肺炎链球菌溶血素减毒突变体免疫小鼠可诱导抗体依赖的保护效应

目的 优化肺炎链球菌溶血素减毒突变体(△A146 Ply)蛋白小鼠免疫方案,评价其保护效果,并揭示△A146 Ply特异性抗体在保护中的作用.方法 分别使用△A146 Ply免疫小鼠1、2、3次,利用ELISA分析血清内特异性IgG滴度,效价测定1周后,使用肺炎链球菌D39菌株鼻腔攻毒评价3种免疫方式保护效力.通过肺内定植模型和败血症模型分析△A146 Ply对肺炎链球菌感染的保护效果.利用抗体吸附试验和模拟被动保护试验分析Ply特异性抗体的保护作用.结果 随着免疫次数的增加,小鼠血清内的IgG滴度显著升高.相比免疫两次的小鼠,3次免疫后的小鼠其体内的IgG升高超过20倍.在攻毒试验中,免疫3次后的小组接受同等剂量的D39攻毒,存活率最高,保护效率为50%.在定植模型中,△A146 Ply免疫后的小鼠,其肺内肺炎链球菌血清型19F的细菌量减少约50倍,14血清型菌减少超过20倍.在败血症模型中,使用1200 CFU的D39腹腔注射到免疫组及对照组小鼠体内,△A146 Ply免疫组有60%的小鼠能够抵抗这种致命剂量的D39感染,对照组小鼠全部死亡(P=0.0018).在被动保护试验中,Ply特异性抗体被吸附完全后的抗血清完全不能保护小鼠抵抗致死剂量的D39感染,60%的小鼠在接受抗体特异的抗血清后存活,两组存活率差异有统计学意义.结论 △A146 Ply能有效抵抗肺炎链球菌的感染,证实保护作用与其特异性抗体密切相关.     

融合蛋白DnaJ-△A146Ply对小鼠肺炎链球菌脑膜炎感染的保护效果

目的 探究融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply对小鼠肺炎链球菌脑膜炎感染的保护效果。方法 侧脑室法构建模型的免疫保护实验:C57BL/6雌鼠随机分为抗DnaJ-ΔA146Ply血清+Ⅲ型组、WT血清+Ⅲ型组、抗DnaJ-ΔA146Ply血清+Tigr4组、WT血清+Tigr4组,经侧脑室注射血清及肺炎链球菌血清型Ⅲ型和Tigr4,构建被动免疫模型,24 h后计数菌载量、ELISA测定脑匀浆炎症因子情况及脑组织切片HE染色,观察抗DnaJ-ΔA146Ply血清被动免疫保护效果。尾静脉法构建模型的免疫保护实验:C57BL/6雌鼠随机分为DnaJ-ΔA146Ply组和PBS组,经3次皮下免疫后,通过尾静脉注射肺炎链球菌血清型Tigr4构建肺炎链球菌脑膜炎,24 h后进行脑匀浆、心脏血等菌载量计数,观察免疫保护作用。结果 侧脑室法注射抗DnaJ-ΔA146Ply血清并进行肺炎链球菌攻毒后,脑组织中细菌载量明显降低,脑中TNF-α表达量下调,侧脑室及软脑膜炎症细胞浸润情况减轻。小鼠3次皮下免疫DnaJ-ΔA146Ply后抗体效价达到106,在尾静脉法构建的Tigr4脑膜炎小鼠中,免疫组脑组织中细菌载量降低。结论 融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply对不同血清型肺炎链球菌导致的小鼠脑膜炎感染具有保护作用,能够降低细菌侵袭和脑组织炎性反应。     

肺炎链球菌溶血素黏膜免疫抗定植保护作用的研究

目的 原核表达ΔA146 Ply蛋白,评价ΔA146 Ply黏膜免疫对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)在宿主鼻咽部定植的保护作用.方法 IPTG诱导、Ni-NTA树脂纯化获得纯化的ΔA146 Ply蛋白,经黏膜免疫BALB/C小鼠,制备其特异性抗血清;进行体内抗定植实验,观察小鼠...     

肺炎链球菌核酸疫苗在恒河猴体内的免疫原性研究

目的 研究肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,PN)核酸疫苗在恒河猴体内的免疫原性.方法 将肺炎链球菌溶血素全长基因和切去羧基端33个核苷酸的基因分别插入到质粒pVAX1载体中,构建成Ppn和Ppnd两种核酸疫苗.采用体内电转染初免结合相应蛋白质抗原加强的策略免疫恒河猴.结果 切去肺炎链球菌溶血素基因羧基端33个核苷酸.表达的重组截短溶血素蛋白保留了抗原性但去除了溶血活性,从而保证了疫苗的安全性.给恒河猴肌肉内注射500μg核酸疫苗加电转染能诱导出特异性抗体免疫应答,用相应蛋白质加强免疫后血清抗体几何平均滴度提高了约4倍.结论 采用电转染技术结合蛋白质加强免疫的策略,能增强肺炎链球菌溶血素核酸疫苗在恒河猴体内的特异性抗体水平.     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

肺炎链球菌毒力蛋白在侵入性感染中的免疫原性评价

目的观察肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)及肺炎链球菌溶菌素(Ply)激发自然途径感染肺炎链球菌机体保护性体液免疫应答的情况,评价这三种毒力蛋白作为治疗性肺炎链球菌疫苗候选抗原的免疫原性。方法采集侵入性肺炎链球菌感染患者(实验组)及同期确诊为侵入性其它细菌感染患者(对照第一组)和同期确诊为非感染性疾病患者(对照第二组)各36例急性期(第0+3天)及恢复期(第21±3天)血清样本,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中肺炎链球菌3种毒力蛋白抗原特异性抗体IgG水平变化。结果实验组与两组对照组间第(0+3)天血清的3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平无显著性差异(P>0.05)。第一组对照组恢复期较急性期血清中3种毒力蛋白特异性抗体水平无显著变化(P>0.05),而实验组恢复期血清3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平明显高于急性期血清抗体水平8～30倍(P<0.01),其中PspA和Ply蛋白抗原特异性抗体水平升高更明显,血清中针对PspA家族1(PspA-Faml)特异性抗体水平高于针对PspA家族2(PspA-Fam2)的特异性抗体水平(P<0.01)。结论 PsaA,P...     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0873的表达纯化及保守性分析

目的 通过构建原核表达载体,获得纯化的肺炎链球菌S.pn重组假想蛋白SPD0873,并制备多克隆抗体,进一步分析其在常见S.pn菌株中的保守性.方法 分离培养D39型肺炎链球菌,获取其基因组DNA.利用PCR方法扩增去除信号肽的spd0873序列,采用基因体外重组法将spd0873序列克隆到原核表达载体pET-32(a)内,测序鉴定.将重组质粒转化到E.coli Rossetta(DE3)中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的SPD0873重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western 印迹鉴定;将鉴定后纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western 印迹方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在5种常见肺炎链球菌分离株的保守性.结果 克隆的spd0873序列与GenBank中的数据相符,并实现了SPD0873蛋白高水平的可溶表达.纯化蛋白免疫BALB/C小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western 印迹验证SPD0873蛋白在5株常见肺炎链球菌菌株中均有表达.结论 成功制备了高滴度、高特异性的SPD0873蛋白多克隆抗体,同时,检测到SPD0873蛋白在5种常见的肺炎链球菌菌株中非常保守,为研究该蛋白的生物学功能及肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础.     

副溶血性弧菌直接溶血毒素基因的原核表达及产物的性质

目的 实现副溶血性弧菌直接溶血毒素tdh基因在大肠杆菌中的表达,鉴定表达产物在生物学活性和免疫原性。方法 构建tdh基因的原核表达系统NWⅡ（tdh/Trc99A/JM109),并在30℃条件下,用0.8mmol/L IPTG诱导表达。用SDS－PAGE分析蛋白表达;溶血试验检测表达蛋白的溶血活性。将表达产物腹腔注射免疫兔,用试管凝集反应试验检测特异性抗体。用溶血抑制试验检测该抗体体外对TDH溶血活性的抑制作用。结果 NWⅡ在上述条件下诱导后,TDH呈可溶性、融合性表达。SDS－PAGE表明,表达蛋白的相对分子质量（Mr)约23000。薄层扫描显示,细菌的周质腔中的蛋白量最高,占总蛋白的13．4％。溶血试验表明,表达的蛋白具有溶血活性。用表达蛋白免疫兔产生的相应抗体,在体外具有抑制TDH溶血活性的作用。结论 tdh基因在原核表达系统Trc99A/JM109中获得成功表达,为基因工程大规模制备TDH抗原,制备抗TDH的多克隆和／或单克隆抗体,构建基因工程菌苗,阐明该菌的致病机制打下了基础。     

肺炎链球菌候选疫苗蛋白SPD0295的重组表达及免疫活性分析

目的评价磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸酶转移系统(phosphotrans-ferase system,PTS)SPD0295蛋白作为候选疫苗的免疫活性,分析其在不同血清型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)中的表达情况。方法以S.pn中D39血清型基因组DNA为模板扩增spd0295基因序列,IPTG诱导表达含6×His标签的SPD0295重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后获得高纯度的目的蛋白;序列比对分析不同血清型S.pn的spd0295基因保守性;SPD0295蛋白与Alum佐剂混合经腹腔注射免疫Balb/c小鼠制备多抗,ELISA法检测其抗体效价,Western blot技术分析抗体的特异性,同时分析该蛋白在7株常见肺炎链球菌中的表达水平。结果spd0295基因在7株不同血清型S.pn中与D39菌株基因序列一致性大于99%;重组蛋白SPD0295免疫小鼠后获得高滴度、高特异性的多克隆抗体;Western blot技术验证了SPD0295蛋白在7株常见肺炎链球菌株中均有表达;黏附抑制试验表明SPD0295蛋白及其抗血清均可抑制细菌的黏附效应。结论 SPD0295蛋白免疫Balb/c小鼠可获得的多克隆抗体具有良好的免疫活性,且在不同血清型S.pn菌株中均有表达,保守性强,是1个潜在的S.pn候选疫苗蛋白。     

肺炎链球菌溶血素经死亡受体/Fas途径和线粒体途径诱导RAW264.7细胞凋亡

目的:探讨肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,Ply)对小鼠RAW264.7细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用及机制。方法:Ply蛋白加入RAW264.7细胞培养上清与细胞共孵育。倒置显微镜观察Ply对RAW264.7细胞形态的影响。MTT法检测Ply对RAW264.7细胞的增殖抑制。Annexin V法检测细胞凋亡率。分光光度法检测Caspase-3、8、9活性。免疫细胞化学法检测到Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表达。结果:Ply对小鼠RAW264.7细胞有明显的增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖性;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞24小时后,可见典型的凋亡形态学改变;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞1小时和3小时后,细胞凋亡率分别为32.90%和51.56%(P<0.05);1μg/ml Ply蛋白处理RAW264.7细胞24小时,Caspase-3、8、9活性均比对照组升高(P<0.05);免疫细胞化学法检测到Bax、Fas表达较对照组增强,Bcl-2表达减弱(P<0.01)。结论:Ply可诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡,诱导凋亡的机制可能是通过死亡受体/Fas途径和线粒体途径双重机制的介导实现。