腺病毒载体介导的内皮抑素基因治疗小鼠黑素瘤的实验研究

目的 探讨腺病毒载体介导的内皮抑素基因(Ad-mES)在体外和体内的生物学活性.方法 不同感染复度(MOI)的腺病毒体外感染靶细胞;RT-PCR法检测目的基因的表达;MTT法检测Ad-mES对靶细胞生物活性的影响.观察各组小鼠黑素瘤的生长、转移和生存率;免疫组化法鉴定肿瘤组织内内皮抑素蛋白的表达.电子透射电镜观察肿瘤组织内皮细胞、肿瘤细胞的凋亡情况.结果 腺病毒体外能够有效感染靶细胞,MOI为10,20,50,100,200,500时,B16F10细胞和ECV304细胞的腺病毒感染率分别为15.6%、35%、73%、88%、95.2%、97%和19%、35%、80%、90%、97%、98.5%.靶细胞明确表达内皮抑素基因;Ad-mES对B16F10细胞的增殖没有影响;而Ad-mES能抑制ECV304细胞的增殖,且随MOI增大,抑制内皮细胞增殖效果越强.瘤细胞接种后第8天,各组成瘤率100%.开始出现小鼠死亡的最早日:PBS组第16天、Ad-GFP组第18天、Ad-mES单剂、重复治疗组均在第20天.结论 Ad-mES体外和体内均影响靶细胞的生物学活性;Ad-mES治疗组小鼠平均生存时间延长(P<0.05),肿瘤体积增长减慢(P<0.05).     

血管内皮生长因子-阿柔比星脂质体靶向杀伤恶性黑素瘤细胞的实验观察

目的 应用包裹阿柔比星的血管内皮生长因子（VEGF）的长循环脂质体（阿柔比星-VEGF-SSL）于体外靶向杀伤恶性黑素瘤细胞。方法 通过体外结合试验，验证阿柔比星-VEGF-SSL对恶性黑素瘤A375细胞的特异结合能力。通过体外细胞毒试验（MTT），检测阿柔比星-VEGF-SSL对A375细胞增殖活性的影响。结果 阿柔比星-VEGF-SSL可与A375细胞特异结合，结合率可达非特异性脂质体的2.15倍。阿柔比星-VEGF-SSL可特异抑制A375细胞的增殖活性。48 h细胞毒试验阿柔比星-VEGF-SSL抑制A375细胞增殖活性的作用与游离阿柔比星相似（P ＞ 0.05），优于无VEGF的阿柔比星脂质体（阿柔比星-SSL）（P ＜ 0.05），而对非靶细胞（黑素细胞）增殖活性的抑制作用弱于两者。0.5 h预处理试验表明：缩短药物与细胞接触时间后，阿柔比星-VEGF-SSL仍保持较强抑制A375细胞增殖活性的作用。结论 阿柔比星-VEGF-SSL可特异性识别恶性黑素瘤A375细胞，并作为良好载体将阿柔比星带入瘤细胞，显著抑制A375细胞的增殖活性，实现其靶向杀伤作用。     

恶性黑素瘤内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的表达

目的 探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和血管内皮生长因子(VEGF)与人恶性黑素瘤血管生成的关系。方法 免疫组化法检测31例人恶性黑素瘤标本eNOS、VEGF和第Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)血管内皮细胞特异性染色,计数肿瘤微血管密度(MVD)。结果 24例恶性黑素瘤组织表达eNOS,26例表达VEGF,色素痣组织不表达eNOS和VEGF;VEGF与eNOS的表达呈正相关;eNOS、VEGF的表达与恶性黑素瘤MVD呈正相关,恶性黑素瘤MVD明显高于色素痣;eNOS、VEGF表达与淋巴结转移无关。结论 MVD随着eNOS和VEGF表达的增强而增加。     

腺病毒介导p27mt基因转移诱导恶性黑素瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨突变型p27基因(p27mutant type gene;p27mt)对恶性黑素瘤A375细胞凋亡的调节作用。方法:利用重组腺病毒Ad-p27mt转染培养的人恶性黑素瘤A375细胞,用3H-TdR掺入法检测细胞增殖;流式细胞术、DNA片段分析法、TUNEL法检测细胞凋亡。结果:重组腺病毒Ad-p27mt在MOI≥50时,可达到100%的转导效率。Ad-p27mt转染恶性黑素瘤细胞A375后,3H-TdR掺入法检测发现细胞增殖抑制;流式细胞术检测在G1期前出现亚二倍体凋亡峰;细胞DNA抽提电泳后发现凋亡特征性梯带。TUNEL法检测凋亡指数分别为48.5±3.6(Ad-p27mt组)及4.2±0.8(空白对照组),差异有显著性(P<0.01)。结论:重组腺病毒介导的p27mt基因转移可诱导恶性黑素瘤A375细胞在Gl期阻滞并导致细胞凋亡。     

重组腺病毒介导金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在小鼠B16黑素瘤细胞中的表达

目的 研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因通过重组腺病毒介导转染入B16黑素瘤细胞中的表达情况。方法 用RT-PCR和流式细胞仪检测SEA基因在B16黑素瘤细胞中的表达。结果 在转染SEA基因的B16黑素瘤细胞中检测到SEA基因的转录,并于转染后24h开始有SEA蛋白的表达,到72h表达量达最高值87.22,之后减弱,直到168h仍有少许表达。结论 SEA基因可以在B16黑素瘤细胞中表达,为下一步黑素瘤的基因治疗奠定基础。     

血管内皮生长因子-siRNA对恶性黑素瘤细胞生长的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响。方法 构建针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA将其表达载体经电穿孔转染A375细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫酶联吸附实验(ELISA)方法 检测转染后的A375细胞VEGF的mRNA和蛋白表达,应用细胞计数比较转染组和对照组A375细胞增殖能力,将含转染组和对照组A375细胞的上清液分别培养人静脉内皮细胞(ECV-304),观察其生长情况,并用流式细胞仪观察转染pU-VEGF-siRNA载体对A375细胞凋亡的影响。结果 转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375细胞的VEGFmRNA和蛋白表达均较对照组明显下降,并且其生长缓慢,其细胞周期出现亚二倍凋亡峰。用转染pU-VEGF-siRNA的A375细胞上清液培养的ECV-304细胞增殖力较对照组下降。结论 通过RNA干扰技术阻断VEGF的表达,可抑制A375和ECV-304细胞增殖,诱导A375细胞凋亡。     

腺病毒载体介导的PML生长抑制因子转染人角质形成细胞的实验研究

目的探讨腺病毒介导的PML基因对角质形成细胞(KC)的生长抑制作用。方法用原位杂交和免疫组织化学法分别检测PML基因重组腺病毒的转导效率,观察培养人KC中PMLmRNA和蛋白的表达量及表达时间,MTT法检测PML基因转染后人KC的生长状况,观察转染PML基因后KC的增殖能力的变化。结果腺病毒滴度为100MO I时被转染的人KC可达100%,Ad-PML基因转染的人KC能高效表达PMLmRNA和PML蛋白,表达时间可持续2周以上,PML基因对人KC体外生长具有明显抑制作用。结论腺病毒介导的PML基因能在人KC中高效稳定地表达,能显著抑制人KC的体外生长,PML生长抑制因子有可能用于银屑病等皮肤病的基因治疗。     

携带IL-18基因的溶瘤腺病毒对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤的抗肿瘤作用

目的 探讨携带IL-18基因的溶瘤腺病毒（ZD55-IL-18）对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤的抗肿瘤效果。方法 取A375细胞2 × 106个接种于BALB/c裸鼠腋下组织内,建立裸鼠黑素瘤模型,当移植瘤体积达100 ~ 150 mm3时将其随机分为3组,每组8只,分别于瘤体内注射ZD55-IL-18、Ad-IL-18和磷酸盐缓冲液（PBS）。通过定期测量肿瘤体积观察肿瘤生长抑制情况,并切取肿瘤进行HE染色,观察肿瘤细胞生长形态;激光共聚焦显微镜下观察移植瘤组织IL-18表达水平、E1A蛋白的表达情况。免疫组化检测荷瘤裸鼠肿瘤组织CD34染色标记测定的肿瘤组织微血管密度;TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡情况。结果 肿瘤生长曲线表明,ZD55-IL-18处理组肿瘤生长速度较PBS组明显减慢,接种44 d后ZD55-IL-18组肿瘤平均体积为（1039.378 ± 29.67） mm3,Ad-IL-18组为（2900.46 ± 62.65） mm3,PBS组为（3980.24 ± 63.78） mm3,各组间差异有统计学意义（P < 0.01）。HE染色发现,ZD55-IL-18处理组细胞核深染,很少见核仁,显示肿瘤组织生长抑制。激光共聚焦结果表明,ZD55-IL-18处理组IL-18的表达阳性率比Ad-IL-18处理组明显增强（P < 0.01）,并可以在肿瘤组织中表达E1A蛋白;免疫组化检测显示,ZD55-IL-18治疗组肿瘤微血管密度明显低于PBS组（P < 0.05）。不同处理组移植瘤细胞凋亡阳性率ZD55-IL-18处理组（86.28% ± 3.25%） ＞ Ad-IL-18处理组（43.67% ± 3.46%） ＞ PBS处理组（10.73% ± 2.48%）,各组之间差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论 携带IL-18基因的溶瘤腺病毒ZD55-IL-18对裸鼠恶性黑素瘤移植瘤的生长及转移有抑制作用,并探讨了其可能的作用环节。     

血管内皮生长因子165基因转染小鼠硬皮病皮损的实验研究

目的:探讨硬皮病基因治疗的新方法。方法:建立小鼠硬皮病动物模型后,应用电穿孔技术将血管内皮生长因子(VEGF)165真核表达质粒导入硬皮病小鼠硬化的皮下;再利用免疫组化、原位杂交法检测小鼠硬皮病皮损VEGF165的表达及观察组织病理改变。结果:①转基因后硬皮病鼠毛发生长明显增多,而未转基因硬皮病鼠毛发未见生长。②组织病理检查示转基因鼠毛囊明显增生,毛囊数每一低倍视野平均为(12.0±1.6)个,显著高于未转基因硬皮病鼠组(P<0.05)。真皮厚度增加,新生血管增加。③免疫组化、原位杂交法检测示转基因鼠表皮和真皮细胞及间质VEGF165表达明显增加。结论:电穿孔技术可将外源性基因转入小鼠硬化的皮肤,使其高表达。外源性VEGF165基因转染后,可明显促进小鼠硬化的皮肤毛发生长,已萎缩的真皮组织增生。     

溶瘤腺病毒介导IL-24增强黑素瘤细胞MV3放疗敏感性的研究

目的:研究溶瘤腺病毒介导IL-24(ZD55-IL-24)对黑素瘤细胞MV3放疗敏感性的影响。方法:将对数生长的MV3细胞分为ZD55-IL-24联合放疗组、ZD55-IL-24组、放疗组、PBS对照组。应用免疫细胞化学法检测黑素瘤MV3细胞中Bax和Bcl-2凋亡相关蛋白的表达:应用Western blot法检测E1A蛋白及Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡相关蛋白的表达。结果:免疫细胞化学法检测联合治疗组Bax染色强度最大,Bcl-2染色强度最小。ZD55-IL-24联合放疗作用的MV3细胞高效表达E1A,较其它组Bax的表达量增加,Bcl-2的表达量降低,Caspase-3活化更明显。结论:ZD55-IL-24联合放疗有明显的协同杀伤黑素瘤细胞的作用。     

BRAF基因突变与皮肤恶性黑素瘤

BRAF基因,位于染色体7q34编码一个67 000～99 000的丝,苏氨酸蛋白激酶,其产物在丝裂原活化蛋白激酶信号途径中起重要调控作用.国内外的研究者先后发现并揭示出BRAF基因变异与皮肤恶性黑素瘤的关系.随着探索的深入,部分学者以BRAF基因作为治疗靶向进行研究,并初步取得成果.对BRAF基因及其突变的研究可能在未来恶性黑素瘤诊断、治疗以及预后等方面产生临床价值,为恶性黑素瘤的治疗开辟新的方向.     

The efficacy of retroviral herpes simplex virus thymidine kinase gene transfer and ganciclovir treatment on the inhibition of melanoma growth in vitro and in vivo

Abstract  One approach to gene therapy of cancer is based on the insertion of a suicide gene into tumor cells and subsequent activation of the suicide mechanism. We used the herpes simplex virus thymidine kinase (HSVtk) gene followed by ganciclovir (GCV) treatment. The goal of our experiments was to determine the effectiveness of HSVtk gene therapy in malignant melanoma. B16BL6 murine melanoma cells retrovirally transduced with the HSVtk gene became sensitive to low concentrations of GCV. Analysis by RT-PCR showed HSVtk expression in transduced B16BL6tk⁺ cells. Apoptotic cell death was found in B16BL6tk⁺ cells treated with GCV (20 μM). The sensitivity of B16BL6tk⁺ cells to GCV was also examined in vivo. Tumors inoculated subcutaneously into C57BL6 mice regressed rapidly when treated with GCV (50 mg/kg twice a day) and disappeared completely after 14 days treatment. The mice remained in remission for 5 months. A bystander effect through which nontransduced B16BL6 cells were also inhibited by GCV administration when cocultured with B16BL6tk⁺ cells was expected. However, only slight killing of nontransduced cells was observed in vitro. Analysis of the bystander effect in vivo showed complete regression of tumors inoculated with a mixture of cells mostly consisting of B16BL6tk⁺ cells. A distant bystander effect was also examined. There was no regression of wild-type tumors raised at a distant site from primary B16BL6tk⁺ tumors. The failure of a more effective bystander effect indicates the need for further investigation of the possible use of combined gene therapy to treat melanoma. Received: 30 May 2001 / Revised: 19 July 2001 / Accepted: 30 August 2001     

乙酰肝素酶-siRNA表达载体的构建及其抑制黑素瘤细胞株体外侵袭能力的观察

目的 构建针对人乙酰肝素酶（HPSE）基因的小干扰RNA（siRNA）及其表达载体，观察其对A375细胞HPSE基因的干扰作用及其对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用。方法 设计并构建了重组质粒pRNATU6.1/HPSE-siRNA，转染A375细胞，用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别测定HPSE基因RNA和蛋白水平的表达变化，Matrigel侵袭实验观察A375细胞体外侵袭能力的改变。结果 将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段正确克隆到pRNATU6.1载体；转染A375细胞，与对照组比较，HPSE-siRNA组HPSE基因和蛋白的表达均明显降低。转染后肿瘤细胞的体外侵袭能力与对照组相比受到明显抑制。结论 成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体，HPSE-siRNA转染A375细胞可以显著降低细胞HPSE基因和蛋白的表达。     

光动力学结合脱色素疗法治疗黑素瘤

黑素瘤是一种来源于黑素细胞恶性程度较高的恶性肿瘤。研究证明,遗传和环境因素,比如紫外线损伤可以引起皮肤黑素细胞向黑素瘤转化。虽然黑素瘤只占皮肤癌患者的4%,但是死亡率占皮肤癌死亡人数的70%［１］。梅奥医学院的统计显示,在全球范围内,黑素瘤的发病率正在逐年上升［2］。因此,找到黑素瘤有效的治疗方法有着重要的意义。研究发现,早期手术大多可取得良好疗效［3］。由于黑素瘤早期转移率高,对多数患者而言,确诊黑素瘤时已错过了最佳手术时机。对传统的抗癌方法包括,化疗,放疗等,黑素瘤则表现出了极强的抵抗力……     

组氨酸三聚体核苷结合蛋白1在黑素瘤组织中的表达及其基因启动子甲基化水平研究

目的：检测组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（HINT1）在黑素瘤中的表达和HINT1基因启动子甲基化状态,探讨HINT1启动子甲基化与临床病理参数的关系。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）法检测56例黑素瘤及瘤旁组织和51例色素痣组织中HINT1基因启动子区甲基化水平,免疫组化法检测56例黑素瘤和51例色素痣组织中HINT1蛋白的表达。结果 MSP显示,黑素瘤组织、瘤旁组织及色素痣组织中HINT1基因启动子区甲基化率分别为76.8%（43/56）、33.9%（19/56）和35.3%（18/51）,黑素瘤组HINT1基因启动子区甲基化率明显高于瘤旁组织组和色素痣组,且差异有统计学意义（χ2=20.810、18.749,均P<0.05）,瘤旁组织组与色素痣组间差异无统计学意义（χ2=0.022,P>0.05）。免疫组化显示,56例黑素瘤和51例色素痣组织中分别有12例（21.4%）和42例（82.4%）HINT1蛋白阳性表达,两组阳性率差异有统计学意义（χ2=39.633,P<0.01）。12例HINT1蛋白阳性的黑素瘤组织中,有6例HINT1基因启动子甲基化,而在44例HINT1蛋白阴性的癌组织中HINT1启动子甲基化率高达84.1%（37/44）,两组差异有统计学意义（χ2=6.147,P=0.013）。56例黑素瘤中,HINT1基因启动子区甲基化率在Clark分级Ⅰ~Ⅱ级组（59.1%,13/22）与Ⅲ~Ⅴ级组（88.2%,30/34）间差异有统计学意义（χ2=6.365,P=0.012）。结论 HINT1在黑素瘤组织中低表达,其机制可能与启动子区发生高甲基化有关;HINT1启动子区高甲基化可能参与黑素瘤的发生及发展。     

短发卡RNA对人黑素瘤细胞BRAF基因的沉默作用

目的构建BRAF基因序列特异性的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,检测其对人黑素瘤细胞BRAF基因的干扰作用。方法设计2条BRAF基因序列特异性的shRNA编码序列和1条非特异性阴性对照序列,插入质粒pGenesil-1,双酶切和测序鉴定。用构建成功的3条质粒转染人黑素瘤细胞株A375和M14,分别采用RT-PCR和蛋白印迹检测其BRAF基因的mRNA和蛋白表达。结果所设计的shRNA序列被正确插入质粒pGenesil-1。非特异性对照质粒neg对黑素瘤细胞BRAF基因表达不产生干扰,2条序列特异性质粒braf1和braf2抑制了BRAF基因mRNA和蛋白的表达,其中braf1干扰效果最为明显,最高抑制率可达90%。结论质粒介导的shRNA可成功干扰人黑素瘤细胞BRAF基因的表达,其抑制时间可持续至少1个月。     

CDK2基因沉默联合达卡巴嗪对B16-F1黑素瘤的生长抑制作用

目的 探讨CDK2基因沉默后对达卡巴嗪(DTIC)治疗B16-F1黑素瘤抑瘤效应的影响.方法 实验设对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组,MTT法检测各组细胞生长抑制情况,计算药物相互作用指数(CDI值),AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况.建立C57 BL/6小鼠B16-F1细胞移植瘤模型,分组实验,持续观察18d,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率,TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组在72h的细胞相对存活率分别为(40.6±2.8)％、(45.2±3.7)％、(28.7±2.1)％,细胞凋亡率分别为(25.1±3.3)％、(15.6±2.2)％和(45.6±3.5)％,细胞相对存活率显著降低(F=458.04,P＜ 0.05)而细胞凋亡率显著升高(F=115.46,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组比DTIC组的细胞相对存活率显著降低(P＜0.01),而细胞凋亡率显著升高(P＜0.01);两药相互作用指数(CDI值)＜0.7.治疗第6天,对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤体积分别为(185.44±68.97) mm3、(83.91±14.33)mm3、(123.70±20.85) mm3、(34.54±10.72) mm3.从治疗的第6天开始,与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显降低(F=11.819,P＜0.05),而CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显低于DTIC组(P=0.04);与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长抑制率分别为52.2％、41.2％、86.4％,组织细胞凋亡指数分别为(32.93±3.72)％、(21.62±3.54)％、(63.29±4.74)％,组织细胞凋亡指数显著升高(F=222.25,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组的组织细胞凋亡指数显著高于DTIC组(P＜0.01).结论 沉默CDK2基因的表达可以增加DTIC对黑素瘤的生长抑制作用,二者体外有协同效应,通过增加肿瘤细胞的凋亡是其机制之一.     

RNA干扰技术抑制人恶性黑素瘤细胞A375中淋巴样增强因子mRNA及蛋白表达

目的 利用RNA干扰技术,以淋巴样增强因子(LEF-1)为靶基因,设计、构建重组体,研究其对人恶性黑素瘤细胞A375中LFF-1表达的抑制作用。方法 设计、合成针对LEF-1 mRNA序列的有小发夹结构的正义和反义寡核苷酸,退火后与表达载体Psilencer3.1-H1 neo相连接,经鉴定正确后转染人恶性黑素瘤细胞A375,以G418筛选,获得稳定转染细胞株,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)和免疫细胞化学方法检测转染细胞中LEF-1 mRNA及蛋白表达水平的改变。结果 成功构建了靶向人LEF-1基因的siRNA表达载体,获得稳定转染细胞株,转染细胞LEF-1 mRNA及蛋白水平明显下调。结论 靶向LEF-1的RNA干扰重组体可抑制人恶性黑素瘤细胞A375中LEF-1表达。     

环氧合酶2在人恶性黑素瘤中高表达

目的 探讨恶性黑素瘤组织及黑素瘤细胞系中环氧合酶2(COX-2)的表达及意义.方法 免疫组化法比较性研究25例皮内痣、45例恶性黑素瘤COX-2蛋白的表达情况.并结合患者的临床资料进行分析.同时,免疫印迹法检测正常黑素细胞及3种黑素瘤细胞系中COX-2蛋白的表达情况.结果 在恶性黑素瘤中,COX-2蛋白阳性表达率为80%(36/45),显著高于皮内痣组0%(0/25)(P<0.05);肿瘤组织中COX-2蛋白表达与淋巴结转移、TNM分期密切相关(P<0.05).正常黑素细胞COX-2阴性表达,3种恶性黑素瘤细胞系中A375、1585细胞COX-2表达水平明显升高,而Libr细胞未见阳性表达.结论 COX-2在恶性黑素瘤组织及细胞系中表达率显著升高,可能在恶性黑素瘤发生发展中具有一定作用.