超声微泡造影剂的肿瘤靶向治疗研究进展

近几年,国内外着眼于靶向微泡造影剂的研究,利用超声波与微泡造影剂的相互作用及所产生的生物学效应,可实现微泡所携带的基因/药物等向目标组织的转移释放,介导肿瘤细胞的凋亡及肿瘤微血管的栓塞阻断等,从而起到靶向治疗的作用。随着各种兼具诊断治疗双重作用的超声探头和靶向微泡造影剂包括纳米级微泡造影剂的研制,以及对超声生物学效应的深入研究,超声微泡介导肿瘤靶向治疗将为临床肿瘤的治疗带来新的希望。     

超声联合微泡造影剂介导基因治疗的研究进展

基因治疗将是人类攻克许多难治性疾病的有效方法,超声微泡作为一种新型的基因载体,可以安全、简便、靶向性地将基因转移入特定的组织、细胞。本文阐述了超声联合微泡介导基因治疗的研究进展以及未来的应用前景。     

超声微泡造影剂与肝癌靶向药物治疗

随着超声微泡造影剂的研究和应用,超声微泡造影剂不仅有利于肝癌的早期诊断,而且为肝癌的早期治疗提供了新的思路。本文就该领域近年来对肝癌靶向药物治疗的研究进展做一综述。     

超声和微泡造影剂介导细胞基因转染的实验研究

目的 探讨低频超声对细胞基因转染的作用。方法 超声治疗仪频率1MHz，脉冲重复频率100Hz，占空系数20％。质粒DNA为含编码绿荧光蛋白的pEGFP。应用荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞基因转染率，台盼蓝染色计算细胞成活率。选用C2C12、3T3-MDEI和CHO3种细胞系为研究对象，加入DNA后辐照不同声强、时间或加入超声造影剂，观察各条件下的细胞基因转染率和成活率。结果 ①超声介导的基因转染与声强和辐射时间有关，最佳剂量为1w／cm^2 20s；②同样超声剂量，较高的声强较早达到最大基因转染率；③较低剂量时，微泡造影剂可使超声介导的基因转染提高2～3倍并可显著提高最高基因转染率。结论 低频超声可介导细胞基因转染，基因转染率不但与超声辐射剂量有关，而且同样剂量时，高声强较早达到最大基因转染率，最佳剂量是1w／cm^2 20s。同时，微泡造影剂可提高超声介导基因转染的最高转染率。     

超声介导微泡造影剂促进HSV-TK基因转染抑制小鼠肝癌移植瘤的实验研究

目的 探讨超声辐照微泡造影剂介导的单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)自杀基因系统转染小鼠肝癌组织的有效性.方法 小鼠肝癌皮下移植瘤,尾静脉注入HSV-TK,添加或不添加Sono Vue,脉冲多普勒超声(1MHz、2W/cm2 、5min)辐照,第2天重复治疗1次.24h后荷瘤鼠腹腔注射更昔洛韦(GCV),连续10d,绘制肿瘤生长曲线,观测荷瘤鼠生存时间,半定量RT-PCR分析肿瘤内TK mRNA的表达,TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡.结果 与单纯超声辐照组比较,超声(US)和Sono Vue组肿瘤生长受到明显抑制(P<0.05),小鼠的平均生存时间延长(P<0.05),肿瘤内TK mRNA的表达增多(P<0.05),肿瘤细胞凋亡指数增高(P<0.05).结论 超声辐照Sono Vue可有效介导HSV-TK基因发挥抗瘤效应.     

超声微泡造影剂介导小鼠骨骼肌基因转染实验研究

目的探讨微泡造影剂在超声作用下是否可增加小鼠骨骼肌基因转染效率.方法 40只昆明小鼠随机分为4组,每组10只,第一组:在胫前肌注射造影剂与绿色荧光蛋白(GFP)质粒的混合溶液;第二组:注射与第一组相同的混合溶液后立即加超声辐照;第三组:注射GFP;第四组:在注射GFP后立即用超声辐照.7天后取小鼠胫前肌观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果第一组与第二组有较多GFP表达,部分肌纤维绿色荧光较明亮,部分较暗淡;第三组和第四组GFP表达量较少.第一组与其余各组间的差异有显著性意义,P＜0.05;第二组与其余各组间的差异有显著性意义,P＜0.05;第三组与第四组间的差异无显著性意义,P＞0.05.结论超声微泡造影剂在超声作用下可明显增强小鼠骨骼肌的基因转染效率;未加超声波作用时,直接肌注携基因的超声微泡造影剂亦可增加小鼠骨骼肌的基因转染效率.     

超声靶向破坏微泡技术介导shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK1基因表达

目的 探讨应用超声靶向破坏微泡（UTMD）技术介导shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK1基因表达的能力。方法 构建并筛选shRNA最佳表达载体。体外培养肝癌细胞Hca-F,共分为5组：A组为空白对照组;B组为shRNA质粒组;C组为脂质体组;D组为超声微泡+超声辐照组;E组为脂质体+超声微泡+超声辐照组。应用倒置荧光显微镜观察转染率;荧光定量PCR检测JNK1的mRNA水平;Western-Blot检测JNK1的蛋白质表达。结果 获得了shRNA干扰效果最好的表达载体。各组转染率比较：E组均大于B、C、D组（P均<0.05）;C、D组之间差异无统计学意义（P>0.05）。荧光定量PCR和Western-Blot检测各组JNK1mRNA和蛋白表达比较：E组的JNK1mRNA和蛋白表达水平均最低（P均<0.05）。结论 脂质体转染法与UTMD技术结合可以提高小鼠肝癌细胞株JNK1 shRNA的转染效率,并能够增强基因表达的抑制效果。     

超声造影剂介导PTEN基因影响卵巢癌侵袭的实验研究

目的 研究超声介导造影剂增效PTEN基因在卵巢癌细胞中的转染，探讨该基因抑制肿瘤细胞侵袭的机制。方法分别于接种人卵巢黏液性囊腺癌细胞（SKOV3）的6孔板中每孔加入200μl造影剂和5μl脂质体，以诊断超声剂量辐照60s，细胞转化48h后，采用重组基底膜侵袭模型，观察转染前后SKOV3细胞侵袭力的变化。结果转染PTEN基因可以明显抑制肿瘤细胞的侵袭力。结论PTEN基因可以通过抑制肿瘤细胞侵袭力而抑制卵巢肿瘤的生长；超声介导造影剂增效基因转染，可望成为临床基因治疗的新手段。     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N1转染小鼠角膜的实验研究

目的 探讨微泡造影剂声诺维联合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染小鼠角膜的转染效率和安全性.方法 小鼠眼前房分别注射生理盐水、质粒+生理盐水、质粒+造影剂、脂质体+质粒等,以50 Hz,2 W/cm2的脉冲波超声辐照质粒+生理盐水和质粒+造影剂眼10 min.术后第1 d、第3 d、第7 d、第14 d和第21 d荧光体视镜观察眼表EGFP表达出现情况,冰冻切片荧光显微镜观察阳性细胞的分布,病理切片观察组织有无损伤.结果 造影剂联合超声辐照组小鼠眼表出现绿色荧光蛋白的弥漫性表达,明显高于单纯超声辐照组和脂质体转染组,其余对照各组眼表均未见绿色荧光.第3 d时的病理切片各组均无异常.结论 声诺维联合超声辐照在体能安全、有效地介导基因转染眼组织.     

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠骨骼肌

目的 探讨增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性.方法 20只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为裸质粒组(P)、质粒 超声组(P U)、质粒 微泡组(P M)和质粒 超声 微泡组(P U M)共4组进行实验.选择增强绿色荧光蛋白质粒与白蛋白微泡相混合,以超声介导白蛋白微泡破裂的方法 对大鼠骨骼肌行基因转染,转染7 d后,荧光显微镜下观察质粒在大鼠脊斜肌组织中的表达情况.结果 P、P M组大鼠脊斜肌组织中均未见增强型绿色荧光蛋白表达;P U组可见少量微弱绿色荧光,荧光强度较P和P M组明显增强(P<0.05),P U M组可见明显特异性增强型绿色荧光蛋白表达,荧光强度约为P、P M组的10倍,P U组的3倍(P<0.05);P U M组转染率为(42.72±10.07)%较之P U组(13.62±6.17)%明显增高(P<0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂造成的脊斜肌组织毛细血管通透性的增加,是血管内基因成功跨越内膜屏障的主要途径之一.     

低频超声照射SonoVue对绿色荧光蛋白质粒在小鼠肝癌移植瘤中表达的作用

目的 研究物理参数对体内基因转染率的影响,确定最佳剂量-效应关系.方法 建立小鼠(C57BL/6J)肝癌皮下移植瘤模型,经尾静脉注入绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)和SonoVue混合物,给予不同辐照声强(1 W/cm2、2 W/cm2、3 W/cm2)、辐照时间(1 min、5 min、10 min)以及不同剂量SonoVue(30μl、60μl、90μl).流式细胞仪和荧光显微镜检测肿瘤细胞内绿色荧光蛋白表达.结果 pEGFP在肿瘤组织内的表达随辐照时间、辐照声强、造影剂剂量的增加而增多,持续增加辐照时间、声强和造影剂剂量并不能有效增加其转染率,2 W/cm2[(21.02±1.45)%]、5 min(23.22±1.91)%]、60μl SonoVue[(21.02±1.45)%]时,pEGFP在肿瘤组织内的表达达到最大.结论 不同物理参数对体内基因转染率有明显影响,2 W/cm2、5 min、60μl SonoVue的参数条件下,可达到最佳剂量-效应关系.     

脂质体微泡对超声介导基因转染的增效作用研究

目的 探讨超声介导基因转染时,脂质体微泡(LM)对体内、外红色荧光蛋白基因(RFP)转染的增效作用及其安全性.方法将RFP和LM加入培养的Hela细胞后行超声辐照(US),对微泡浓度、超声强度、辐照时间进行优化研究,运用荧光显微镜、流式细胞术评估基因转染率,并对细胞损伤进行分析.在裸鼠移植瘤的体内实验中,将LM和RFP质粒(P)经尾静脉注入后予以超声辐照(P+LM+US),以单纯质粒注射(P)、P+US、P+LM作为对照,行冰冻切片,组织学检查,RFP表达检测.结果培养的Hela细胞经LM和超声辐照联合处理后,RFP基因转染率显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01),在超声强度为1.0 W/cm2、微泡浓度为6%、辐照3 min的条件下最显著,且未发现显著的细胞损伤.P+LM+US组的裸鼠移植瘤内RFP表达显著高于P组、P+US组或P+LM组,差异均有统计学意义(P＜0.01),且未观察到明显的组织损伤.结论 LM对超声介导基因转染的体内、外转染效率有显著的增效作用,而无明显的细胞或组织损伤,为临床基因治疗提供一种新颖、高效、安全的非病毒基因转染方法.     

超声造影对肝硬化合并小肝癌的早期诊断价值

目的观察肝硬化背景下不同组织类型小肝癌(≤3．0cm)的超声造影灌注时间及增强模式，探讨超声造影对小肝癌的诊断价值。方法146例肝局灶性病变行超声造影，其中经手术或穿刺病理确诊肝硬化合并小肝癌(≤3．0cm)42例48个病灶；记录分析48个病灶造影增强模式，并进行造影前后良恶性诊断5级评分比较。全部病例造影前、后半个月内行增强CT检查进行对比。结果造影后中～低分化肝癌38个病灶(79．2％)动脉期发生快速强化，实质期快速消退，呈“快进快出”型；6个高分化小肝癌呈“快进慢出”型；4个肝透明细胞癌中3个≤1．5cm灶呈“慢进慢出”型，另1个2．2cm肿瘤呈“快进快出”型。造影前仅27个病灶(56．0％)超声作出正确诊断或诊断恶性倾向；造影后14个病灶(29．0％)评分提高2～4分，17个病灶仅提高1分。最终有2个病灶仍未能获得定性诊断，有4个病灶仅诊断恶性倾向，余42个病灶被确认恶性，诊断正确率达87．5％(42／48灶)。结论灰阶超声造影对肝硬化背景下不同组织类型小肝癌增强模式的初步研究，可为小癌灶的早期诊断提供依据；作为CT等影像诊断的互补手段，超声造影可成为诊断肝硬化合并小肝癌灵敏可靠的方法。     

超声微泡介导EGFP 质粒对视网膜母细胞瘤细胞转染效率的实验研究

目的探讨不同浓度的超声微泡造影剂，在不同声强的超声辐照下，介导DNA质粒转染视网膜母细胞瘤（RB）细胞的效率及可行性，为实现外源基因高效、定向的转移奠定基础。方法将培养的RB细胞分别予以超声条件为0．25，0．5，0．75，1．0，1．25W／cm^2，60S的连续波辐照，微泡造影剂浓度为1％，100．4，20％，30％，以筛选出对RB细胞活性无明显抑制的最适超声声强、辐照时间和微泡浓度。根据以上筛选条件，转染EGFP基因入RB细胞，24～48h后，在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，并用RT-PCR对EGFPmRNA进行半定量检测。结果声强〈0．75W／cm^2（60s），以及微泡浓度〈20％时，对RB细胞的活性无明显抑制。当微泡浓度10％，超声声强为0．5W／cm^2或0．75W／cm^2时，介导的DNA质粒对RB细胞转染具有较高的转染效率，明显高于其他实验组。超声声强为0．5W／cm^2或0．75W／cm^2介导的转染效率，在统计学上差异无显著性意义。结论浓度适当的微泡在优化的声强条件下，能够有效地提高DNA质粒在RB细胞中的转染效率。     

诊断超声照射下微泡造影剂对绿荧光蛋白质粒在肌肉细胞内表达的作用

目的评价诊断超声照射下微泡造影剂对绿荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)质粒在Wistar大鼠胫前肌中表达的作用。方法选用200 g左右成年Wistar大鼠40只,随机分为4组,每组10只,第1组只对大鼠胫前肌注射GFP质粒;第2组对大鼠胫前肌注射GFP质粒和造影剂的混合物;第3组对大鼠胫前肌注射GFP质粒和造影剂的混合物并加超声照射;第4组为阴性对照。12 d后处死动物,取胫前肌标本,制作冰冻切片后立即在荧光显微镜下观察。计数GFP阳性表达细胞数。部分组织经甲醛固定、石蜡包埋,光镜下观察病理改变。结果第3组GFP阳性表达细胞数最多[(345±19)个],与第1组[(109±15)个]、第2组[(111±14)个]差异有统计学意义(P<0.01)。第1组、第2组间差异无统计学意义(P=0.784)。所有受检组织光镜下检查未发现出血、坏死、炎症等病理改变。结论微泡造影剂在诊断超声照射下可以促进局部注射GFP质粒在大鼠胫前肌的转染。     

超声微泡造影剂介导基因治疗卵巢癌的研究进展

卵巢癌基因治疗的关键在于如何安全高效地将外源性基因导入细胞。超声微泡造影剂作为新兴的基因转染载体,有望为卵巢癌基因治疗开辟新的路径。本文就超声微泡造影剂在卵巢癌基因治疗中的研究进展进行综述。     

超声造影剂促进野生型p53基因转染抑制大鼠卵巢癌生长的实验研究

目的 探讨超声辐照造影剂微泡促进野生型p53基因转染进而抑制大鼠卵巢癌生长的有效性。方法构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，将40只卵巢癌荷瘤大鼠分成4组。第1组瘤体内注入造影剂微泡和野生型p53质粒混合物，并用超声辐照大鼠腹部瘤区；第2组注入裸质粒后予以超声辐照瘤体；第3组注射超声造影剂和基因混合物后无超声辐照；第4组仅注入裸质粒而无超声辐照。每组进行基因转染每周1次，共进行8次。2月后用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测野生型p53 mRNA在卵巢癌组织中的表达，Western Blot检测野生型p53基因蛋白表达。结果成功构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，埋线法建立卵巢癌动物模型；用超声波辐照微泡促进基因转染后见p53基因转录及表达。第1组p53 mRNA的表达明显增强，高于其他3组，约是第2组的2．65倍，第4组的5．95倍。第2组高于未行超声辐照组，是第4组的2．23倍。第3、4组基因表达差异无统计学意义；Western Blot分析示p53基因蛋白表达的差异模式基本同mRNA，即第1组p53 mRNA的表达增强，高于其他3组，约是第2组的1．75倍，第4组的3．13倍；第2组高于未行超声辐照组，是第4组的1．79倍；第3、4组基因表达差异无统计学意义。结论瘤体内注射造影剂微泡和野生型p53质粒混合物后行超声辐照，可明显增加质粒基因在癌瘤组织中的导人及表达，超声联合造影剂微泡可作为卵巢癌基因治疗中促进基因转移的辅助方法。     

声学造影剂联合野生型P53质粒治疗大鼠肝癌的实验研究

目的　探讨超声破坏造影剂微气泡介导裸质粒DNA治疗大鼠肝癌的有效性。方法　将 2 4只肝癌模型Wistar大鼠分成 4组。第 1组 ,瘤体内直接注入造影剂和野生型P5 3质粒的混合物 ,立刻用超声照射 ;第2组 ,注射混合物后不用超声照射 ;第 3组 ,注入裸质粒后用超声照射瘤体 ;第 4组 ,仅注入裸质粒而不行超声照射。 2d后 ,用半定量逆转录 -聚合酶链式反应法检测野生型P5 3mRNA在肝癌组织中的表达。结果　第 1组的P5 3mRNA表达明显增强 ,高于其他 3组 (P <0 .0 0 1) ,是第 4组的 6.88倍。第 3组高于未行超声照射组 (P<0 .0 5 ) ,是第 4组的 2 .16倍。第 2组与第 4组在基因表达上的差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。结论　瘤体内直接注射造影剂和野生型P5 3质粒混合物后行超声照射 ,可明显增加裸质粒DNA的转录 ,是一种高效、安全的基因治疗方法。     

超声微泡介导转染FKBP12.6基因对小鼠H9c2(2-1)心肌细胞结构和功能的影响

目的探讨超声微泡介导转染FKBP12.6基因后小鼠H9c2(2-1)心肌细胞结构和功能的变化。方法将pcDNA3.1-FKBP12.6质粒与白蛋白包裹微泡造影剂混合,经超声转染H9c2(2-1)细胞后,通过倒置显微镜和透射电镜观察心肌细胞生长状况和超微结构的变化;荧光显微镜检测细胞内Ca2 浓度的变化;分别用RT-PCR、免疫组织化学检测mRNA、蛋白的表达。结果超声触发微泡破裂转染的FKBP12.6基因可在心肌细胞高效表达,细胞生长良好,蛋白合成活跃。高表达FKBP12.6的心肌细胞中,总的钙离子浓度增加。结论超声微泡介导FKBP12.6基因转染心肌细胞,可以明显改善心肌细胞的结构和功能。