构建人牙囊细胞三维立体培养模型及其用于牙周组织工程的可行性

目的:构建人牙囊细胞的体外三维立体培养模型,探讨两种支架材料用于牙周组织工程的可行性。方法:实验于2003-01/2004-10在第四军医大学口腔医学院组织工程实验中心完成。采用酶消化法原代培养人牙囊细胞,传代扩增后,取第4代细胞分别接种于煅烧骨和Ⅰ型胶原膜三维支架上,体外继续培养1周,进行细胞记数和扫描电镜观察细胞生长状况。结果:细胞在两种材料上均能良好贴附并增殖,扫描电镜可见人牙囊细胞在这两种支架材料上均黏附良好,增殖旺盛,伸展充分,并有基质分泌。结论:煅烧骨和冻干胶原膜均有望成为牙周组织工程支架材料。     

异体脱矿松质骨基质和纳米羟基磷灰石材料应用于牙周组织工程中的可行性探讨

目的 进行人牙周膜细胞（PDLCs)三维立体培养的体外实验研究，初步探讨两种支架材料应用于牙周组织工程的可行性，为进一步研究牙周组织生理病理及牙周组织工程奠定实验基础。方法 组织块法培养人PDLCs，传代扩增后，接种于脱矿松质骨基质（CBM）和纳米羟基磷灰石材料（nHAC)两种三维支架上，体外继续培养3d，进行细胞计数和扫描电镜观察。结果 人PDLCs在两种支架材料上均能形成良好贴附并增殖，扫描电镜可见两种支架材料均具有良好的多孔网状结构，细胞在支架材料上生长旺盛，伸展充分。结论 CBM和nHAC均有望成为牙周组织工程的支架材料。     

异体脱矿松质骨基质和纳米羟基磷灰石材料应用于牙周组织工程中的可行性探讨

目的进行人牙周膜细胞(PDLCs)三维立体培养的体外实验研究,初步探讨两种支架材料应用于牙周组织工程的可行性,为进一步研究牙周组织生理病理及牙周组织工程奠定实验基础。方法组织块法培养人PDLCs,传代扩增后,接种于脱矿松质骨基质(CBM)和纳米羟基磷灰石材料(nHAC)两种三维支架上,体外继续培养3d,进行细胞计数和扫描电镜观察。结果人PDLCs在两种支架材料上均能形成良好贴附并增殖,扫描电镜可见两种支架材料均具有良好的多孔网状结构,细胞在支架材料上生长旺盛,伸展充分。结论CBM和nHAC均有望成为牙周组织工程的支架材料。     

松质骨基质材料应用于牙周组织工程的可行性

背景：松质骨基质材料具有骨诱导性和骨传导性双重特性,已被成功应用于骨再生及骨组织工程研究。目的：分析松质骨基质材料的细胞相容性与毒性,探讨其应用于牙周组织工程的可行性。方法：采用改良组织块法体外培养人牙周膜细胞,将其接种于松质骨基质三维支架上复合培养,采用细胞计数方法和扫描电镜观察人牙周膜细胞在松质骨基质支架上的附着、生长情况,并通过MTT测试法和碱性磷酸酶活性检测法观察松质骨基质浸提液对人牙周膜细胞增殖及功能表达的影响。结果与结论：扫描电镜可见松质骨基质具有良好的多孔网状结构,人牙周膜细胞在松质骨基质上贴附紧密,生长旺盛,伸展充分,而人牙周膜细胞在不同浓度材料浸提液中的生长、增殖及碱性磷酸酶活性与阴性对照组相比差异无显著性意义。表明松质骨基质具有良好的三维空间结构和细胞相容性,且无细胞毒性,有望应用于牙周组织再生及牙周组织工程研究。     

软骨细胞复合胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的体外培养

背景：关节软骨缺损的修复涉及到软骨和软骨下骨的双重修复,需要将骨与软骨组织工程结合起来,构建骨软骨双层支架,或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨。目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响,评价其作为关节软骨工程支架的可行性。时间及地点：体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在广东省构建与检测实验室进行。材料：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架,上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主,孔隙率≥90%,孔径100μm。方法：体外培养新西兰大白兔软骨细胞并成骨诱导3周,使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养3周。主要观察指标：通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果：修复体/细胞体外培养3周,修复体上细胞数量明显增多,并分泌细胞基质,包裹在软骨细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料。     

新型壳聚糖－胶原支架与牙周膜细胞的生物相容性

背景：目前胶原作为牙周组织工程支架材料仍具有机械强度差、降解速度快等缺点,将其与壳聚糖复合可改善上述问题。 目的：评估新型壳聚糖-胶原支架材料的体外生物相容性。 方法：通过 MTT 法评估100%,75%,50%,25%壳聚糖-胶原支架材料浸提液对人牙周膜细胞的毒性。选择第4-6代生长状态良好的人牙周膜细胞与壳聚糖-胶原支架共培养,观察细胞在支架上的生长情况,并检测与壳聚糖-胶原支架复合培养前后人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的变化。 结果与结论：新型壳聚糖-胶原支架具有双层结构,一侧表面致密,一侧表面疏松多孔。MTT 法检测不同浓度材料浸提液毒性评级为0或1级。扫描电子显微镜及组织学观察可见细胞在壳聚糖-胶原支架上增殖良好,且致密层可起屏障膜作用,阻挡细胞进入支架内部;复合培养24 h后,人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性与复合培养前无明显差异（P 〉0.05）,复合培养48,72 h后人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性高于复合培养前（P 〈0.05）。以上结果提示新型壳聚糖-胶原支架具有良好的生物相容性及屏障功能,可进一步应用于牙周组织工程的研究。     

骨髓基质细胞三维立体培养的体外实验研究和应用于牙周组织工程的意义

目的：探讨磷酸三钙(TCP)、珊瑚羟磷灰石(CHA)两种生物材料作为牙周组织工程支架材料的可行性，为用组织工程方法修复牙周组织缺损提供依据。方法：将骨髓基质细胞分别接种到TCP，CHA两种支架材料上，体外培养后进行细胞增殖、矿化能力测定和扫描电镜观察。结果：骨髓基质细胞能在TCP，CHA上贴附、生长，其增殖、功能不受影响，矿化能力亦无明显变化。结论：TCP，CHA均可作为骨髓基质细胞的载体应用于牙周组织工程研究。     

软骨细胞复合胶原/壳聚槲/β-磷酸三钙层状梯度修复体的体外培养

背景:关节软骨缺损的修复涉及到软骨和软骨下骨的双重修复,需要将骨与软骨组织工程结合起来,构建骨软骨双层支架,或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨.目的:观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响,评价其作为关节软骨工程支架的可行性.时间及地点:体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在广东省构建与榆测实验室进行.材料:以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架,上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主,孔隙率≥90%,孔径100 μm.方法:体外培养新西兰大白兔软骨细胞并成骨诱导3周,使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养3周.主要观察指标:通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响.结果:修复体/细胞体外培养3周,修复体上细胞数量明显增多,并分泌细胞基质,包裹在软骨细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.结论:胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料.     

人牙源性间充质细胞与陶瓷化骨支架材料相容性的实验研究

目的：观察人牙源性间充质细胞在陶瓷化骨表面的贴附、生长和增殖情况，探讨陶瓷化骨作为支架材料应用于构建组织工程牙本质的可行性。方法：组织块法原代培养人牙源性间充质细胞并传代扩增，将经过诱导的牙源性间充质细胞接种于陶瓷化骨三维支架上，通过细胞计数和扫描电镜观察细胞在陶瓷化骨表面的生长和增殖情况。结果：人牙源性间充质细胞在陶瓷化骨表面贴附良好，有较强的增殖能力，扫描电镜见细胞在支架上伸展充分，生长旺盛，细胞表面可见多数分泌颗粒。结论：陶瓷化骨具有良好的生物相容性，可望作为人牙源性间充质细胞的载体用于构建组织工程牙本质的研究。     

纳米材料复合人骨髓成骨细胞培养的研究

目的　探讨纳米材料作为组织工程骨基质材料的可行性。方法　分离培养人骨髓间充质干细胞 ,诱导为成骨细胞后作为种子细胞 ,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料体外联合培养 ,通过对复合物光镜及扫描电镜观察 ,了解细胞在材料中生长情况。结果　人骨髓间充质干细胞可以诱导为成骨细胞 ,体外复合培养 2周 ,分布于支架材料上的细胞大量分化增殖。结论　纳米晶羟基磷灰石胶原材料是一种构建组织工程骨的较好的支架材料     

纳米晶羟基磷灰石/胶原骨与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石，胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨的细胞相容性。设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-09／2006—12在江苏大学医学技术学院完成。材料；纳米晶羟基磷灰石，胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献，受试者对实验内容知情同意。方法：全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞，应用成骨诱导剂（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子）诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨复合培养14d。主要观察指标：通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨上的生长情况。结果：原代培养的骨髓细胞增殖迅速，10～12d左右即可稳定传代，传代细胞7-9d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性，Von Kossa染色阳性，可见钙化的基质沉积，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石／胶原骨共培养模型中，细胞可在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨表面良好贴壁。复合培养8d，分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14d，大量细胞在材料表面和孔隙中生长，细胞之间广泛存在突起连接。结论：纳米晶羟基磷灰石肢原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖，细胞相容性良好。     

四环素对胶原生物衍生骨材料细胞相容性的影响

目的：观察四环素-胶原生物衍生骨材料与兔成骨细胞的相容性及体外附着规律。方法：实验于2003-02/2005-03在华西医科大学组织工程实验室完成。①实验方法：取新鲜人捐献骨经脱脂、脱蛋白等理化过程,制成单纯生物衍生骨材料为载体,载体表面经I型胶原修饰得到胶原生物衍生骨材料,将四环素吸附于胶原生物衍生骨复合材料,构建出四环素-胶原生物衍生骨材料。体外培养兔骨膜成骨细胞,与胶原生物衍生骨材料、四环素-胶原生物衍生骨材料共培养。②实验评估：分别于1,3,5,7d取材,扫描电镜下观察细胞在材料表面的生长情况,测定两组材料的碱性磷酸酶活性,MTT检测细胞生长和增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期情况。 结果：①扫描电镜观察、碱性磷酸酶活性检测及MTT检测结果表明,成骨细胞在四环素-胶原生物衍生骨材料表面和孔隙内黏附和增殖良好,在胶原生物衍生骨材料较差。②流式细胞仪检测表明,四环素-胶原生物衍生骨材料无细胞毒性。 结论：以胶原生物衍生骨材料作为载体,进一步吸附四环素后构建的复合材料与成骨细胞有良好的细胞相容性。     

骨髓基质成骨细胞与锻烧骨联合培养的实验研究

目的：探索锻炼骨（calcined bone calcium,CBC)作骨组织工程支架材料的可行性。方法：将CBC分纤维粘连蛋白修饰组和单纯培养液修饰组，分别与骨髓基质成骨细胞（marrow stromal osteoblast,MSO)于体外联合培养，进行扫描电镜观察和碱性磷酸酶活性检测，了解细胞在 材料中的粘附、生长、增殖、分泌及材料与细胞的相互作用情况。结果：经系统处理过的CBC具有类似原骨的三维结构。体外培养12h细胞已贴附于CBC支架，复合培养7d，分布在支架上的细胞迅速分化增殖，分泌细胞外基质和矿化结节。碱性磷酸酶测定7d组的活性显著高于12h组活性（P＜0．01）。两组之间扫描电镜观察和碱性磷酸酶测定均未见明显差异（P＞0．05）。结论：CBC生物相容性好，不需作修饰即能促进成骨细胞的粘附、增殖、分泌活动，是骨组织工程的理想支架材料。     

应用组织工程方法体外培养人牙囊细胞与I型胶原的合成

目的：研究体外培养人牙囊细胞，探讨其生物学特性及其在牙齿萌出中的作用。方法：取年龄为12岁人埋藏阻生第三磨牙的牙囊，组织块法进行人牙囊细胞的培养，HE染色、扫描电镜观察人牙囊细胞的形态，免疫组织化学染色技术观察I型胶原及波形蛋白在牙囊细胞中的表达及定位。结果：培养的人牙囊细胞呈梭形，卵圆形及多角形，形似成纤维细胞；扫描电镜可见细胞多呈梭形，也可见多角形，所有细胞表面均有颗粒状物质，有的细胞表面多且密，有的细胞表面较少，折光性较强，细胞核周围分布较多；在牙囊细胞中I型胶原和波形蛋白的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中，围绕细胞核周围染色较强，细胞核内染色阴性。结论：体外可以培养人牙囊细胞，人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性，具有合成I型胶原的能力。     

骨髓基质成骨细胞与煅烧骨联合培养的实验研究

目的:探索煅烧骨(calcined bone calcium,CBC)作骨组织工程支架材料的可行性。方法:将CBC分纤维粘连蛋白修饰组和单纯培养液修饰组,分别与骨髓基质成骨细胞(marrow stromal osteoblast,MSO)于体外联合培养,进行扫描电镜观察和碱性磷酸酶活性检测,了解细胞在材料中的粘附、生长、增殖、分泌及材料与细胞的相互作用情况。结果:经系统处理过的CBC具有类似原骨的三维结构。体外培养12h细胞已贴附于CBC支架,复合培养7d,分布在支架上的细胞迅速分化增殖,分泌细胞外基质和矿化结节。碱性磷酸酶测定7d组的活性显著高于12h组活性(P<0.01)。两组之间扫描电镜观察和碱性磷酸酶测定均未见明显差异(P>0.05)。结论:CBC生物相容性好,不需作修饰即能促进成骨细胞的粘附、增殖、分泌活动,是骨组织工程的理想支架材料。     

人骨形成蛋白2基因成骨诱导作用研究

目的：制备一种具有成骨活性的生物材料。方法：将人BMP2-pcDNA3．1质粒添加到壳聚糖-胶原海绵支架材料中，然后将大鼠成骨细胞和成纤维细胞分别接种在该复合材料中，体外培养细胞-支架材料复合物．另外将该材料植入BALBc小鼠皮下，以添加了pcDNA3．1质粒的壳聚糖-胶原海绵支架材料为对照。10天以后．取出细胞-支架材料复合物和皮下植入物，分别检测样品的碱性磷酸酶活性和钙含量。结果：与对照相比，体外培养细胞-支架材料复合物中的碱性磷酸酶活性和钙含量均显著提高；小鼠皮下植入物的碱性磷酸酶活性和钙含量也分别提高了61．5％和16．2％。结论：添加了人骨形成蛋白2基因的壳聚糖-胶原海绵支架材料具有成骨诱导活性，这种材料为骨组织工程中的成骨诱导可能提供一种新的方法。     

骨髓基质细胞三维立体培养的体外实验研究和应用于牙周组织工程的意义

目的:探讨磷酸三钙(TCP)、珊瑚羟磷灰石(CHA)两种生物材料作为牙周组织工程支架材料的可行性,为用组织工程方法修复牙周组织缺损提供依据。方法:将骨髓基质细胞分别接种到TCP,CHA两种支架材料上,体外培养后进行细胞增殖、矿化能力测定和扫描电镜观察。结果:骨髓基质细胞能在TCP,CHA上贴附、生长,其增殖、功能不受影响,矿化能力亦无明显变化。结论:TCP,CHA均可作为骨髓基质细胞的载体应用于牙周组织工程研究。     

纳米晶胶原基骨与人骨髓间充质干细胞的复合培养

目的：观察人骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨的复合培养，证实纳米晶胶原基骨是否可以成为组织工程的良好载体材料。 方法：实验于2003—07／2004—08在清华大学材料科学与工程系完成纳米晶胶原基骨的制备及处理，在中日友好临床医学研究所免疫室完成纳米晶胶原基骨与骨髓间充质干细胞复合培养。健康自愿献髓者3人，在中日友好医院骨坏死与骨循环实验室体检。应用仿生原理制备纳米晶胶原基骨，体外培养骨髓间充质干细胞并与材料复合，通过共聚焦显微镜和环境扫描电镜观察骨髓间充质干细胞与材料的复合情况。 结果：①共聚焦显微镜显示：在各层面扫描骨髓间充质干细胞均深入纳米晶胶原基骨的内部孔隙。②环境扫描电镜显示：第2天细胞贴附在多孔材料上，在纳米晶胶原基骨底部靠近培养板处细胞黏附明显较纳米晶胶原基骨上其他部位多，细胞也开始伸展，伸出伪足向材料微孔中长入，孔隙内见不到桥接的细胞连接细胞在整个材料及孔隙内表面贴附、伸展。第7天时细胞在材料上完全铺展。伪足向材料微孔中长入，在部分直径较小的孔隙中（70～150μm），细胞之间突起相互连接呈桥状。纳米晶胶原基骨临近培养板的一面有较多细胞生长，主要在材料的表面和材料的裂隙中，孔隙中较少。第14天，大量细胞在纳米晶胶原基骨表面和孔隙中生长，尤以孔隙中明显。细胞之间广泛存在突起连接，在孔隙中呈网状互相相连。 结论：纳米晶胶原基骨是良好的组织工程支架材料，易与骨髓间充质干细胞复合．适合种子细胞的贴附、生长、增殖和分化。     

胶原／羟基磷灰石复合支架负载软骨细胞构建组织工程软骨

背景：新型复合软骨组织工程支架克服了传统支架的诸多不足，如组织相容性差、生物力学性能不足、降解过快、材料单一、难与关节软骨的分层结构相匹配等，为软骨组织工程的发展提供新的途径。目的：观察具有柱状分层结构的胶原／羟基磷灰石复合支架对软骨细胞的吸附作用，以及对软骨细胞生物学性状的影响，评价其作为软骨组织工程支架的可行性与价值。设计：开放性实验。单位：中山大学附属第三医院骨科，华南理工大学材料学院。材料：实验于2004-06／11在中山大学附属第三医院动物实验中心完成。选取2周龄普通级健康新西兰白兔1只，雄性，饲养环境温度20℃，湿度40％。方法：①在羟基磷灰石中加入少量的去离子水，分散后加入Ⅰ型胶原溶液搅拌复合，并按一定比例加入碳二亚氨，调配形成不同比例的胶原／羟基磷灰石复合物，并逐层加入模具，最上层采用纯胶原，底层为纯羟基磷灰石。将制备好的柱状分层的胶原／羟基磷灰石复合材料冷冻干燥后，经环氧乙烷气体消毒后备用。②体外培养幼兔关节软骨细胞并扩增，吸附于多孔胶原／羟基磷灰石复合支架上三维立体培养，通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。主要观察指标：①胶原／羟基磷灰石多孔支架的形貌观察。②体外培养的软骨细胞生物学性状观察。③胶原／羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察。结果：①胶原／羟基磷灰石多孔支架的形貌观察：胶原／羟基磷灰石为具有一定力学强度的柱状分层的三维多孔支架，最上层为纯胶原，底层为纯羟基磷灰石，中间为胶原与羟基磷灰石复合。扫描电镜可见支架内具有不规则的通孔结构，孔径较均匀，相互连通，平均孔径约为147μm。②体外培养的软骨细胞生物学性状观察：刚分离的软骨细胞为球形，活细胞率达95％。24h后细胞开始贴壁，逐渐伸展为三角或多角形，内含分泌颗粒。细胞保持单层生长，传代后增殖速度加快，4d铺满培养瓶。随着传代次数的增加，增殖速度开始减慢，当传到第6代时，细胞分裂能力明显下降，细胞变形明显，体积变大，梭形为主，边沿模糊，折光性弱。表现出细胞老化和向成纤维细胞反分化的趋势。③胶原／羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察：多孔胶原／羟基磷灰石复合支架亲水性好，软骨细胞吸附于支架表面，增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部，在孔壁贴附良好，表型维持稳定，分泌胞外基质。结论：柱状分层结构的胶原／羟基磷灰石复合支架具有良好的细胞相容性，较单纯胶原力学性能更强，是比较理想的软骨组织工程支架材料。     

人牙源性间充质细胞与陶瓷化骨支架材料相容性的实验研究

目的:观察人牙源性间充质细胞在陶瓷化骨表面的贴附、生长和增殖情况,探讨陶瓷化骨作为支架材料应用于构建组织工程牙本质的可行性。方法:组织块法原代培养人牙源性间充质细胞并传代扩增,将经过诱导的牙源性间充质细胞接种于陶瓷化骨三维支架上,通过细胞计数和扫描电镜观察细胞在陶瓷化骨表面的生长和增殖情况。结果:人牙源性间充质细胞在陶瓷化骨表面贴附良好,有较强的增殖能力,扫描电镜见细胞在支架上伸展充分,生长旺盛,细胞表面可见多数分泌颗粒。结论:陶瓷化骨具有良好的生物相容性,可望作为人牙源性间充质细胞的载体用于构建组织工程牙本质的研究。