新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的 探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的体外培养和纯化方法，为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法 用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs，比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果，根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度，同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果 体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论 新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的分离培养及形态学研究

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells OECs)的分离培养方法并观察其形态。方法：采用差时贴壁和阿糖胞苷(Ara—c)抑制相结合的方法培养嗅鞘细胞,并在不同阶段进行观察和行NGFRp75和GFAP免疫组化染色鉴定。结果：成功培养出高纯度的嗅鞘细胞,胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形3种类型,突起细长编织成网状。结论：差时贴壁和Ara—c抑制相结合的纯化培养方法是一种简单而又有实效的嗅鞘细胞培养方法。     

成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养、鉴定与纯化

目的:探讨嗅黏膜中嗅鞘细胞的培养方法.方法:取成年大鼠嗅黏膜,采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,并采用免疫荧光法进行鉴定与形态学观察.结果:通过差速贴壁法纯化,可获得纯度约为80%的嗅鞘细胞,并通过GFAP免疫荧光及P75和hoechst双重免疫荧光鉴定;相差显微镜下细胞形态以梭形、双极及三极细胞为主,有少量的多极细胞.结论:从成年大鼠嗅黏膜中成功分离培养出嗅鞘细胞,为从人鼻腔嗅黏膜中培养嗅鞘细胞提供重要的依据.     

新生大鼠嗅鞘细胞在再生丝素膜上的生长

目的 观察新生大鼠嗅鞘细胞在再生丝素膜上的生长情况，探讨再生丝素膜在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中成为细胞培养基质的可能性。方法 采用静置贴壁培养法体外培养分离的新生大鼠嗅鞘细胞，免疫酶和免疫荧光方法染色鉴定，观察在再生丝素膜上嗅鞘细胞的生长，并用MTT法测定细胞生长曲线。结果 再生丝素膜对新生大鼠嗅鞘细胞的贴壁能力和形态未见明显改变，也未见明显毒性，并能支持细胞正常生长，呈现正常的生长繁殖曲线。结论 再生丝素膜对新生大鼠嗅鞘细咆具有良好的细胞相容性。     

大鼠嗅鞘细胞的纯化及活性检测

目的采用改良差速贴壁联合胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞,并检测嗅鞘细胞的生物活性。方法分离新生7d的SD大鼠嗅球嗅鞘细胞,分组后采用改良的6h和18h两次差速贴壁法联合不同时段（1、3和5min）胰酶消化法纯化培养,观察不同时段纯化的嗅鞘细胞的形态特点及生长情况;应用FITC标记的神经生长因子受体p75抗体（兔抗鼠NGFRp75抗体）检测嗅鞘细胞并评估细胞纯度;应用CCK-8法和酶联免疫吸附法分别检测嗅鞘细胞在纯化后3～15d的增殖活性和分泌脑源性神经营养因子的含量。结果随着细胞的生长,梭形的嗅鞘细胞逐渐增多;改良差速贴壁联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞纯度分别为（57.52±2.13）%、（78.95±2.60）%、（49.01±0.74）%,3min组最明显,组间两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）;改良差速贴壁法联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞在纯化后7、9、11d时增殖的细胞数目和脑源性神经营养因子分泌量显示3min组最优,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论改良差速贴壁（6h＋18h）联合胰酶限时消化3min的纯化方法能获得较高纯度的嗅鞘细胞。     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分禽、培养和纯化

目的采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3（NT3）和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养，探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法。方法对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10％胎牛血清和含2．5％胎牛血清、NT3的DMEM—F12培养基进行原代培养。观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化．采用p75^NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测。结果人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极，伴有细长的突起。p75^NTR和GFAP染色均呈阳性反应，体外培养9d时纯度可达83％。结论差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞。     

新生大鼠嗅鞘细胞的体外培养和纯化

目的建立一种可行的体外培养和纯化嗅鞘细胞（OECs）的方法.方法利用显微外科技术,从新生大鼠脑中取出嗅球的嗅神经组织,去除脑膜和微血管,消化后细胞接种在含有10%的DMEM/F12（1：1）培养液中于体外进行培养,应用含血小板凝集抑制素、牛垂体提取液的DMEM/F12培养液,将这些细胞接种于p75包被的培养皿中纯化培养.用P75抗体免疫组织化学染色鉴定OECs,计算纯化度.结果OECs的外形主要以突起细长的双极和三极为主,随时间延长细胞生长排列呈现一定方向性.P75抗体免疫组化呈阳性.此方法获得的OECs纯度可达90%以上.结论本研究所建立的培养方法可行,适宜从新生大鼠中获得嗅鞘细胞.     

大鼠嗅鞘细胞的培养和纯化

目的　建立一种可行的培养和纯化嗅鞘细胞的方法以对其进行研究。方法　利用显微外科技术 ,从新生大鼠脑中取出嗅球的嗅神经组织 ,去除脑膜和微血管 ,消化后细胞以 1× 10 6个细胞 /ml接种在含有 10 %的DMEM/F12 ( 1∶1)培养液中于体外进行培养 ,利用阿糖胞苷Arac和Thy1.1单抗去除成纤维细胞 ,胰酶传代时通过仔细的监测将星形胶质细胞去掉 ,通过纯化获得大量的嗅鞘细胞。结果　嗅鞘细胞较容易培养 ,其增殖速度较快 ,污染的星形胶质细胞和成纤维细胞可有效地被去除 ,显微镜下嗅鞘细胞有卵圆形的胞体和长的、细的突触 ,为双级或多级的细胞 ;透射电镜显示细胞具有锯齿状的核 ,伴有大块染色体和电子密度的胞浆及散在的纤维。形态学和超微结构显示我们获得了较纯的细胞。结论　所建立的培养方法可行 ,适宜从新生大鼠中获得嗅鞘细胞。     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化

目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.     

成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养与鉴定

目的 探索一种简便、经济实用的获得成年大鼠嗅鞘细胞的方法.方法 无菌条件下取2.5月龄的SD大鼠嗅球最外二层,经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中.采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养.定期进行形态学观察并摄片.在培养第14 d行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经生长因子受体(NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定,并计算嗅鞘细胞的纯度.结果 培养的嗅鞘细胞呈双极、多突起形、扁圆形三种,其中扁圆形较少,嗅鞘细胞的纯度在90%以上.结论 差速贴壁和阿糖胞苷化学抑制相结合进行成年大鼠嗅鞘细胞原代培养是一种简便经济实用的方法,可获得高纯度的嗅鞘细胞.     

免疫吸附法纯化人胚嗅鞘细胞的实验研究

目的:探索分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法。方法:分离人胚嗅球,采用胰酶消化获取单细胞悬液,应用含Forskolin、BPE的DMEM/F12培养基,接种于p75包被的培养皿,培养2周后细胞行免疫组化染色鉴定。结果:培养细胞形态多为2￣4极细胞,成纤维细胞少,嗅鞘细胞纯度非常高,嗅鞘细胞标志物p75阳性。结论:嗅鞘细胞体外分离培养条件要求极高,应用p75免疫吸附纯化培养的嗅鞘细胞效果好。     

嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子含量的测定

目的观察嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子(GDNF)的含量随培养时间的变化关系，为选择嗅鞘细胞移植的最佳时间提供理论依据。方法采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅球及嗅粘膜嗅鞘细胞，培养21天，3天留取标本一次，采用ELISA法对上清GDNF进行测定。结果GDNF的含量随培养时间的延长逐渐升高，但绝对含量很低。结论培养的嗅鞘细胞能分泌GDNF，细胞移植在14天以后为宜。     

胎鼠嗅球分离培养出神经干细胞的研究

目的研究胎鼠嗅球中分离培养产生神经千细胞(NSCs)的情况。方法取孕16～18d的孕鼠。取胎鼠的嗅球,用含10％FCS的培养基培养传代分离出的细胞。免疫细胞化学方法鉴定培养和传代出的细胞,对染色阳性的细胞计数检测纯度。结果P^75染色阳性证明分离培养的细胞为嗅鞘细胞(OECs)；来源于嗅球的细胞培养出的神经球行NeS血染色阳性证明为NSCs；传代OECs纯度为95%-98％。结论胎鼠嗅球中可分离培养出NSCs,OECs可稳定传代。可以作为移植用的种子细胞。     

大鼠嗅球成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞（Olfactory cnsheating cells,OECs）分离与培养的方法。方法：无菌条件下嗅球置于少量人工脑脊液中，用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压，得片状组织块，胰酶消化，吹打，细胞悬液进行培养。结果：本方法分离、培养的OECs具有双极或多极突起，且突起十分细长，神经生长因子受体和胶质纤维酸性蛋白免疫组化呈阳性。结论：该方法简便易行，为深入研究OECs神经生物学特性、阐明促进中枢神经元轴突生长的作用机制打下基础。     

大鼠嗅成鞘细胞培养不同分离方法对纯度的影响

目的通过对多种分离方法的比较获得较为理想的嗅成鞘细胞的分离措施。方法应用3种不同分离方法各取12份样本,对同一条件下培养10d的细胞纯度进行p75NGFR免疫细胞化学测定及统计分析;结果(1)3种不同分离方法取材平均活细胞率:传统分离法(组)为84.52%,直接挤压法(组)为97.33%,机械过滤法(组)为83.97%,直接挤压(组)法分散后的OECs活细胞数量最多(P<0.05);(2)3种分离方法取材、培养所获得的OECs纯度:传统分离法(组)为67.58%,直接挤压法(组)为91.23%,机械过滤法(组)为63.51%;直接挤压法(组)培养细胞纯度最高(P<0.05)。结论嗅成鞘细胞最佳分离措施为直接挤压法,应用直接挤压法可收获大量嗅成鞘细胞,对OECs进一步的基础研究以及将来的临床应用奠定了基础。     

嗅鞘细胞促进脊髓损伤轴突再生机制的实验研究

目的探讨体外培养嗅鞘细胞的生物学特性与嗅鞘细胞促脊髓半横断大鼠轴突再生作用的关系。方法用改良的Nash法培养嗅鞘细胞,进行长时间连续观察,将鉴定后的细胞移植于成年大鼠T10脊髓左半侧横断处,在4周时取材,应用p75、NF200和GAP43免疫组化染色等方法判断轴突再生情况。结果体外细胞培养观察发现嗅鞘细胞生长由散在分布逐渐趋向集中,并具有一定的规律性。移植术后4周,p75染色显示移植的嗅鞘细胞仍然存活,主要分布在损伤区周围,且p75阳性嗅鞘细胞呈条索状分布,与GAP43阳性着色神经纤维有共同分布区域。NF200和GAP43阳性神经纤维末端向嗅鞘细胞分布区偏转,而对照组并未见上述现象。结论嗅鞘细胞这种特有的生长方式在体内、外表现一致,与该细胞促进轴突再生的作用相关。