不同刺激因子对脐血干/祖细胞体外增殖影响的比较

背景：目前细胞因子支持的脐血体外扩增是安全性较高、最有可能运用于临床的方法之一。 目的：比较白血病抑制因子、白细胞介素6及脂多糖对脐血干/祖细胞体外增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对照实验,于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成。 材料：10例正常脐血标本取自广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科,白血病抑制因子为达科为试剂公司产品,白细胞介素6为晶美试剂公司产品,脂多糖由广东医学院附属医院李延平教授自制。 方法：密度梯度法体外分离培养脐血单个核细胞,应用磁分选器和单克隆抗体免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞。建立液体培养体系,为含体积分数为40%的胎牛血清、20 g/L牛血清白蛋白、20 μg/L粒巨集落刺激因子、20 μg/L干细胞因子、20 μg/L白细胞介素3的RPMI 1640培养液。取2×108 L-1脐血CD34+细胞,加入配制的液体培养体系50 μL,设立8组：第1组仅加入RPMI 1640作为对照,第2~4组分别单独加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6,第5~7组分别加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6的两两混合液,第8组加入3种刺激因子的混合液,上述各组脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6的终浓度分别为10 U/mL,10 μg/L,10 mg/L。 主要观察指标：MTT法测定不同刺激因子在液体培养体系中对脐血CD34+细胞增殖的影响。 结果：培养3 d后与对照组比较,单用白血病抑制因子对脐血CD34+细胞具有促增殖作用(F=3.33,P < 0.01),单用脂多糖或白细胞介素6的效果均不显著(F=2.14,1.83,P > 0.05);刺激因子两两联用及3种刺激因子联用时,对脐血CD34+细胞均具有促增殖作用(F=3.54~4.06,P均< 0.01),且3种刺激因子联用时的促增殖效果尤为显著。 结论：在特定的液体培养体系中,单独使用白血病抑制因子可明显促进脐血干/祖细胞体外增殖,联合情况下白细胞介素6、脂多糖与白血病抑制因子具有促增殖协同作用。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响**

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。 目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。 方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。②S组：基质细胞+单个核细胞。③SF组：基质细胞+干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞数以及集落形成单位数。 结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133+细胞/有核细胞、CD34+细胞/有核细胞、CD133+CD34+细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

脐带间充质干细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

背景：体外扩增是目前解决脐带血干细胞移植所面临的单份脐血造血干祖细胞数不足问题的主要手段。已有许多关于不同来源的间充质干细胞联合不同细胞因子支持脐血造血干祖细胞体外扩增的报道,而单独应用间充质干细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增的报道仍很少。 目的：观察应用脐带源间充质干细胞作基质层的体外培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-03/2007-05在中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、实验血液学国家重点实验室完成。 材料：经产妇知情同意,采集健康足月分娩胎儿脐带9份。 方法：应用贴壁培养的方法从正常足月出生儿脐带中分离培养间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型、分化实验进行鉴定。利用免疫磁珠分离法从正常足月出生儿脐带血中分离CD34+细胞。应用3种不同培养体系进行脐血CD34+细胞的体外扩增：单独应用脐带源间充质干细胞作基质层、细胞因子培养体系和间充质干细胞联合细胞因子培养体系。 主要观察指标：应用细胞计数法、集落培养计数法和流式细胞学检测法对扩增后细胞数量、集落形成能力和免疫表型进行分析比较。RT-PCR检测间充质干细胞中细胞因子的表达情况。 结果：培养第14天后,间充质干细胞组的CD34+细胞比例明显高于细胞因子联合间充质干细胞组;CD34+细胞总数为培养前的(4.19±1.37)倍,明显高于细胞因子组。培养第7天和第14天,间充质干细胞组的CD34+CD38-细胞亚群比例均高于另两组。RT-PCR结果显示,脐带源间充质干细胞体外可表达干细胞因子和血小板生成素早期干细胞效应因子。 结论：单独应用脐带源间充质干细胞可有效地对脐血CD34+细胞进行体外扩增,更有利于保持较早期干、祖细胞的扩增。 关键词：间充质干细胞;脐带;脐血;CD34+细胞;体外扩增     

骨髓基质细胞对多细胞因子介导人脐血单个核细胞体外扩增的影响*

背景：体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,细胞因子介导的脐血造血细胞能使细胞数有效扩增,但同时也耗竭了具有分化潜能的造血干细胞。 目的：观察骨髓基质细胞对多细胞因子组合介导人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后黏附分子和CXCR4表达的影响。 方法：将分离的人脐血单个核细胞接种在预先建立的人骨髓基质细胞层上,分组培养：对照组仅含有脐血单个核细胞;多种细胞因子+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+多种细胞因子+脐血单个核细胞组。培养0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。 结果与结论：单纯骨髓基质细胞和单用细胞因子组均可有效地扩增脐血造血细胞,并提高造血细胞上CD49d,CD62L及 CXCR4表达。而单用细胞因子组促进脐血造血细胞扩增能力较单纯骨髓基质细胞强,提高造血细胞CD49d,CD62L及 CXCR4表达能力较单纯骨髓基质细胞差。提示骨髓基质细胞虽可支持脐血造血细胞扩增,但难以实现造血细胞的大量扩增,但在骨髓基质细胞层的支持下,多细胞因子可有效地促进脐血造血细胞的扩增,并优于单用细胞因子及骨髓基质细胞,证实骨髓基质细胞可协同多细胞因子有效地促进脐血单个核细胞的扩增,促进造血干细胞的黏附和趋化能力。     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景：细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题。 目的：实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响。 方法：将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠。在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞。 结果与结论：移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组 (P < 0.05)。扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达。结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能。     

体外诱导人外周血单个核细胞向肝样细胞的分化

背景：外周血具有收集方便、供者不需麻醉、无骨髓穿刺痛苦等优点,利用人外周血干细胞移植的方法来获得转分化后的肝样细胞临床应用前景较好。 目的：探讨人外周血单个核细胞在肝细胞生长因子及成纤维细胞生长因子4诱导下分化为肝样细胞的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-05/10在中国科学院大连化物所1806组细胞培养室和大连医科大学附属第一医院中心实验室完成。 材料：外周血由大连市红十字血液中心11名健康志愿献血者提供。肝细胞生长因子、巨噬细胞集落刺激因子、成纤维细胞生长因子4为Peprotech公司产品。 方法：采集志愿者外周血,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,加入RPMI1640液培养2 h后,去除未贴壁细胞。将贴壁细胞分为4组：对照1组加入含140 μmol/L β-巯基乙醇、体积分数为0.1胎牛血清的RPMI1640液培养6 d;对照2组、肝细胞生长因子组、成纤维细胞生长因子组均在其基础上向RPMI1640液中加入5 μg/L巨噬细胞集落刺激因子、0.4 μg/L白细胞介素3。洗涤后,对照组换用含胎牛血清的RPMI1640培养液继续培养20 d,肝细胞生长因子组在其基础上加入20 μg/L肝细胞生长因子,成纤维细胞生长因子组加入10 μg/L成纤维细胞生长因子4。 主要观察指标：诱导分化过程中细胞形态学变化,免疫荧光检测诱导后甲胎蛋白及白蛋白的表达。 结果：刚分离的单个核细胞形态呈较均一的圆形,活细胞率>95%,培养2 h后贴壁细胞呈毛糙的圆形,6 d后肝细胞生长因子组、成纤维细胞生长因子组细胞呈集落样生长,细胞趋向融合,对照组细胞未形成集落,呈单个细胞生长。经诱导培养后,4 d时部分细胞体积变大,向类圆形细胞转变,随培养时间延长,类圆形细胞比例增加,至20 d后细胞数量逐渐减少;对照组培养20 d后多数细胞呈梭形或纤维样,少部分细胞呈圆形。诱导培养后第6,10,14,20天,肝细胞生长因子组、成纤维细胞生长因子组甲胎蛋白、白蛋白均呈阳性表达,对照组各时间点均呈阴性表达。 结论：在肝细胞生长因子及成纤维细胞生长因子4诱导条件下,人外周血单个核细胞具有向肝样细胞分化的潜能。 关键词：外周血单个核细胞;肝细胞生长因子;成纤维细胞生长因子;肝细胞;分化     

脐血贴壁层细胞和骨髓基质细胞对脐血单个核细胞增殖能力的影响★

目的：比较脐血贴壁层细胞和骨髓的基质细胞对脐血单个核细胞增殖能力的影响。 方法：实验于2005-02/07在吉林省肿瘤防治研究所完成。①对象：正常足月顺产儿脐带由长春市妇产医院提供；肋骨取自吉林省肿瘤医院外科手术患者，排除血液疾患。产妇及外科手术患者对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：采用红细胞裂解法制备有核细胞，以Ficoll-paque淋巴细胞分层液按密度梯度离心法分离出脐血单个核细胞，体外培养24 h后去除悬浮细胞，收集脐血贴壁层细胞，加入到24孔板中，2×106 L-1/孔，再加入含12.5%马血清、12.5%胎牛血清、1×10-7 mol/L氢化考地松的IMDM培养体系1 mL。将肋骨剪成3 cm小块，冲洗髓腔收集细胞悬液，用淋巴细胞分层液分离出骨髓单个核细胞，同法进行骨髓基质细胞的培养。分别将两种细胞于37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养3周后，各自加入到24孔板，2×106 L-1/孔，同时每孔再加入1×106 L-1脐血单个核细胞，培养7 d。以未添加脐血贴壁层细胞及骨髓基质细胞的脐血单个核细胞作为空白对照。③实验评估：倒置显微镜下观察脐血贴壁层细胞与骨髓基质细胞的生长状态。采用流式细胞仪测定脐血单个核细胞周期分布。甲基纤维素半固体培养法测定脐血单个核细胞混合集落形成单位情况。 结果：①脐血贴壁层细胞与骨髓基质细胞的形态：培养2周时，多数脐血贴壁层细胞呈大小不等的圆形、椭圆形，少部分呈不规则形；骨髓基质细胞主要为梭形，细胞排列成漩涡状、辐射状或相互缠绕成束状。②细胞周期：与空白对照相比，经脐血贴壁层细胞、骨髓基质细胞干预的脐血单个核细胞S+G2+M期所占比例均显著升高（P < 0.05）。③混合集落形成单位：经脐血贴壁层细胞、骨髓基质细胞干预后的脐血单个核细胞，其混合集落形成单位的数量显著高于空白对照（P < 0.05）。 结论：①脐血贴壁层细胞与骨髓基质细胞在形态上具有一定差异，但均能提高脐血单个核细胞体外增殖能力。②脐血贴壁层细胞可替代骨髓基质细胞作为脐血造血细胞体外扩增的辅助条件。     

不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景：目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/小牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少。 目的：观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响。 方法：用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定。 结果与结论：脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖。流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变。     

靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控**★

背景：脐血干细胞是基因治疗最理想的靶细胞之一，但基因转移率低下是目前面临的主要障碍。酪氨酸激酶JAK2在造血干/祖细胞自我更新中扮演着重要的作用，为了克服脐血基因转移率低下的障碍，根据基因调控表达技术原理，是否可开发一个可以靶向扩增JAK2基因修饰的脐血CD34+细胞体系。 目的：探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。 单位：卫生部北京医院血液科。 材料：实验于2003-06/2006-04在卫生部北京医院血液科实验室完成。脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血。脐血由北京医院妇产科提供，产妇及家属均知情同意，实验经医学伦理委员会批准。MiniMACS磁性分离仪、免疫磁珠吸附CD34单抗购自德国Miltenyi Biotec公司， 流式细胞仪购自美国FACScalibur，人重组干细胞因子、Flt3配体、人白介素-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血小板生成素为PeproTec产品，SPF级裸鼠购自北京医科大学动物中心。 方法：构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2，内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v，F2)组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白报告基因，用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+ 细胞，用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞。转导后的CD34+ 细胞在集落刺激因子、Flt3配体、血小板生成素、白介素-6细胞因子的联合培养条件下，以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。 主要观察指标：①应用流式细胞仪测定两组CD34+细胞中所含绿色荧光蛋白细胞的百分率，确定基因转移率。②扩增后的脐血祖细胞集落培养结果。③取培养10周的脐血CD34+细胞于裸鼠的胁部皮下注射，30 d后观察成瘤情况。 结果：①实验组与对照组均可获得CD34+ 细胞大量扩增。随着培养时间的延长，实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上，而对照组绿色荧光蛋白报告基因阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失。②实验组转基因CD34+ 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落红系祖细胞、粒单系祖细胞、脐血多向造血祖细胞，所形成的造血祖细胞集落以粒单系祖细胞为主。③裸鼠实验无致瘤特性。 结论：转染JAK2 基因的人脐血CD34+ 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞，对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。     

人羊膜间充质干细胞支持造血的体外实验

背景：骨髓是目前间充质干细胞的主要来源，但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因，其应用具有一定局限性。近年来，羊膜作为间充质干细胞的新来源受到越来越广泛的关注。 目的：探讨人羊膜来源间充质干细胞在体外对造血干细胞的扩增是否有支持作用，以及怎样提高羊膜间充质干细胞和造血干细胞共移植成功率。 方法：利用组织块培养法，从足月分娩的人羊膜中分离培养羊膜间充质干细胞。密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，采用免疫磁珠分选技术分选其中CD34+细胞。分别用脐血单个核细胞和CD34+细胞与羊膜间充质干细胞共培养，连续4周，每周计悬浮细胞浓度，并以骨髓间充质干细胞组及无滋养层组作为对照。采用集落形成实验，把扩增的脐血单个核细胞和CD34+细胞分别接种至甲基纤维素半固体培养基中，14 d后根据典型形态特征计数造血集落数。 结果与结论：羊膜间充质干细胞可促进人脐血单个核细胞和CD34+细胞扩增，扩增后两者在甲基纤维素半固体培养基中能够形成造血祖细胞集落，其造血支持作用与骨髓间充质干细胞相似，两者对比无明显统计学差异。提示，羊膜间充质干细胞体外具有与骨髓间充质干细胞相似的造血支持作用，有可能为造血干细胞体外扩增及临床间充质干细胞与造血干细胞联合移植、提高造血干细胞移植成功率提供一种更加理想的间充质干细胞新来源。