长沙市甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因序列分析

目的对长沙市甲型H1N1流感病毒A/changsha/78/2009的神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因进行测序分析,以期了解该病毒的来源及变异情况。方法利用国家流感中心（CNIC）和世界卫生组织（WHO）推荐的NA基因测序引物和CEQTM8000 Genetic Analysis System对2009年长沙市甲型H1N1流感患者阳性鼻咽拭子标本（A/changsha/78/2009）进行测序,测序结果提交至GenBank并利用Lasergene和Mega5软件对测序结果进行氨基酸比对和进化树分析。结果 A/changsha/78/2009 NA基因GenBank登录号为：GQ463958.1,与瑞典斯德哥尔摩甲型H1N1流感病毒分离株A/Stockholm/37/2009（H1N1）核苷酸同源性为100%;进化树分析显示A/changsha/78/2009 NA基因属于欧亚猪流感分支,包含A/changsha/78/2009在内的甲型H1N1流感病毒与A/swine/Spain/WVL6/1991（H1N1）亲缘关系近;A/chang-sha/78/2009与A/swine/Spain/WVL6/1991 NA基因均有7个潜在糖基化位点,A/changsha/78/2009 NA基因未发生H274Y位点突变。结论包含A/changsha/78/2009在内的甲型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒,A/changsha/78/2009病毒对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感。     

甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的 探讨2009年山东省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(neuram inidase,NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、糖基化位点变异情况.方法 对山东省分离的20株甲型H1N1流感病毒的NA基因序列,用MEGA 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析.结果 山东省2009年9月-2010年1月分离的20株甲型H1N1流感病毒NA基因的同源性均>99.2%,其中有4株的同源性为100%;与疫苗株[A-California-07-2009(H1N1)]、国内推荐株[A-Sichuan-SWL1-2009(H1N1)]的同源性分别为99.1%~99.5%和99.1%~99.6%;有13个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,为21、23、25、42、43、60、76、94、106、122、248、307和351位;未发生神经氨酸酶蛋白275位H-Y的替换.结论 山东省分离的甲型H1N1流感病毒NA基因高度保守,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点以及糖基化位点均高度保守;所有测定样本均未发生对达菲类药物的耐药性突变.     

河南省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的 分析河南省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的变异情况,了解其变异现状及特点。方法 对35株甲型H1N1流感病毒毒株提取病毒总RNA,设计引物运用RT-PCR技术扩增编码NA蛋白的基因序列,测序分析核酸序列并用MEGA4.1软件构建进化树,用BLAST进行比对分析。结果 分离株NA基因316位G/A和742位A/G(N端106位V/I和248位N/D)发生变异,2个突变位点同时存在;同时,通过BLAST分析,发现我国多个省份和亚洲其它多个地区病毒株NA基因存在945位A/G和1 338位T/C突变,进化树分析发现,这两个位点的突变可能来自于中国猪-人之间相互感染。结论 甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因在中国内地传播期间个别核酸位点发生了突变,其氨基酸抗原区有一位点发生变异(106 V/I)。     

宁夏H3N2流感病毒神经氨酸酶基因变异和耐药分析

目的 了解宁夏2020年流感病原学检测情况,分析H3N2流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因特征及对奥斯他韦和扎那米韦的药物敏感性.方法 采集2020年宁夏9家国家级流感监测哨点医院流感样病例标本,采用real time RT-PCR方法进行核酸检测,阳性标本用狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离;分...     

2009-2011年杭州地区甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因的遗传进化分析

目的了解2009年7月以来杭州地区甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因(NA)的变异情况,分析其遗传进化特征。方法在流行季节采集发热病人咽拭子样本,经病毒分离培养及亚型鉴定后,用特异性引物扩增NA基因,测序并分析其遗传进化特征。结果 2009年7月至2011年3月,共检测监测样本1 898份,流感病毒阳性率为37.9%。期间经历了两次甲型H1N1流感病毒流行高峰。各时间段分离株间NA基因高度同源,序列相似性97.9%~100%,但2010/2011年流行株在进化树上分为两支,且与2009/2010年流行株遗传距离相对较远。进一步分析后发现,虽然耐药位点、酶活性位点及其附近氨基酸相对保守,但多个氨基酸变异发生于抗原决定簇上,且增加了NA蛋白茎部第42位糖基化位点。结论结果预示着酶抑制剂类药物对预防和治疗甲型H1N1流感病毒仍将有效,但在开发新疫苗时应该尽可能的避开已经发生漂变的抗原决定簇。     

苏州市甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因的分子演变和遗传特征分析

目的 探讨新型H1N1流感病毒从2009年在苏州出现至2011年基本消失的整个过程中,苏州分离株的神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的分子特征及其基因变异和发展规律.方法 提取苏州分离株的RNA,以WHO推荐的引物扩增NA基因并测序.以WHO推荐的季节性H1N1和新型H1N1疫苗株为参照,采用生物信息学软件对苏州毒株的NA进行详细的分子特征分析,并与全球及全国的代表性毒株进行序列进化分析.结果 与疫苗株相比,5株苏州株的核苷酸序列同源性均值为99.64％,氨基酸序列同源性均值为99.36％.5株苏州株中都没有发现抗原位点的改变,但4株在耐药性相关位点附近出现N248D突变,还有1株2011年株增加了1个新的潜在糖基化位点.结论 首次详细分析了苏州地区2009年以来H1N1型流感病毒NA的分子特征,表明苏州毒株出现了一个新的潜在糖基化位点,但抗原性和药物敏感性均保持稳定.     

赣州市2014年甲型H1N1流感病毒奥司他韦耐药株的筛查结果

目的分析2014年赣州市甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因第275位氨基酸变异情况,掌握其耐药特性,为甲型H1N1流感防治提供参考。方法收集赣州市流感监测哨点医院采集的流感样病例鼻咽拭子标本,采用狗肾传代细胞(MDCK)对标本进行病毒分离,对分离的24株甲型H1N1流感病毒进行核酸提取,采用一步法逆转录-聚合酶链反应(One-step RT-PCR)扩增病毒NA基因部分片段,采用限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)方法,分析扩增的部分NA基因第275位是否发生组氨酸(H)到酪氨酸(Y)的突变。结果 2014年赣州市24株甲型H1N1流感病毒NA基因第275位氨基酸均为组氨酸,未发生变异。结论 2014年24株毒株均对Oseltamivir敏感,One-step RT-PCR-RFLP方法筛查甲型H1N1流感病毒Oseltamivir耐药株简便可行。     

2009甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶参照序列的建立及特征分析

目的建立2009甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)区的参照序列并分析其特征。方法通过GenBank获得100株来自2009甲型H1N1流感病毒NA区全基因序列,利用Pri mer软件进行序列比对,采取相同碱基或氨基酸位置相同碱基或氨基酸最多者作为参照碱基或氨基酸,最终获得参照序列,同时分析所有入选病毒株的基因及氨基酸变异情况;将参照序列与1918年(1918E)、1934年(1934E)流行株,2008年(2008V)、2009年(2009V)疫苗株以及欧亚猪H1N1流感病毒流行株(SWINE)和人禽流感H5N1流行株(H5N1)序列进行比对,分析其基因变异、二硫键和活性中心分布、糖基化位点、抗原表位等特征。结果建立了2009甲型H1N1流感病毒NA区参照序列,与参照株比较,所有分离株的核苷酸及氨基酸同源性均99.00%,核苷酸变异≥5株的位点有6个,氨基酸变异≥5株的位点有2个;该参照序列与相关病毒株核苷酸同源性分别99.79%(2009V)、77.66%(2008V)、78.01%(1934E)、83.19%(1918E)、92.13%(SWINE)、81.91%(H5N1),氨基酸同源性分别为99.57%(2009V)、80.81%(2008V)、80.81%(1934E)、87.42%(1918E)、92.32%(SWINE)、84.22%(H5N1);二硫键和活性中心分布高度保守;2009C与2009V和1918E病毒株糖基化位点类似,与其他病毒株差异较大;抗原表位与2009V完全相同,而与2008V相比,已知存在的表位分别为3?1(B细胞表位)、2:1(Th细胞表位)和7:3(CTL细胞表位)。结论该参照序列可以作为2009甲型H1N1流感病毒NA区参照序列,成为分析基因变异或氨基酸变异的标准。     

H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶基因特性研究

目的 了解H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶(NA)基因变异规律 方法 采用狗肾传代细胞法对流感病毒进行分离培养,提取病毒RNA,逆转录-聚合酶链式反应,扩增NA基因后进行核苷酸序列测定.测序结果与WHO全球流感疫苗株序列进行氨基酸序列同源比对,并采用MEGA 4.0构建系统进化树,计算遗传距离.结果 NA氨基酸序列的...     

2017-2018年河南省流感病毒对神经氨酸酶抑制剂药物的耐药性研究

  目的  分析河南省2017-2018年流感病毒对神经氨酸酶抑制剂（neuraminidase inhibitor, NAI）药物的耐药性, 为流感抗病毒药物的使用提供依据。  方法  病毒来自2017-2018年河南省流感监测网络送检的毒株标本, 经复核鉴定后, 挑选H1pdm09亚型15株、H3N2亚型6株、B型15株共36株毒株使用荧光发光法（fluorescence-basedassay, FL）检测其对奥司他韦和扎那米韦的耐药性。药物敏感参考株为A/California/12/2012（H1pdm09）-275H、A/北京海淀/1942/2014（H3N2）-119E和B/Rochester/02/2001-198D;药物耐药参考株为A/Texas/23/2012（H1pdm9）-H275Y、A/Texas/12/2007（H3N2）-E119V和B/Rochester/02/2001-D198N。  结果  药物敏感参考株为A/California/12/2012（H1pdm09）-275H、A/北京海淀/1942/2014（H3N2）-119E和B/Rochester/02/2001-198D对奥司他韦的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC₅₀）值分别为0.29 nmol/L（nM）、0.10 nM和12.71 nM, 对扎那米韦的IC₅₀值分别为0.2 nM、0.49 nM和0.33 nM。2017-2018年河南省H1pdm09和H3N2亚型流感病毒对奥司他韦的IC₅₀值范围分别为（0.28~1.37 nM）和（0.08~0.17 nM）, 对扎那米韦的IC₅₀值范围为（0.15~0.53 nM）和（0.12~0.22 nM）, 均在相对应型别参考株IC₅₀值10倍以内; B型对奥司他韦的IC₅₀值范围为（11.83~24.59 nM）, 对扎那米韦的IC₅₀值范围为（0.48~1.25 nM）, 均在参考株的IC₅₀值的5倍以内。  结论  2017-2018年河南省检测的流感毒株都对神经氨酸酶抑制剂药物敏感。     

2009年山东省四起甲型H1N1流行性感冒样病例暴发疫情病原学分析

目的 通过对2009年山东省济宁市4起流行性感冒(简称流感)样病例暴发疫情进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况.方法 采集4起流感样病例暴发疫情中发热患者的鼻咽拭子标本34份,采用逆转录实时PCR(realtime RT-PCR)方法进行核酸检测,对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序.利用DNAStar软件对序列进行同源性分析,利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析.与WHO推荐的疫苗株及国内代表株进行对比.结果 在34份鼻咽拭子标本中,17份甲型H1N1流感病毒阳性,11份标本分离培养出了甲型H1N1流感病毒.将其中的7株进行HA基因和NA基因测序,HA、NA基因的同源性分别为98.4%～99.6%、99.2%～100.0%.与WHO推荐的疫苗株及国内代表株相比,有11个HA基因的氨基酸发生替换,分别为38、40、56、90、100、145、172、173、220、303及338位,其中38、40和303位位于抗原决定簇C区,172和173位位于抗原决定簇D区,56位位于抗原决定簇E区,同时40位为糖基化位点;有7个NA基因的氨基酸发生了替换,为80、106、241、248、351、369和386位,386位为糖基化位点;未发生神经氨酸酶蛋白275位H-Y的替换.结论 山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变.     

Inferring the antigenic epitopes for highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses

The evasion of influenza virus from host immune surveillance is mainly mediated through its surface protein hemagglutinin (HA), the main component of influenza vaccine. Thus, identification of influenza virus antigenic epitopes on HA can not only help us understand the molecular mechanisms of viral immune escape but also facilitate vaccine strain selection. Despite previous efforts, there is a lack of systematic definition of the antigenic epitopes for the highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5N1 viruses. In this study, we infer the HA antigenic epitopes for H5N1 viruses by integrating the antigenic sites mapped from the HA of human influenza H3N2 viruses, the sites which were reported to be associated with immune escape in H5 viruses and the mutation hotspot sites identified in the evolutionary history of HPAI H5N1 viruses. We show that these inferred antigenic epitopes play significant roles in antigenic variation of HPAI H5N1 viruses. Based on inferred antigenic epitopes, we further develop a computational method to effectively predict antigenic variants for HPAI H5N1 viruses (available at http://biocloud.hnu.edu.cn/predict/html/index.html). Therefore, our work has not only inferred the antigenic epitopes for HPAI H5N1 viruses but also provided an effective computational method to assist vaccine recommendations for protection against the deadly bird flu.     

甲型H1N1病毒HA、NA氨基酸序列比较及抗原性表位预测

目的：比较新型甲型H1N1流感病毒分离株HA、NA氨基酸序列之间的差异,分析HA、NA蛋白可能的抗原性细胞表位。方法：从GenBank中选取28株世界各地的新型甲型H1N1流感病毒分离株并下载各株HA、NA的氨基酸序列;使用ClustalX和MEGA2.0软件对氨基酸序列的进行进化树分析;用Protean软件预测HA、NA蛋白的B细胞表位;用NetMHCⅡ2.2预测T细胞抗原表位。结果：世界范围的毒株之间氨基酸序列相对保守,HA及NA均只有少数位点的变异,HA蛋白氨基酸序列之间较NA蛋白氨基酸序列之间变异较大;预测HA蛋白具有8个B细胞表位和10个T细胞表位;NA蛋白有12个B细胞表位和7个T细胞表位。结论：HA、NA蛋白的少数区域抗原性相对比较稳定,可以作为检测以及疫苗研究的靶区域。     

Antigenic sites of H1N1 influenza virus hemagglutinin revealed by natural isolates and inhibition assays

The antigenic sites of hemagglutinin (HA) are crucial for understanding antigenic drift and vaccine strain selection for influenza viruses. In 1982, 32 epitope residues (called laboratory epitope residues) were proposed for antigenic sites of H1N1 HA based on the monoclonal antibody-selected variants. Interestingly, these laboratory epitope residues only cover 28% (23/83) mutation positions for 9 H1N1 vaccine strain comparisons (from 1977 to 2009). Here, we propose the entropy and likelihood ratio to model amino acid diversity and antigenic variant score for inferring 41 H1N1 HA epitope residues (called natural epitope residues) with statistically significant scores according to 1572 HA sequences and 197 pairs of HA sequences with hemagglutination inhibition (HI) assays of natural isolates. By combining both natural and laboratory epitope residues, we identified 62 (11 overlapped) residues clustered into five antigenic sites (i.e., A-E) which are highly correlated to the antigenic sites of H3N2 HA. Our method recognizes sites A, B and C as critical sites for escaping from neutralizing antibodies in H1N1 virus. Experimental results show that the accuracies of our models are 81.2% and 82.2% using 41 and 62 epitope residues, respectively, for predicting antigenic variants on 197 paring HA sequences. In addition, our model can detect the emergence of epidemic strains and reflect the genetic diversity and antigenic variant between the vaccine and circulating strains. Finally, our model is theoretically consistent with the evolution rates of H3N2 and H1N1 viruses and is often consistent to WHO vaccine strain selections. We believe that our models and the inferred antigenic sites of HA are useful for understanding the antigenic drift and evolution of influenza A H1N1 virus.     

2005年-2009年大连市季节性甲型H1N1流感病毒HA基因序列分析

目的:分析大连市2005年-2009年流感病毒H1N1亚型血凝素抗原性及其基因变异情况,为流感防治提供技术支持。方法:采集流感样病例的鼻咽拭子标本,用MDCK细胞进行流感病毒的病原分离,采用红细胞凝集实验测定病毒的滴度,用血凝抑制试验和RT-PCR进行流感病毒型别鉴定,通过RT-PCR扩增血凝素HA片段的基因,电泳、纯化后进行基因序列测定,利用生物信息学进行序列分析。结果:2005年-2009年共分离到季节性甲型H1N1流感病毒39株,其中28株进行了测序。与当年的疫苗株相比,2005年、2006年、2007年和2008年分离株的HA1区分别发生了11个、9个、15、15个突变。结论:在近几个年度的流行季节中,该地区有H1N1亚型流感的存在。该地H1N1流感病毒分离株有多处氨基酸发生替换,氨基酸的替换导致毒株的抗原性发生了漂移。     

2018-2019年流感流行季节河北省流感病毒对神经氨酸酶抑制剂药物的耐药性研究

目的  分析河北省2018-2019年流感流行季节流感病毒对神经氨酸酶抑制剂类(neuraminidase inhibitor, NAI)药物的耐药情况, 为流感的预防控制提供依据。 方法  选取H1N1(pdm09)亚型毒株25株、H3N2亚型毒株11株共36株流感病毒毒株进行生物学耐药实验, 使用荧光发光法检测病毒对奥司他韦和扎纳米韦的药物敏感性。 结果  2018-2019年河北省H1N1(pdm09)和H3N2亚型流感病毒全部对奥司他韦和扎那米韦敏感, 对奥司他韦的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)平均数分别为0.50 nM(0.07~1.14 nM)和0.25 nM(0.09~0.69 nM), 对扎那米韦的IC₅₀平均数分别为0.29 nM(0.09~0.85 nM)和0.87 nM(0.17~1.81 nM), 均在相对应型别参考株IC₅₀值10倍以内。 结论  2018-2019年河北省检测的流感毒株都对NAI类药物敏感。     

2003—2008年河北省H3N2亚型流感病毒HA1基因演变特征

目的了解近几年河北省H3N2亚型流感病毒HA1基因演变概况。方法选取2003—2008年河北省分离的25株H3N2亚型流感病毒,提取病毒RNA,进行逆转录一聚合酶链反应扩增,产物纯化测序,测定的序列用生物信息软件分析。结果每个流行期分离的毒株都较当年的疫苗株或前一年的毒株出现了位于不同抗原决定簇或者受体结合位点的氨基酸替换。2003—2008年不同流行期分离株在3、140、142、144、145、158、159、189、192、193、198、204、225、226和227位点氨基酸发生了变化,多数的改变发生在抗原决定簇A、B及RBS。进化树分析显示,每个流行期分离株均与前一年的毒株或当年疫苗株出现了不同程度的变化,不断出现新的进化分支,同一流行期分离株基本呈现集中分布。结论2003—2008年河北省H3N2亚型流感病毒HA1基因不断发生变异,密切关注其变异对防控流感流行有重要意义。     

北京市2010年-2011年儿童甲型H3N2流感病毒神经氨酸酶基因进化和耐药性位点分析

目的:了解2010年9月1日-2011年8月31日期间北京市儿童甲型H3N2病毒的神经氨酸酶基因进化和耐药性位点情况。方法:采集儿童流感样病例标本,分离与鉴定流感病毒。选取14株甲型H3N2流感毒株进行神经氨酸酶(NA)基因的扩增和序列测定。并对NA的基因变异、进化特点和耐药性位点进行分析。结果:共分离64株甲型H3N2毒株。序列分析发现2010年-2011年毒株NA抗原决定簇氨基酸位点发生变异。进化树分析结果显示NA基因进化为不同的两支。毒株NA耐药性位点无变异。结论:北京市2010年-2011年儿童甲型H3N2流感毒株NA基因呈现两个不同的进化分支,基因特性有明显改变,尚未有耐药位点变异。     

Possible correlation between low antigenic drift of A(H1N1) influenza viruses and induction of HI antibodies

This study examined whether, during a seven-year period of low A(H1N1) influenza virus antigenic drift (1988–1989 and 1994–1995, winters), humoral antibody response of elderly volunteers to influenza vaccines could suggest a lack of antibody pressure for drift. In all the years studied A/Taiwan/1/86, the A(HIN1) vaccine component, had a low ability to induce protective hemagglutination-inhibiting (HI) antibody titres ( 1:40). However a similar low immunogenicity was found for some of the different A(H3N2) strain variants of influenza virus, co-circulating in the same period and showing a regular extent of antigenic variations.Although our data could be at least in part explained by the type of study population (elderly and repeatedly vaccinated), postepidemic serological studies did not evidence a consistently lower ability in mounting protective immune response in elderly people as compared with younger against the influenza strains studied. Therefore, our present results did not exclude a true low immunogenicity of A/Taiwan and of some A(H3N2) influenza strains, circulating in the winters examined. This suggests that, besides the necessity to evade prior immunity, additional factors could influence the frequency of influenza viruses antigenic drifts.Abbreviation HI hemagglutination inhibiting     

广州市甲型H1N1流感病毒的持续进化变异监测

目的  通过对H1N1流感病毒进行基因进化变异监测,为H1N1流感的科学防控提供研究数据。 方法  对广州市2017-2019年132株H1N1流感病毒进行血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)基因测序,分析不同流行年度病毒的分子变异特点。 结果  2017-2019年广州市H1N1流行株HA和NA基因均聚为一簇,提示具有相同进化起源。2019年分离株依次由2017年分离株经2018年分离株过度进化而来,呈现较为明显的时间进化趋势。HA基因持续变异的抗原位点主要分布在91、181、202位,其中2018年H1N1流行株HA蛋白抗原位点的变异具有较为明显的多样性。2017和2019年流行株中有3株病毒发生NA蛋白H274Y神经氨酸酶抑制剂的耐药突变。 结论  广州市2017-2019年H1N1流行株与同年度疫苗株的匹配性较好,但病毒基因在持续进化和变异,在抗原位点和耐药位点上不同流行年份表现基因多态性。