良的消减杂交法克隆新基因c24,地高辛标记c24cDNA片断制作探针,用原位杂交法研究其在晶状体前囊膜切片上的表达,并进行统计学处理。结果克隆到了新基因c24的cDNA片断,长约532bp,c24在正常晶状体和年龄相关性白内障LECs中均有表达;其在年龄相关性白内障LECs中的表达高于其在正常LECs的表达。结论c24在正常晶状体和年龄相关性白内障LECs中均有表达;在年龄相关性白内障LECs中,其表达较正常晶状体增高,提示其可能在白内障的发生中起一定的作用。     

MMP-3和TIMP-1在白内障晶状体上皮细胞中的表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶-3(matrixmetalloproteinase-3,MMP-3)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1,TIMP-1)与白内障发病机制的关系。方法采用免疫组织化学方法测定MMP-3和TIMP-1在前囊下性白内障31眼、核性白内障28眼和正常晶状体12眼上皮细胞(lensepithelialcell,LEC)中的表达。结果MMP-3在前囊下性白内障的表达分别与核性白内障、正常晶状体比较,差异有显著意义(χ2=31.490,34.479;P=0.000),而核性白内障与正常晶状体相比较,差异无显著意义(χ2=2.449,P=0.118);TIMP-1表达在3组LEC中差异均无显著意义(P>0.05);MMP-3与TIMP-1在前囊下性白内障LEC中的表达没有相关性(r=0.121,P=0.516),而在核性白内障中有相关性(r=-0.513,P=0.005)。结论MMP-3表达增强及MMP-3/TIMP-1的表达失衡可能与前囊下性白内障的形成密切有关。     

波形纤维蛋白在老年性白内障晶状体上皮细胞的表达

目的观察波形纤维蛋白在老年性白内障晶状体上皮细胞的变化.方法用卵白素-生物素过氧化物酶法对22例老年性白内障患者晶状体前囊膜上皮细胞进行波形纤维蛋白染色,采用包埋前免疫酶电镜技术处理6个晶状体前囊膜标本,并观察其超微结构;利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳及Westemnblot法分析4个晶状体表层组织(前囊膜、上皮细胞和表层皮质)中的波形纤维蛋白.结果老年性白内障晶状体上皮细胞的波形纤维蛋白表达减弱,与对照组比较差异有显著性(t=2.0948,P<     

角膜上皮细胞Pax—6基因表达分析

目的检测体外培养角膜上皮细胞Pax-6基因的表达,探讨维持角膜缘干细胞特性的基因因素.方法地高辛标记cDNA探针进行DNA印迹杂交和蛋白质免疫印迹,检测培养的角膜上皮细胞中Pax-6基因表达状况.结果EcoRⅠ酶切角膜缘上皮细胞中9.1kbp的DNA片断与探针序列相同,其中原位和原代培养细胞、传第l代明显测出,角膜中央上皮细胞的原位和原代细胞中也能测出.Western     

老年性及先天性白内障晶状体上皮细胞凋亡及相关基因的表达

目的探讨老年性及先天性白内障患者晶状体上皮细胞(LECs)凋亡及其相关基因表达的关系。方法采用原位末端标记及免疫组织化学的方法,对30例老年性白内障患者、15例先天性白内障患者及15例正常人LECs中的凋亡细胞及c-fos、c-jun等相关基因蛋白的表达进行检测。结果30例老年性白内障患者LECs凋亡率为15·10%±7·83%,正常对照组为0(P<0·01),先天性白内障组0·01%±0·028%(P>0·05)。老年性白内障组中c-fos及c-jun阳性表达的细胞率均明显高于对照组(P<0·01),与凋亡细胞率呈正相关(r=0·8660,0.4021);先天性白内障及正常组中均极少或未见相关基因的表达。结论LECs凋亡与老年性白内障密切相关,c-fos与c-jun蛋白的表达可能与LECs凋亡有关。     

大鼠钝挫性眼外伤动物模型中晶状体上皮细胞热休克蛋白70和27的表达及其热耐受的调节作用

目的探讨大鼠眼钝挫伤后晶状体上皮细胞HSP70和HSP27的表达,并给予预先的热刺激(热休克),观察热休克对晶状体上皮细胞HSP70和HSP27表达的调节。方法48只Sprague-Dawley(SD)大鼠,应用随机数字表法随机分成扑打组和水浴组,每组24只鼠,右眼为实验眼。扑打组:20g铁球20cm高度拍打眼球100次。水浴组:给大鼠体温提高至40.5~41.5℃8min诱导出热耐受,2~3h后再给予20g铁球20cm高度拍打眼球100次。逆转录聚合酶链反应检测晶状体上皮细胞HSP70和HSP27基因的表达丰度。结果钝挫性眼外伤可造成晶状体上皮细胞HSP70基因表达的增强,扑打眼球后1h HSP70表达升高至4.59±0.12,3h后达到高峰7.72±0.27,24h后降至正常1.32±0.14。预先的热刺激导致HSP70基因表达增高至1.83±0.30。两组HSP27基因表达丰度均无明显改变。结论钝挫性眼外伤中晶状体上皮细胞HSP70表达的增强提示HSP70可能在钝挫性外伤过程中对晶状体变性蛋白起保护作用,给予预先的热刺激可能通过提高HSP70的表达保护晶状体。(中华眼科杂志,2006,42:241-245)     

低强度2450 MHz微波阻断兔晶状体上皮细胞周期及对相关基因表达的影响

目的　探讨不同剂量微波辐射对兔晶状体上皮细胞 (RLEC)细胞周期的阻断作用 ,以及微波辐射对细胞周期调控基因P2 1WAF1、P2 7Kip1及c myc表达的影响。 方法　应用频率为 2 4 5 0MHz、功率密度分别为 0 10 (A组 )、0 2 5 (B组 )、0 5 0 (C组 )、1 0 0 (D组 )及 2 0 0mW /cm2 (E组 )的微波连续辐射体外培养的RLEC 8h ,光镜下观察辐射前、后细胞形态学的改变 ,采用流式细胞技术测定细胞周期 ,Western印迹法检测功率密度 2 0 0mW /cm2 的微波辐射 4、6及 8h对P2 1WAF1、P2 7Kip1及c myc基因表达的影响。以无微波辐射对照者为F组 ,进行对照研究。结果　微波辐射 8h后 ,C、D及E组RLEC肿胀和聚集 ,甚至出现细胞固缩和脱壁现象 ,G0 /G1期细胞所占比例明显升高 (P <0 0 5 )。功率密度 2 0 0mW /cm2 的微波辐射 4h ,P2 7Kip1表达水平即开始明显升高 ,而c myc表达水平开始逐渐下降 ,P2 1WAF1表达无变化。结论　功率密度≥ 0 5 0mW/cm2 的微波可阻断RLEC细胞周期 ,并使细胞停滞于G0 /G1期 ;这种阻断作用可能是通过调节调控细胞周期转换的基因P2 7Kip1和c myc而实现。     

慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷体系抑制人晶状体上皮细胞的研究

目的探讨慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷体系（HSV—tk／GCV）对人晶状体上皮细胞（LECs）系的杀伤效应的机制。方法HSV—tk基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因共表达的慢病毒感染细胞为试验组,仅表达EGFP的慢病毒感染细胞和正常细胞为对照组。流式细胞仪检测病毒的转染效率,荧光显微镜观察及基因组PCR和RT-PCR检测基因在LECs内表达,DNA ladder和电镜观察该系统对LECs的杀伤作用,检测HSV—tk／GCV系统的浓度时间依赖性和旁观者效应。结果HSV—tk整合入LECs并高效表达。10～25μg／ml的GCV能明显诱导转染HSV—tk的细胞凋亡或坏死,且随GCV浓度升高和作用时间延长效应增强,且存在明显的旁观者效应,而对照组细胞无显著改变。当GCV浓度〉25μg／ml,对照组细胞的增殖也被显著抑制。结论GCV可高效杀伤表达HSV-tk的LECs,且旁观者效应显著增强了HSV—tk／GCV系统的杀伤效果。HSV—tk和EGFP共表达的慢病毒载体能高效稳定转染LECs。     

层黏连蛋白和纤维连接蛋白对人晶状体上皮细胞生长特性的影响

目的　探讨层黏连蛋白(Ln)和纤维连接蛋白(Fn)对人晶状体上皮细胞生长特性的影响。方法　选用28只人晶状体的前囊膜,采用组织块法接种于Ln(Ln组)、Fn(Fn组)及2%牛血清白蛋白(对照组)包被的培养皿中。应用倒置显微镜观察组织块周围晶状体上皮细胞生长的时间和形态、成纤维细胞出现的时间。采用间接免疫荧光法显示连接素43、ΔNp63和整合素β1 的表达。采用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)检测ΔNp63和整合素β1 mRNA的水平。结果　Ln组和Fn组晶状体上皮细胞长出时间早[ (2. 4±0 .2)d]、细胞数量多,且Fn组成纤维细胞的生长时间[ ( 7. 6±0. 4 )d]明显早于Ln组[ (12. 7±0. 5)d] (P<0 .05)。Ln组连接素43表达的阳性率(23 /28)明显高于Fn组(14 /28)和对照组(12 /28) (P<0 .05),Fn组ΔNp63 ( 24 /28 )和整合素β1 ( 25 /28 )表达的阳性率明显高于Ln组和对照组(P<0 .05)。RT- PCR检测结果支持间接免疫荧光法的检测结果。结论　Ln可持久促进原代培养的人晶状体上皮细胞增殖,并具有一定维持正常细胞间、细胞与细胞外基质间稳态平衡的作用;Fn在细胞培养早期具有较强的促进细胞增殖的作用,但同时也具有促进上皮细胞分化和成纤维细胞生长的作用。     

硫酸镍与芪归解毒汤对人晶状体上皮细胞中HSP27表达的影响

目的:探讨硫酸镍损伤后人晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LECs)中热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)表达情况,并给予芪归解毒汤干预,观察晶状体上皮细胞HSP27表达的变化。方法:体外培养正常人晶状体上皮细胞分为正常组,硫酸镍组和中药组,分别作用24h后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测晶状体上皮细胞HSP27 mRNA的表达水平。结果:硫酸镍损伤可造成晶状体上皮细胞HSP27 mRNA表达水平上调(P<0.05),预先的中药干预能使HSP27 mRNA表达水平上调(P<0.05)。结论:硫酸镍损伤后晶状体上皮细胞HSP27mRNA表达水平上调,给予预先的中药干预可能通过提高HSP27的表达水平从而保护晶状体上皮细胞。     

脂质体介导外源基因转入人晶体上皮细胞的实验研究

目的确定外源基因能否由脂质体携带进入人原代晶体上皮细胞（ｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎｌｅｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ,ＰＨＬＥＣｓ）。方法体外培养人原代晶体上皮细胞,用阳离子脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎｒｅａｇｅｎｔ,ＬＲ）携带重组质粒报道基因（β半乳糖苷酶）,向人原代晶体上皮细胞转移,在转移１２、２４、３６小时,分别表达２天和６天时,用以Ｘｇａｌ为底物的酶显色方法,检测报道基因对人原代晶体上皮细胞的转移率。结果脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）介导的外源基因可以转入人原代晶体上皮细胞,在转移２４小时,表达２天时转移率可达４８％。结论稳定的外源基因可由脂质体介导转入生长中人原代晶体上皮细胞,作为晶体上皮细胞基因类药物介入的基础研究和应用研究的介导体,脂质体显示出有希望的前景。借此方法也可以从外源基因入手,对晶体上皮细胞的生理和病理活动,进行机制研究。     

端粒酶活性在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中的表达及意义

目的 探讨端粒酶活性在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中的表达及意义.方法 对新西兰大白兔11只(22只眼)行超声乳化晶状体吸除术法,术后3个月所有实验动物的晶状体后囊膜均已混浊.20只眼分别取赤道部囊膜、混浊后囊膜组织,采用端粒重复序列扩增-聚丙烯酰胺凝胶电泳法定性和端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附定量法检测其晶状体上皮细胞端粒酶活性.两者端粒酶活性比较采用成组设计t检验.结果 以HepG2细胞作为端粒酶检测阳性对照,兔晶状体赤道部囊膜组织、后囊膜均可检测到端粒酶活性,表现为自50 bp开始多个模糊梯度条带状电泳图谱,其吸光度A450-690值分别为0.85±0.23、0.67±0.19,两者比较差异有统计学意义(t=2.526,0.021;P＜0.05).结论 在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中存在端粒酶活性,其活性较晶状体赤道部囊膜上皮细胞低.     

人原代晶体上皮细胞bFGF多肽和mRNA的表达

目的 为研究后发性白内障的发生机理,检测生长中人晶体上皮细胞（ＨＬＥＣｓ）自身是否表达碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）。方法 体外培养人晶体上皮细胞,用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交的方法,检测ＨＬＥＣｓ中ｂＦＧＦ多肽和其ｍＲＮＡ的表达。结果 用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交方法,可检测到生长中的人晶体上皮细胞自身表达碱性成纤维细胞生长因子。结论 结合碱性成纤维细胞生长因子促进人晶体上皮细胞生长     

碱性成纤维细胞生长因子在牛晶状体上皮细胞中的表达和调控

目的　探讨牛晶状体上皮细胞 (BLEC)中碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)的表达和胎牛血清对表达的调控作用 ,推测白内障摘除术后血 房水屏障破坏对bFGF的影响。方法　采用免疫组化法和Westernblot法检测体外培养的BLEC中bFGF的表达 ,以及不同浓度胎牛血清 (0 1%、1 0 %及 10 0 % )作用 2 4h、10 0 %胎牛血清作用不同时间 (4、8、12及 2 4h)对bFGF相对表达量的影响。结果　免疫组化法检测显示绝大部分BLEC胞浆中可见bFGF表达。Westernblot法检测显示BLEC中表达的bFGF相对分子质量为 180 0 0 ;bFGF的表达随胎牛血清浓度的增加而增强 ,差异有显著意义 (P <0 0 5 ) ;随胎牛血清作用时间的延长而增强 ,差异有显著意义 (P <0 0 5 )。结论　BLEC中可见低相对分子质量bFGF的表达 ;胎牛血清可诱导BLEC中bFGF表达 ;白内障摘除术后血 房水屏障的破坏可导致房水中血清浓度改变 ,引起晶状体上皮细胞中bFGF表达增强。     

四种细胞因子对牛晶状体上皮细胞胶原合成的影响及对前胶原mRNA表达的调控

目的 探讨表皮生长因子(EGF)、白细胞介素1(IL-1)、γ干扰素(IFN-γ)和生长抑素8肽(SS-8肽)在晶状体后囊膜混浊形成中的作用及影响胶原合成的机制。方法 细胞接种于96孔培养板贴壁后分别加入含有浓度为10^-2～10^2ng／ml的EGF、10～10^5ng／ml的IL-1、10^-11～10^-7mol／L的SS．8肽及10～10^5U／ml的IFN-γ细胞培养液,采用^3H-脯氨酸掺人法检测对胶原合成的影响;用Northern blot技术检测对Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的调控。结果 EGF 10^-1～10^2ng／ml、IL-1 10^2～10^5ng／ml显著促进胶原合成,IFN-γ 10^3～10^5U／ml、SS-8肽 10^-10～10^-7mol／L显著抑制胶原合成;1ng／ml的EGF及10^3ng／ml的IL-1可增加Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达,而10^3U／ml的IFN-γ及10^-9mol／L的SS-8肽可减少Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达。结论 EGF、IL-1参与了晶状体后囊膜混浊形成中的胶原合成,且对胶原合成的影响是作用于转录水平;IFN-γ、SS-8肽的作用提示其可用于防治晶状体后囊膜混浊。（中华眼科杂志,2004,40：545-548)