Bcl-2反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的　探讨反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ） 对ｂｃｌ２ 基因的表达调控及诱导胃癌细胞凋亡的作用。方法　应用ＭＴＴ方法比较两条人工合成的ＡＳＯＤＮ 直接作用及其以脂质体（ＤＯＴＡＰ） 为载体对胃癌细胞的抑制效果。应用流式细胞术和ＲＴＰＣＲ 方法检测ＡＳＯＤＮ 对ｂｃｌ２ 蛋白和ｍＲＮＡ 表达量的调控。应用相差显微镜、电子显微镜、流式细胞术等方法,观察ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ 诱导ＢＧＣ８２３ 胃癌细胞凋亡的效果。结果　ＭＴＴ实验显示两条ＡＳＯＤＮ 抑制胃癌细胞增殖的作用呈浓度和时间依赖性,且靶位点于ｍＲＮＡ蛋白编码区（ＡＳＯＤＮ２） 和以ＤＯＴＡＰ 为载体的ＡＳＯＤＮ 对胃癌细胞的增殖抑制效果为佳。ＡＳＯＤＮ作用于胃癌细胞,降低ｂｃｌ２ 蛋白和ｍＲＮＡ 表达。ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ处理胃癌细胞,观察到肿瘤细胞缩小、凋亡小体出现、染色质浓缩、凋亡峰等凋亡特征性改变。结论　ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ可降低ｂｃｌ２ ｍＲＮＡ和蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡     

脂质体介导c-myc反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的研究c-myc反义寡核苷酸(ASODN)经脂质体LipfectAMINETM(LR)介导转染对MCF-7细胞中c-myc蛋白表达及细胞增殖、凋亡的影响。方法用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)评价脂质体介导c-myc ASODN对细胞增殖的影响;免疫细胞化学ABC方法检测转染前后c-myc蛋白表达;流式细胞仪(FCM)定量分析细胞凋亡。结果ASODN/LR转染与正义、错义寡核苷酸相比,显著抑制MCF-7细胞增殖(P<0.01)。FCM分析结果显示,转染后可见明显细胞凋亡峰,72h相点细胞凋亡率达(28.76±2.09)%。免疫细胞化学显示c-myc蛋白水平明显降低,阳性表达率为(21.40±1.16)%。结论LR介导c-myc ASODN能明显抑制MCF-7细胞增殖、诱导细胞凋亡和下调c-myc蛋白水平。     

c—myc反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的研究

c-myc属细胞原癌基因编码的一种核蛋白,刺激细胞增生并与突变型p53一起在肝癌的发生中起协同作用.     

bcl-2硫代反义寡核苷酸提高胃癌细胞凋亡的敏感性

OBJECTIVE: To study the effect of bcl-2 anti-sense oligonucleotide on the sensitivity of gastric cancer cells to Fas-mediated apoptosis. METHODS: Gastric cancer cell line MKN45 was transfected with bcl-2 anti-sense oligonucleotide, and expression of bcl-2 was examined by Western blotting. Agonistic Fas antibody was used to induce apoptosis detected by TUNEL staining and flow cytometry. RESULTS: Bcl-2 expression in MKN45 cells transfected with bcl-2 anti-sense oligonucleotide was markedly inhibited. When cultured with antibody apoptosis index of the anti-sense oligonucleotide-treated MKN45 cells was 55.6% +/- 4.7% (n = 5), which was significantly higher than that of the control (8.4% +/- 2.1%, n = 5). CONCLUSION: Expression of bcl-2 in gastric cancer cells may antagonize Fas-mediated apoptosis.     

C-myc反义寡核苷酸对结肠癌细胞SW480增殖及凋亡的影响

目的：观察脂质体介导的c—myc正反义寡核苷酸对结肠癌细胞SW480增殖和凋亡的影响。方法：通过脂质体将c—myc反义寡核苷酸转入人结肠癌细胞SW480，western blot动态监测c—myc蛋白的表达情况，MTT法、流式细胞仪测定c—myc正反义寡核苷酸对SW480细胞增殖和凋亡的影响。结果：c—myc反义核苷酸对SW480细胞有明显的促进凋亡和抑制增殖的作用，而正义寡核苷酸没有这样的作用。结论：c—myc反义核苷酸具有明显的抗肿瘤作用，可以抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡，可能成为治疗肿瘤的药物。     

survivin反义脱氧寡核苷酸对胃癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨survivin反义脱氧寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞株BGC-823凋亡、增殖的作用及分子机制.方法 分别以survivin ASODN-1、survivin ASODN-2和survivin ASODN-3转染人胃癌BGC-823细胞株,采用共聚焦显微镜检测转染率,四甲基偶氮唑蓝(MTF)法检测细胞生长活性,流式细胞术检测细胞凋亡指数、增殖指数和细胞周期分布及survivin、血管内皮生长因子(VEGF)、Smac/DIABLO蛋白表达改变,逆转录聚合酶链反应检测survivin、VEGF、Smac/DIABLO mRNA表达改变.结果 转染各序列survivin ASODN均可下调survivin蛋白的表达,且以ASODN-2作用最为显著.以600 nmol/L survivin ASODN-2转染BGC-823细胞48 h后,G0/G1期细胞比例[(72.25±2.95)%]明显高于空脂质体对照组[(56.25±0.75)%,均P＜0.05],凋亡指数[(11.31±0.38)%]明显高于空脂质体对照组[(1.62±0.36)%,均P＜0.05],增殖指数[(27.77±2.97)%]低于空脂质体对照组[(43.80±0.80)%,均P＜0.05].转染后survivin mRNA及蛋白表达(0.523±0.091,0.733±0.009)低于空脂质体对照组(0.861±0.047,0.997±0.233;均P＜0.05),VEGF mRNA及蛋白表达(0.519±0.076,0.75±0.006)低于空脂质体对照组(0.779±0.059,1.000±0.01;均P＜0.05),Smac/DIABLOmRNA及蛋白表达(0.899±0.113,1.637±0.023)高于空脂质体对照组(0.558±0.041,1.000±0.049;均P＜0.05).结论 survivin ASODN具有诱导胃癌细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用,其作用是通过下调survivin和VEGF、上调Smac/DIABLO基因表达实现的.

Abstract：

Objective To explore the effects of antisense oligodeoxynucleotides (ASODN)on proliferation and apoptosis in gastric cancer cell line BGC-823 cells and the molecular mechanisms induced by ASODN.Methods survivin ASODN-1, survivin ASODN-2 and survivin ASODN-3 were transfected into BGC-823 cells by LipofectamineTM 2000 transfection reagent.The growth activity of BGC-823 cells was detected by MTT assay.Apoptosis index (AI), proliferation index ( PI), cell cycle and expressions of survivin, VEGF and Smac/DIABLO proteins were detected by flow cytometry (FCM).The changes of survivin mRNA, VEGF mRNA and Smac/DIABLO mRNA were detected by RT-PCR.Results The expression of survivin was down-regulated by the three ASODN sequences, especially the ASODN-2 was best.At 48 hours after transfection with 600 nmol/L survivin ASODN-2, the cells in G1/G0 phase were significantly increased [(72.25 ± 2.95 ) %], apoptotic index increased [( 11.31 ± 0.38 ) %], proliferation index decreased [(27.77 ± 2.97 ) %], compared with those in the control group [( 56.25 ± 0.75 ) %,(1.62 ±0.36)%, (43.80 ±0.80)%, all P ＜ 0.05].The survivin mRNA and protein levels (0.523 ±0.091,0.733 ±0.009) were down-regulated compared with those in the control group (0.861 ±0.047,0.997 ± 0.233 ), VEGF (0.519 ± 0.076, 0.75 ± 0.006) were down-regulated compared with those in the control group (0.779 ± 0.059, 1.000 ± 0.01 ), while those of Smac/DIABLO (0.899 ± 0.113, 1.637 ±0.023) were up-regulated compared with those in the control group (0.558 ± 0.041, 1.000 ± 0.049, all P＜0.05).Conclusions Survivin ASODN can induce apoptosis and inhibit the proliferation of gastric cancer cell line BGC-823 cells.Those effects are induced through up-regulation of Smac/DIABLO and downregulation of survivin and VEGF expression simultaneously.     

反义c-myc寡核苷酸对hTERT蛋白表达抑制作用的研究

目的 探讨脂质体LipfectAMINE^TM（LR）介导的反义c—myc寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌MCF-7细胞hTERT蛋白表达的抑制作用。方法 应用免疫细胞化学ABC法检测转染反义、正义及未转染细胞巾hTERT蛋白的表达情况。结果 免疫细胞化学显示转染反义、正义与未转染细胞的hTERT蛋白表达分别为23％、96％、99％（P〈0．01）,表明转染反义c—myc的MCF-7细胞hTERT蛋白表达明显降低。结论 反义c—myc寡核苷酸可以抑制hTERT蛋白的表达。     

Survivin反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株凋亡和侵袭、迁移的影响

目的:观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3凋亡和侵袭、迁移的影响,探讨其作用的分子机制和临床价值。方法:用脂质体LipofectamineTM2000介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力的改变,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数及survivin、Smac、VEGF蛋白表达改变,逆转录酶链反应(RT-PCR)检测survivin、Smac/DIABLO、VEGF基因表达改变。结果:脂质体LipofectamineTM2000介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,FCM及共聚焦显微镜(SLM510)检测结果显示转染率>95%。用600 nmol/L ASODN转染48 h后,细胞迁移和侵袭能力下降(t=3.47,P<0.05;t=5.72,P<0.01)。细胞凋亡指数(AI)明显增加(t=6.37,P<0.05)。Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.50,P<0.05;t=7.81,P<0.01),Smac mRNA和蛋白表达上调(t=-2.80,P<0.05;t=11.39,P<0.01),VEGF mRNA和蛋白表达明显下调(t=2.54,P<0.05;t=33.84,P<0.01)。结论:ASODN可诱导卵巢癌细胞凋亡,降低卵巢癌细胞侵袭和迁移能力。这些作用是通过下调survivin、VEGF基因,上调Smac基因表达来共同完成的,他们之间的相互作用可能是卵巢癌发生、发展和转移的重要分子机制,survivin可能在其中起关键性作用。针对survivin的基因治疗将成为卵巢癌治疗的重要手段,有重要的临床价值。     

Study on apoptosis-inducing effect of XIAP antisense oligonucleotides on glioblastoma cells in vitro

OBJECTIVE To investigate the apoptosis-inducing effect of XIAP antisense oligonucleotides on glioblastoma cells in vitro.
METHODS There were 4 groups in our experiment. Group A, as a cell control group, had normal cell culture and no treatment applied. Group B, as a blank control group, had normal cell culture and no liposome control of ASODN. Group C was N-ODN. Group D was the ASODN group. RT-PCR and Western blot assay were conducted to detect the expression of XIAP in all A-172 ceil groups after treatment with XIAP antisense oligonucleotides （ASODN）. MTT assay and flow-cytometry （FCM） detection were used to detect the ability of cell anchoring growth and apoptotic rates of all groups. The processing time was 72 h.
RESULTS The expression of XIAP in the A-172 cells was greatly down-regulated, after treated with XIAP-ASODN. Among different concentrations of ASODN, the 300nM was the most optimal one. The down-regulation of XIAP obviously inhibited the succinate dehydrogenase （SDH） activity of the A-172 cells and the increased apoptotic rate of A-172 cells （87.45%） was significantly higher than that of the A-172 in the control groups. There was a statistically significant difference between the treatment and control groups （P 〈 0.01）.
CONCLUSION The XIAP-ASODN can effectively regulate the expression of the XIAP down, as a result, inhibit the growth of the glioblastoma cells （A-172） and obviously increase the apoptotic rate of the A-172 cells. The results killing role of XIAP-ASODN to the of the study manifest an overt glioblastoma cells.     

Cyclin D1反义寡核苷酸对SGC7901胃癌细胞生长和化疗敏感性的影响

目的 研究Cyclin D1反义寡核苷酸对胃癌细胞SGC7901生长和化疗敏感性的影响，并探讨其内在机制。方法 采用脂质体lipoiect AMINE2000包裹硫代修饰的Cyclin D1 ASODN转染细胞，观察对SGC7901细胞的量效曲线及其生长曲线。0．2μmol／L Cyclin D1 ASODN转染细胞24小时后，给予梯度浓度的5—氟尿嘧啶(5—FU)、氨甲喋呤(MTX)、顺铂(DDP)，观察量效反应，计算IC50。应用RT—PCR检测细胞转染后24小时和48小时时Cyclin D1、胸苷酸合成酶(TS)、胸腺嘧啶磷酸化酶(TP)、二氢叶酸还原酶(DHFR) mRNA表达情况。结果 Cyclin D1 ASODN对SGC7901细胞产生剂量依赖性的抑制效应，0．2μmol／L Cyclin D1 ASODN转染24小时能显著抑制胃癌细胞生长，降低Cyclin D1 mRNA表达。Cyclin D1 ASODN增加了胃癌细胞对5—FU，MTX，DDP的敏感性，ASODN 化疗组对各化疗药物的IC50均有显著下降。RT—PCR显示Cyclin D1 ASODN转染后24小时时TS、DHFR mRNA表达较对照组下降，而TPmRNA表达较对照组升高，48小时时TS、TP、DHFR mRNA表达的改变更加明显。结论 Cyclin D1 ASODN能降低Cyclin D1 mRNA表达，抑制胃癌细胞SGC7901的生长，并通过改变5—FU，MTX代谢相关酶的表达提高细胞对它们的敏感性。     

VEGF反义寡核苷酸对Lewis肺癌细胞的抑制作用

目的:〖HT5"SS〗 探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）反义寡核苷酸对C57BL/6小鼠肺癌细胞的抑制作用。〖HT5W〗方法:〖HT5"SS〗 制作C57BL/6小鼠皮下肺癌模型40只,分为VEGF反义寡核苷酸（ASODN）治疗组、VEGF正义寡核苷酸(SODN)治疗组、VEGF错义寡核苷酸（MODN）治疗组及对照组。接种Lewis肺癌细胞后24 h内,用ASODN、SODN及MODN皮下注射进行治疗,对照组只注射生理盐水,观察小鼠肿瘤的生长情况以及组织形态学改变,标本常规石蜡切片,HE染色,用免疫组化方法检测VEGF蛋白表达。〖HT5W〗结果:〖HT5"SS〗 对照组、ASODN组、SODN组、MODN组平均瘤重分别为（7.33±0.71）g、（4.56±0.38）g、(7.59±0.32)g和（7.62±0.39）g,ASODN组、SODN组、MODN组抑瘤率分别为43.8%、5.5%、3.1%。光镜下观察, VEGFASODN 能明显抑制肿瘤细胞生长,降低增殖活性。 免疫组化结果表明,ASODN组VEGF的表达水平明显低于SODN组、MODN组及对照组（P<0.05）。CD34免疫组化结果表明,ASODN组MVD为8.25±2.12,与对照组(14.78±3.51)、SODN组(13.71±3.62)及MODN组(12.81±2.56)比较,ASODN组MVD明显减少（P<0.01）。〖HT5W〗结论: 〖HT5"SS〗原位注射VEGF反义寡核苷酸能抑制小鼠肺癌生长。     

重组反义c-myc腺病毒对HL-60细胞PCNA表达及其生长影响的研究

目的:研究重组反义c-myc腺病毒(Ad-AS-c-myc)对人急性早幼粒HL-60细胞系的c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)表达及细胞生长抑制。方法:采用重组腺病毒Lac-Z(Ad-LacZ)及Ad-AS-c-myc联合多聚阳离子转染HL-60细胞,X-gal染色判断转染效率。采用MTT、RT-PCR及免疫细胞化学等方法进行研究。结果:多聚阳离子可提高腺病毒对HL-60细胞的转染,Ad-LacZ加入鱼精蛋白硫酸盐转染率达79.8%。Ad-AS-c-myc能抑制HL-60细胞c-myc基因在转录及蛋白水平的表达。Ad-AS-c-myc抑制HL-60细胞生长及活力(抑制率51%),细胞生长停滞后PCNA蛋白表达降低。结论:Ad-AS-c-myc对HL-60细胞具有使生长减缓、增殖能力降低作用,其生物学作用与HL-60细胞c-myc和PCNA的表达受抑有关。Ad-AS-c-myc在急性早幼粒白血病基因治疗中具有潜在的临床价值,其生物学活性与HL-60细胞c-myc和PCNA表达受抑有关。     

丹参酮ⅡA对MKN-45细胞生长的影响

目的:研究丹参酮ⅡA(Tanshi-noneⅡA,TanⅡA)对人胃癌细胞株MKN-45的生长抑制作用。方法:选用人胃癌细胞株MKN-45,运用MTT法、流式细胞术(FCM)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)半定量法检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和各组p53mRNA表达。结果:TanⅡA可明显抑制MKN-45细胞的增殖,其抑制作用具有时间-效应和剂量-效应关系。当2·0μg/mL TanⅡA处理MKN-45细胞96h,增殖抑制率达(74·84±0·41)%。FCM检测肿瘤细胞DNA变化,观察到TanⅡA使MKN-45细胞周期阻滞于G2/M期,出现浓度依赖性的亚“G1”峰,同时野生型p53表达增加。结论:TanⅡA能有效地抑制人胃癌细胞株MKN-45的增殖,其可能的机制与凋亡有关。肿瘤防治杂志,2005,12(19):1465-1468     

凋亡抑制因子反义核酸对肝癌细胞生物学作用研究

目的探讨survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞凋亡、增殖的影响。方法设计合成特异性sur-vivin的反义寡核苷酸(ASODN)。以高表达survivin基因的人肝癌细胞系(SMMC-7721)为靶细胞、反义sur vivin(AS-ODN)为阻断剂,倒置显微镜观察细胞形态变化,WesternBlot法检测细胞survivin表达情况,MTT试验观察AS-ODN对该细胞系的生长抑制作用,流式细胞仪分析细胞增殖周期。结果AS-ODN明显抑制了SMMC-7721肝癌细胞的生长,细胞分裂阻滞在分裂期的中期,并诱导细胞发生凋亡,而各对照组细胞生长良好,细胞增殖指数明显低于各对照组(P<0.05)。结论survivingASODN能下调其蛋白表达,诱导人肝癌细胞凋亡,抑制细胞增殖。     

端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对甲状腺癌细胞增殖的影响

目的研究甲状腺癌(TC)细胞中端粒酶逆转录酶(TERT)表达及其反义寡核苷酸(antisense oligo-nuc leotides,ASODN)对其表达和细胞增生的抑制作用,为甲状腺癌治疗探索基因治疗新途径。方法体外培养TC细胞,不同浓度的TERT ASODN和正义寡核苷酸(SODN)分别作用于体外培养的TC细胞,采用RT-PCR方法检测TERT mRNA的表达,四唑盐比色法(MTT)检测在不同浓度的TERT ASODN和SODN作用下TC细胞生长活性及其生长抑制率。结果体外培养TC细胞可表达TERT mRNA,在5、10μmol/L ASODN作用下,TERT mRNA的表达明显受抑制;TERT ASODN能明显抑制TC细胞增生活性,并呈剂量依赖性。结论TC细胞可表达TERT mRNA,一定浓度TERT ASODN能序列特异性地抑制TC细胞TERT mRNA表达和增生活性,有望进一步用于TC的治疗实验研究。