阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡时线粒体膜电位变化

为研究阿糖胞苷(Ara-C)诱导HL-60细胞凋亡时线粒体膜电位(△Ψm)的变化及相互关系,采用Rhodamine123染色及流式细胞术检测HL-60细胞线粒体膜电位变化;流式细胞仪、AO/EB染色检测HL-60细胞凋亡.结果显示Ara-C作用于HL-60细胞6小时时出现细胞线粒体膜电位下降,当Ara-C浓度为0.05 mg/ml作用6、12、24小时时HL-60细胞线粒体中Rhodamine123荧光强度分别为117.9±7.6,100.9±7.7,87.6±10.7,不同时间荧光强度差异有显著性(p＜0.05);当Ara-C浓度为0.1 mg/ml作用6、12、24小时时HL-60细胞线粒体中Rhodamine123荧光强度分别为111.9±10.1,86.6±9.2,68.4±12.2,不同时间差异有显著性(p＜0.05);不同浓度组在12、24小时时比较有显著性差异(p＜0.05).当Ara-C浓度为0.05 mg/ml作用6、12、24小时时HL-60细胞凋亡率分别为(41.2±3.0)%,(53.7±5.1)%,(65.8±2.6)%,不同时间差异有显著性(p＜0.01);当Ara-C浓度为0.1 mg/ml作用6、12、24小时时HL-60细胞凋亡率分别为(45.7±4.1)%,(58.2±4.3)%,(70.1±2.3)%,不同时间差异有显著性(p＜0.01);不同浓度Ara-C在相同时间凋亡率无差别.HL-60细胞线粒体膜电位变化与其凋亡率呈高度负相关,当Ara-C浓度为0.05 mg/ml时,r=-0.89,p＜0.01;当Ara-C浓度为0.1 mg/ml时,r=-0.76,p＜0.01.结论阿糖胞苷在诱导HL-60细胞凋亡时伴有线粒体膜电位下降,两者呈显著负相关.线粒体膜电位下降可能是阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡的重要机制之一.     

地西他滨对白血病细胞DKK1基因去甲基化的实验研究

目的:探讨地西他滨对急性髓系白血病细胞株HL-60中DKK1的表达及其下游Wnt信号通路的影响。方法:采用流式细胞术(FCM)和DNA Ladder分析检测不同浓度地西他滨对HL-60细胞凋亡的影响,甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测DKK1基因甲基化状态,qRT-PCR方法检测mRNA表达水平,Western-blot方法检测蛋白的表达变化。结果:FCM检测结果表明,不同浓度地西他滨作用于HL-60细胞48 h后,地西他滨组的早期凋亡细胞数明显增多(P0.05);DNA梯度检测结果发现,地西他滨组出现明显的细胞凋亡特异性梯度条带;MSPCR检测发现,DKK1基因发生去甲基化,RT-PCR和Wertern blot检测显示mRNA表达水平增高,DKK1蛋白表达增加,β-catenin及C-MYC蛋白表达降低。结论:地西他滨可以通过DKK1基因去甲基化及抑制Wnt通路的作用,促进HL-60细胞凋亡。     

阿糖胞苷在人类髓系、B-淋巴系和T-淋巴系白血病细胞中的细胞药理学

本文比较了阿糖胞苷(Ara-C)在体外对人类髓系(HL-60),B-淋巴系(RPMI-8392)和T-淋巴系(Molt-3)白血病细胞的抑制作用。Ara-C不同浓度、不同接触时间对3种白血病细胞的细胞毒作用如下:持续接触48小时,能杀灭50％细胞的浓度在HL-60、RPMI-8392和Molt-3分别为0.3、2和0.02μM。持续接触48小时,能抑制50％细胞生长的Ara-C浓度依次为0.8、0.5和0.01μM。为解释3种白血病细胞系对Ara-C敏感性的差异,检测了每     

CAG方案对HL-60细胞及耐药株作用机理的研究

目的研究小剂量阿糖胞苷和阿克拉霉素联合G-CSF（CAG方案）对HL-60细胞及其耐药株HL-60／A的作用机理。方法以白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60／A为实验模型，模拟临床给药方式，体外加入Ara-C、ACR、G-CSF三药，作用24、48小时后收集细胞，分别进行细胞计数，细胞形态观察，MTr法检测不同药物对两种细胞株的生长抑制率，流式细胞仪检测细胞早期凋亡标记Anncxin V，细胞分化抗原CD11h以及进行细胞周期分析。结果经CAG作用48h后，两种细胞株数量明显减少，形态显示凋亡小体增多；早期凋亡标记Annexin V明显增高，CD11b表达轻度升高，与CA组比较，结果有显著差异（P〈0．05）。细胞周期分析显示，CAG作用24h后，与CA组比较，S期细胞比例增高（P〈0．05）；48h后比例下降，结果未见明显差异（P〉0．05）。HL-60细胞与HL-60／A细胞比较，两种白血病细胞株经CAG作用48h后，在细胞数量、细胞形态、凋亡细胞比例、CD11b表达及S期细胞比例的改变方面未见明显差异。结论CAG方案对白血病细胞株HL-60、HL-60／A的作用机制主要是通过GCSF促使白血病细胞进入细胞周期S期，增加小剂量Ara-C、ACR对自血病细胞的细胞毒性，以诱导细胞凋亡为主，轻度诱导分化。     

盐酸吉西他滨对慢性粒细胞白血病急变期细胞增殖凋亡的影响

目的观察盐酸吉西他滨对慢性粒细胞白血病（慢粒）急变期细胞增殖凋亡的影响,探讨盐酸吉西他滨用于慢性粒细胞白血病急变期治疗的可行性。方法采用水溶性四唑盐比色法检测盐酸吉西他滨对慢粒急变期K562细胞增殖的影响,采用流式细胞术AnnexinV/FITC法检测盐酸吉西他滨对慢粒急变期K562细胞凋亡的影响。结果 0.1 mg/L、1.0 mg/L、10 mg/L盐酸吉西他滨分别作用K562细胞12 h、24 h、48 h、72 h后,K562细胞增殖受到抑制,抑制作用随浓度时间增加而增强,但48 h和72 h相比差异无统计学意义。吉西他滨组对K562细胞的抑制作用明显强于同浓度同时间的阿糖胞苷组,两者比较差异有统计学意义（P〈0.01）。流式细胞术AnnexinV/FITC法检测结果显示10 mg/L吉西他滨作用于K562细胞48 h凋亡率为（20.56±0.02）%,明显高于阿糖胞苷组（4.68±0.01）%（P〈0.01）和空白对照组（1.92±0.01）%（P〈0.01）。结论盐酸吉西他滨对慢粒急变期K562细胞有一定的增殖抑制及促凋亡作用,且具有剂量和时间依赖性,有望联合其他药物应用于慢粒急变期的治疗。     

c—myc反义寡脱氧核苷酸诱导人髓质白血症细胞系HL—60细胞凋亡

为研究c-myc硫代反义寡脱氧核苷酸对白血病细胞系HL-60诱导细胞凋亡的作用,将人工合成的长度分别为18mer和15mer的硫代反义寡脱氧核苷酸（AspoI和AspoⅡ)转染HL-60细胞,用流式细胞术检测c-Myc蛋白及DNA倍体分析,RT-PCR检测c-myc mRNA水平,电镜观察凋亡细胞的超微结构,琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA降解片段。研究结果发现,经AspoI5μmol/L和10μmol/L作用后c-Myc蛋白分别降低23.8%和45.4%。经AspoⅡ10μmol/L作用后下降38.4%,RT-PCR显示AspoI和AspoⅡ组c-myc mRNA表达明显减少。DNA倍体分析AspoI10μmol/L作用48和72小时细胞凋亡率分别为23.97%和52.6%;AspoⅡ10μmol/L作用48和72小时后细胞凋亡率分别为28.8%和45.19%;而空白对照和正义寡脱氧核苷酸组均未出现凋亡细胞。电镜观察两个反义寡脱氧核苷酸μmol/L作用后均出现细胞固缩,染色质边集,胞浆浓缩等凋亡细胞的改变。反义寡脱氧核苷酸10μmol/L作用48小时后均出现典型的DNA降解片段。本研究结果说明,c-myc反义寡脱氧核苷酸是高特异性的基因药物,对HL-60细胞抑制c-myc mRNA的表达,减少c-Myc蛋白合成,并诱导HL-60细胞凋亡。     

c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性影响及诱导凋亡作用

为了研究c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞端粒酶活性的影响及其诱导凋亡作用,探讨HL-60细胞端粒酶活性与c-myc基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,采用流式细胞术进行细胞凋亡检测及细胞周期分析,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况,应用TRAP-ELISA法测定HL-60细胞端粒酶的活性。结果表明:反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞百分数由55.6%降至30%,并出现早期凋亡峰(凋亡细胞比例占25.2%);琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯形带;端粒酶活性检测发现反义寡核苷酸3,4,5μmol/L作用组OD450-690分别为1.952±0.14,1.805±0.40,1.616±0.41,与未作用组(OD450-690为2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);反义寡核苷酸1和2μmol/L作用组及正义寡核苷酸5μmol/L作用组OD450-690分别为2.324±0.36,2.162±0.38,2.466±0.29,与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:c-myc基因反义寡核苷酸能够通过封闭c-myc基因的表达而诱导HL-60细胞凋亡,阻止细胞由G1期进入S期,并具有下调端粒酶活性作用。     

人脐带间充质干细胞增强全反式维甲酸对HL-60细胞的诱导分化作用

本研究探讨人脐带间充质干细胞(hucMSC)对全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60细胞分化以及对HL-60增殖的影响。HL-60细胞分为4组:未经ATRA处理的对照组、与hucMSC细胞共培养的hucMSC组,经ATRA处理的ATRA组以及经ATRA处理并与hucMSC细胞共培养的ATRA+hucMSC组。在规定时间采用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测对照组和hucMSC组HL-60细胞增殖情况;在光学显微镜下观察各组细胞形态、NBT阳性细胞;应用real-timePCR方法检测c-myc基因表达水平以及流式细胞术检测CD11b表面标志以比较各组中HL-60细胞的分化情况。结果表明:共培养体系中hucMSC细胞能抑制HL-60的增殖,hucMSC∶HL-60为1∶1时,48小时时p0.05,72小时时p0.01;hucMSC∶HL-60为1∶5时,72小时时p0.05。在2μmol/LATRA的刺激下,ATRA+huc-MSC组与ATRA组相比,出现更多具有中性粒细胞形态的HL-60细胞和更高的NBT阳性率(p0.05);ATRA+hucMSC组中HL-60细胞c-myc基因表达更低(p0.05);ATRA+hucMSC组中HL-60细胞CD11b的表达更高(48小时p0.05,72小时p0.01)。结论:脐带间充质干细胞能抑制HL-60增殖并且增强ATRA对HL-60细胞的诱导分化作用。     

吲哚美辛诱导HL-60细胞凋亡过程中伴有β-catenin/c-myc信号转导途径的抑制

目的：研究吲哚美辛对HL-60细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应,从β-catenin信号转导途径揭示其分子机制。方法：以不同浓度的吲哚美辛(0,25,50,100,200,400μmol/LL)作用于HL-60细胞,以锥虫蓝染色确定干预后的HL-60细胞活力;分析HL-60细胞增殖能力;DNA梯状胶电泳鉴定细胞凋亡。Western印迹证明凋亡调节蛋白caspase-3的裂解激活以及β-catenin,c-myc蛋白质的表达。结果：吲哚美辛能明显抑制HL-60细胞增殖和诱导细胞凋亡,并表现出浓度和时间依赖性;HL-60细胞凋亡伴有caspase-3蛋白的表达上调和裂解活化;β-catenin蛋白表达呈吲哚美辛浓度依赖性下调和降解;c-myc蛋白表达呈吲哚美辛浓度依赖性下调。结论：吲哚美辛能抑制HL-60细胞增殖和诱导HL-60细胞凋亡。β-catenin→c-myc信号转导途径受抑与吲哚美辛的抗白血病效应存在一定的联系。     

钠氢交换蛋白在依托泊苷诱导HL-60细胞凋亡中的作用及其机制的初步研究

本研究探讨钠氢交换蛋白(Na+/H+ exchanger-1,NHE1)在依托泊苷诱导HL-60细胞凋亡过程中的表达变化及其对凋亡过程的调控机制。应用DNA片段化检测和远末端缺口标记(TUNEL)法分析细胞凋亡;实时定量聚合酶链反应检测NHE1 mRNA表达量,Western blot法检测NHE1蛋白表达水平,并应用激光共聚焦显微镜分析细胞内pH值(pHi)的变化。同时应用NHE1特异抑制剂卡立泊来德(cariporide)作用于细胞观察凋亡及pHi的变化情况。结果表明:依托泊苷作用24小时后能有效诱导HL-60细胞凋亡,作用12小时后NHE1 mRNA表达增高了2.848±0.886倍(p0.01),NHE1蛋白表达水平也升高(p0.01)。依托泊苷作用24小时后细胞内pHi从7.11升高到7.46,而卡立泊来德预处理组的细胞在依托泊苷处理24小时后pHi没有明显升高并且凋亡率明显降低。结论:依托泊苷诱导的HL-60细胞凋亡过程中会出现NHE1表达上调,凋亡结果依赖于NHE1表达量升高导致的细胞内pH值升高。     

黄芩苷对耐阿霉素白血病细胞株HL-60／ADR增殖、凋亡的影响

本研究探讨中药黄芩苷对耐阿霉素人髓系白血病细胞株HL-60／ADR增殖、凋亡的影响。应用MTT法绘制细胞生长曲线,观察黄芩苷对HL-60／ADR细胞增殖的影响;应用Annexin V FITC／PI双染流式细胞术、DNA片段化、TdT酶介导的原位缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡;RT—PCR检测黄芩苷作用不同时段后c-myc、bcl-2等凋亡相关基因mRNA的表达水平;Western blot法检测凋亡及信号通路相关蛋白C—MYC、BCL-2、pro—caspase-3、PARP、BAD等的表达变化。结果表明,黄芩苷能明显抑制HL-60／ADR细胞增殖所测得的细胞倍增时间为48小时,半数抑制率为28μmol;Annexin V FITC／PI法检测到早期凋亡细胞、DNA片段化,TUNEL法检测到晚期凋亡细胞,细胞凋亡率呈浓度依赖性（20、40、80μmol／L）。黄芩苷作用HL-60／ADR细胞不同时段（12、24、48小时）后C-myc、bcl-2基因mRNA的表达,并随着作用时间的延长而逐渐减弱,C—MYC、BCL-2、procaspase-3、PARP（116kD）蛋白的表达逐渐下降,PARP（85kD）及BAD蛋白表达逐渐增强,呈时间依赖性。结论：黄芩苷能有效抑制HL-60／ADR细胞增殖,诱导其凋亡,上述凋亡相关基因及信号通路相关蛋白可能参与了黄芩苷抑制HL-60／ADR细胞增殖和诱导凋亡的过程：     

TNF相关凋亡诱导配体联合阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡及其机制的研究

本研究探讨人重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（hrsTRAIL）单用或联合阿糖胞苷（Ara—C）诱导HL-60细胞凋亡作用及其机制。在体外以人类急性白血病细胞株HL-60为研究对象，分5组进行细胞培养：对照组、Ara—C组、rsTRAIL组、同时给药组（Ara—C＋rsTRAIL）、先后给药组（Ara—C→rsTRAIL）。采用MTT比色法测定细胞生长抑制率；应用Annexin V／PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡率；使用流式细胞术检测不同浓度的Ara—C对细胞表面DR5表达水平的影响及rsTRAIL单药组、先后给药组细胞表面DR5表达水平和细胞内caspase-8活性。结果表明：rsTRAIL能抑制HL-60细胞生长并诱导HL-60细胞凋亡。先后给药组诱导HL-60细胞凋亡率大于同时给药组。先后给药组细胞表面DR5表达水平和细胞内caspase-8的活性高于rsTRAIL组。5mg／L、10mg／LAra—C作用于HL-60细胞24小时，其细胞表面DR5表达水平升高，大于对照组。结论：rsTRAIL抑制HL-60细胞生长．诱导HL-60细胞凋亡。Ara—C上调HL-60细胞表面DR5表达水平。增强rsTRAIL诱导HL-60细胞凋亡的作用。Ara—C和rsTRAIL联合用药时，在先加Ara—C、再加rsTRAIL组诱导HL-60细胞凋亡的效果比同时给药组效果好，其机制可能与Ara—C上调细胞表面DIL5表达水平和（或）增强细胞内caspase-8的活性有关。     

TGF-β1和(或)三氧化二砷作用于HL-60细胞后P27~(Kip1)表达及凋亡情况的研究

本研究观察三氧化二砷(As2O3)和/或TGF-β1对HL-60细胞凋亡及细胞周期的影响,以及作用前后P27Kip1、内源性TGF-β1、cyclinE和BCL-2的变化情况。As2O3和/或TGF-β1作用于HL-60细胞,用细胞形态学观察及流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期改变情况,应用免疫组织化学检测药物处理前后P27Kip1、内源性TGF-β1、cyclinE以及BCL-2表达的变化情况。结果表明:As2O3和TGF-β1单用均可以诱导HL-60细胞发生凋亡,联合处理对HL-60细胞生长抑制作用强于单药处理,其中5μmol/LAs2O3作用最强,5ng/mlTGF-β1处理可引起HL-60细胞的细胞周期阻滞于G1期(p0.05)。5ng/mlTGF-β1和联合处理组P27Kip1的表达较对照组增强(p0.05);5μmol/LAs2O3处理组P27Kip1的表达与对照组比较无明显差异(p0.05)。5ng/mlTGF-β1和联合处理组均可见cyclinE蛋白表达下调(p0.05)。5μmol/LAs2O3和联合处理组可见内源性TGF-β1表达上调(p0.05)。结论:As2O3、外源性TGF-β1均可诱导HL-60细胞凋亡,联合处理组诱导凋亡作用强于对照组和单药处理组,TGF-β1处理可引起HL-60细胞周期阻滞于G1期。TGF-β1诱导HL-60细胞凋亡过程中P27Kip1表达增强,拮抗cyclinE和BCL-2的作用,细胞周期阻滞,诱导细胞发生凋亡,这表明P27Kip1是TGF-β引起细胞周期阻滞的关键效应物,外源性TGF-β1又通过上调内源性TGF-β1的表达增强As2O3诱导原代APL细胞凋亡的作用。     

脐带间充质干细胞降低HL-60对阿糖胞苷的敏感性

本研究探讨脐带间充质干细胞（hUC-MSC）对HL-60白血病细胞药物治疗敏感性的影响,为研究hUC-MSC对白血病细胞的调节作用提供资料。体外建立HL-60细胞与hUC-MSC的transwell及直接接触共培养体系;使用流式细胞仪检测阿糖胞苷对HL-60细胞凋亡的影响,并检测与hUC-MSC共培养对HL-60细胞细胞周期的影响;应用RT-PCR和Western blot检测Caspase 3 mRNA和蛋白表达变化;通过transwell共培养体系观察hUC-MSC对HL-60细胞凋亡影响的作用机制。结果表明,与hUC-MSC共培养可以显著减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡（P〈0.05）;hUC-MSC可以将HL-60细胞阻滞于G0/G1期,阻止其进入S期（P〈0.05）;与hUC-MSC共培养可以降低HL-60细胞中Caspase 3 mRNA和蛋白水平的表达（P〈0.05）;transwell体系中hUC-MSC同样可以减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞的凋亡（P〈0.05）。结论：hUC-MSC通过分泌可溶性细胞因子减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡,其机制可能与通过调节HL-60细胞周期及下调Caspase 3表达有关。     

三氧化二砷对白血病HL-60细胞株的凋亡作用

目的：探讨三氧化二砷对HL-60的诱导凋亡作用。方法：琼脂糖电泳检测DNA条带;Hoecst 33258染色后荧光显微镜观察细胞核的变化。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：10μmol/L三氧化二砷处理HL-60细胞24~48 h可见到DNA出现梯形条带;处理24~48 h HL-60细胞核呈现细胞核浓缩和核碎裂现象。流式细胞仪测定12、24、和48 h的细胞凋亡率分别为（8.5±2.1）%、（12.8±3.4）%及（21.4±5.8）%,而培养48 h的HL-60细胞自然凋亡率仅为（1.5±0.5）%（P〈0.05）。结论：三氧化二砷可诱导HL-60细胞凋亡。     

mPGES-1抑制剂MK886对白血病HL-60细胞周期的影响

本研究探讨膜结合型前列腺素E2合酶1(mPGES-1)抑制剂MK886对人急性髓系白血病HL-60细胞周期的作用。采用流式细胞仪分析技术、Western blot、ELISA等方法检测不同浓度MK886(10、25、50μmol/L)对HL-60细胞周期的作用及对细胞周期调控因子周期蛋白D1、mPGES-1、PGE2、Akt、P-Akt、C-MYC蛋白的影响。结果表明:与正常人外周血单个核细胞比较,G0/G1期HL-60细胞比例减少,S期比例增多。MK886作用24 h后,被阻滞于G0/G1期的细胞增多,同时细胞mPGES-1表达下调,合成PGE2减少,P-Akt、C-MYC、周期蛋白D1蛋白表达下降。结论:MK886对白血病HL-60细胞有细胞周期阻滞作用,其机制可能与抑制mPGES-1表达,减少PGE2的合成,抑制Akt磷酸化及C-MYC表达,下调周期蛋白D1表达有关。     

尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡机制影响的研究

为了研究尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡机制的影响，采用琼脂糖凝胶电泳检测其DNA凋亡带，用细胞免疫组织化学方法检测细胞凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达。结果表明，实验组自培养8小时起琼脂糖凝胶电泳显示典型的DNA梯形凋亡带。Bcl-2蛋白表达在各实验组随培养时间延长逐渐下降，而Bax蛋白的表达则逐渐增加，Bcl-2／Bax比值逐渐下降，8小时就与对照组出现差异（P〈0.05）。结论：尼莫地平及阿糖胞苷均能促进HL-60细胞凋亡，诱导其凋亡的机制与下调bcl-2及上调bax基因的蛋白表达有关。尼莫地平能加强阿糖胞苷促进HL-60细胞凋亡，其机制与协同下调bcl-2的表达有关。