荧光定量PCR检测血清巨细胞病毒DNA的临床应用

目的建立一种区分巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)潜伏性感染与活动性感染并适于临床大量标本CMV DNA检测的常规检测方法。方法利用血清作为待检标本,通过优化实验方案,建立血清CMV DNA的荧光定量PCR(fluorogenic quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法;并利用FQ-PCR技术对54例疑似CMV感染的患儿(1个月～15岁,抗CMV IgM阳性或IgM与IgG双阳性)及32例患非感染性疾病的患儿(3个月～14岁,抗CMV IgM检查均阴性,部分患儿抗CMV IgG阳性)血清CMV DNA进行检测。结果54例CMV疑似感染患儿中,CMV DNA检测大于1×10~3拷贝/ml者占40.74%,而32例非感染性疾病患儿中,CMV DNA检测大于1×10~3拷贝/ml者只占18.75%,两者比较有显著性差异(P<0.05)。采用FQ-PCR技术,在LightCycler和Rotor-Gene检测仪上检测具有相同的灵敏度,且具有可比性。结论FQ-PCR定量检测血清CMV DNA的方法能够更灵敏地反映CMV活动性感染,假阴性率低,重复性好,结果可靠。FQ-PCR定量检测血清内CMV DNA的方法可作为临床CMV DNA的检测的常规方法。     

用PCR检测HCMVDNA失败原因探讨

聚合酶链反应(PCR)是一种新的基因扩增技术,应用日趋广泛,但影响因素较多,有时得不到满意的结果。我们在用PCR 检测人巨细胞病毒DNA 时发现,紫外吸收法进行引物定量,不一定能测出样品中     

三种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影响的比较

目的 研究3种核酸提取方法对黄疸、溶血和脂血标本HBV DNA荧光定量结果的影响,为进一步提高临床检验质最和改进检测技术提供理论依据.方法 采用目前临床常用的多聚糖病毒沉淀浓缩法(PEG法)、碱液直接裂解和微量核酸释放剂(Micro-Nucleic-Releaser,MNR)等3种核酸提取方法,对含有HBV的黄疸、溶血和脂血标本进行荧光定量PCR检测,研究不同标本对荧光PCR定量结果和扩增效率的影响.选择酚一氯仿提纯法作为核酸提取对照方法.结果 黄疸、溶血和脂血标本,对3种不同核酸提取方法的荧光PCR定量结果和扩增效率都产生不同程度的影响,其中完全溶血的标本对PCR扩增效率的影响最大,如定量值为4×103拷贝/ml的低拷贝完全溶血标本,MNR法测定结果为2.21×103拷贝/ml,PEG法为1.02×103拷贝/ml,碱性直接裂解法的定量值为阴性,临床自然溶血较重的标本对荧光定量检测影响较小,脂血和黄疸标本对荧光定量PCR扩增效率有明显抑制作用,但对实际定最值无明显影响;其中,MNR法在不同标本的定量重复性和荧光PCR扩增效率最好,碱液直接裂解法较差.酚.氯仿提纯法虽然获得较高的扩增效率,但存在大约有1个数量级的核酸丢失.结论 基于MNR核酸提取方法的荧光定量PCR检测,对不同的临床标本均可获得较好的扩增效率、敏感性和重复性,操作简便、快速且无核酸丢失和污染,适合临床检验应用.     

骨髓移植患者血及尿中巨细胞病毒感染核酸标志物的检测

目的 为骨髓移植患者寻找较好的诊断和治疗巨细胞病毒（ＣＭＶ）感染的分子生物学依据。方法 用聚合链反应（ＰＣＲ）方法测尿中ＣＭＶ－ＤＮＡ,逆转录（ＲＴ）－ＰＣＲ法测血中ＣＭＶ－即刻早期抗原（ＩＥ）ｍＲＮＡ。结果 在被测的２７例患者１０３份标本中,发现１０例ＣＭＶ感染者的尿ＣＭＶ－ＤＮＡ及血ＩＥ ｍＲＮＡ几乎同时阳转。在连续使用抗病毒药甘昔洛瓦（ＤＨＰＧ）治疗的６例患者中,ＩＥ ｍＲＮＡ约一周左右阴转     

滤纸片干血斑检测TT病毒DNA

目的 建立一种快速、方便、准确的方法检测TT病毒的基因片段。方法 采集被检者全血滴在经EDTA--蛋白酶预处理的滤纸片上,室温干燥后,密封并保存于-20℃,然后进行PCR检测;同时取血清用传统方法作对照。结果 在相同时间内,本法测得的结果,与传统方法所得结果无异。结论 该方法具有特异、敏感、方便等特点,用此法检测TTV DNA是切实可行的。     

PCR检测肺炎支原体DNA

ＰＣＲ检测肺炎支原体ＤＮＡ余钟声汪天林尚世强陈志敏俞锡林（浙江医科大学附属儿童医院儿科研究所，杭州３１０００３）关键词支原体聚合酶链反应肺炎支原体肺炎（ＭＰＰ）病理形态可呈各种类型，但其肺部体征轻，无实验室依据时常易漏诊。１９８９年Ｂｅｒｎｅｔ等〔１...     

肾移植术后受者人巨细胞病毒巢式PCR检测

目的探讨巢式PCR检测肾移植术后受者人巨细胞病毒（HCMV）DNA的方法，并与ELISA法进行比较。方法针对HCMVAD169株IEA基因设计两对巢式PCR引物，对50例肾移植术后受体血、尿标本进行HCMVDNA检测。分离血清作ELISA检测IgG、IgM。结果血液巢式PCR阳性率56％，尿液阳性率46％；ELISA法阳性率：IgG82％，IgM28％，IgG＋IgM28％。两种方法的阳性率进行统计学分析，P〈0．05，存在统计学差异。结论巢式PCR是一种敏感、快速诊断HCMV感染的方法，灵敏度及特异性均高于传统ELISA法，并能弥补ELISA的假阴性。不仅为临床HCMV疾病的诊断与治疗，同时也为选择普遍性预防抑或症状发生前的预先治疗提供可靠的实验室依据。     

献血员巨细胞病毒DNA的检测及意义

目的 检测献血员血液中巨细胞病毒DNA，了解献血员感染巨细胞病毒的情况，防止由于输血而发生医源性感染。方法 采用快速，敏感，特异的聚合酶链反应（PCR）电泳法及PCR-ELISA法对212例献血员进行人类巨细胞病毒9HCMV）DNA的检测。结果 18例HCMV-DNA阳性，占被检对象的8.49%(18/212)；同时显示HCMV-DNA阳性率与献血员性别，年龄段差异无显著性相关。结论 由于献血者中存在着HCMV感染的情况，故在临床治疗用血时，应对献血者进行HCMV的检测，以保证受血者生命安全。     

真菌基因组DNA的提取和通用PCR检测方法的建立

目的改良真菌基因组DNA的提取方法,建立真菌通用聚合酶链反应（PCR）,为目前临床真菌感染的早期诊断、预防和治疗提供有效工具。方法参考前人报道的多种真菌基因组DNA的提取方法,作改良以确立本研究中所采纳的手段,并应用真菌核糖体DNA（rDNA）通用引物,以实验室保存的标准菌株及临床分离菌株来建立临床真菌感染检测用通用PCR。结果白念珠菌和烟曲霉在75℃温度下分别作用60和80min可以完全被灭活。经目前多种破壁方法的探讨,发现对于白念珠菌（单细胞真菌）选用酶消化法,破壁效率高达98．29％,而烟曲霉（多细胞真菌）则需要酶消化法与打击器振荡法联合应用,其破壁率也可达66．68％,进一步用酚氯仿法抽提其基因组DNA,能够获得相对纯度高且有一定得量。当选择真菌rDNAITS2区间的一对通用引物,通过PCR反应体系的优化,使得本研究中建立的通用PCR,对于白念珠菌和烟曲霉的检测下限分别为5个和9．7个,其PCR产物测序结果与数据库比对完全一致,同时选择临床分离的或实验室保存的其他真菌、细菌和病毒株进行验证,该方法仅针对真菌群,结合测序分析可以实现种属水平的鉴定。结论改良真菌基因组DNA提取后所建立的针对真菌rDNA的通用PCR敏感且特异,适宜实验室操作。     

荧光定量PCR检测巨细胞病毒感染的临床分析

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）又称人类疱疹病毒5型，属于疱疹病毒亚科。HCMV是有包膜的DNA病毒，为双链线性DNA分子，其基因组长约240kb。HCMV具有高度种属特异性，只能在人成纤维细胞中培养增殖，并可产生典型的细胞病变：细胞膨胀增大，细胞核及胞浆内出现包涵体。HCMV在体内除了可感染人成纤维细胞外，还可感染表皮细胞、内皮细胞、精子细胞及巨噬细胞等，引起巨细胞包涵体病、输血后传染性单核细胞增多症、先天畸形、肝炎、间质性肺炎及视网膜炎等疾病。     

巨细胞病毒即刻早期基因mRNA检测方法的建立

目的建立快速简便的逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）即刻早期（ＩＥ）基因ｍＲＮＡ。方法设计合成跨越ＨＣＭＶＩＥ基因内含子区的一对引物，分别用ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｍＲＮＡ和ＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性产物。结果ＨＣＭＶＩＥ基因ｍＲＮＡ表达在感染后６小时即可出现，并持续到感染后至少９６小时，ＲＴＰＣＲ检测的最低敏感性为１００ｆｇ总ＲＮＡ，其他病毒和细胞ＲＮＡ不能被扩增。结论ＲＴＰＣＲ技术检测ＨＣＭＶｍＲＮＡ敏感、特异，有望应用于临床作为ＨＣＭＶ活动性感染的早期诊断方法     

PCR技术检测患者血清HBV DNA定量分析

本文采用荧光信号能量转移方法对109例乙肝患者血清进行了PCR定量的HBV-DNA检测，现将结果报告如下。     

巢式聚合酶链反应检测SEN病毒方法的建立

目的 建立用于SEN病毒（SENV）检测的巢式聚合酶链反应（nPCR）方法。方法 选择SENV各亚型间高度保守的5′端非编码区（5′－NCR）序列设计2对特异性引物，建立可同时检测SENV所有亚型的nPCR方法。对173例慢性乙型肝炎（CHB）患血清和96份正常人血清进行SENV检测，并随机选择3份PCR阳性产物进行克隆测序。结果 倍比稀释实验表明该方法的终检稀释度为10^3。PCR产物克隆测序结果显示：各分离株与Genbank收录的SENV序列相应区段同源性为95％－96％。CHB患SENV感染率为86．1％，正常人为85．1％，二差异无显性（χ^2=0.381,P=0.537)。结论 该方法敏感、特异且简便经济，适于开展SENV的流行病学研究。     

溶血对荧光定量PCR检测低水平HBV DNA的影响

HBV DNA定量能反映乙型肝炎病毒的复制情况,在临床诊断、治疗等方面具有重要的参考价值。在留取标本时要求较为严格,一般规定溶血者为不合格标本,因为其中的血红蛋白（Hb）在核酸提取时可能无法彻底去除,会抑制核酸扩增从而影响结果的准确性。     

实时荧光定量PCR法检测血清HBV DNA的临床意义

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)感染可引起多种类型的急慢性肝病 ,包括从轻的无症状ＨＢｓＡｇ携带者 (ＡＳＣ)到严重的重型肝炎 ,最终可形成肝硬化和肝细胞癌(ＨＣＣ) [1] 。ＨＢＶ复制启动乙型肝炎病变活动。ＨＢＶＤＮＡ是ＨＢＶ感染和复制最直接、特异和灵敏的指标。作者等采用实时荧光定量聚合酶链反应 (ＦＱ ＰＣＲ)法 ,观察不同临床类型ＨＢＶ感染者ＨＢＶＤＮＡ水平 ,探讨其与临床的关系及诊断意义。1　临床资料1.1　病例选择　 4 75例ＨＢＶ感染者为 2 0 0 0年 3月至 2 0 0 0年 12月本院门诊和住院病人。其中男 371例 ,女 10 4例 ,平均年龄…     

PCR和巢式PCR直接检测血清中HIV核酸序列

采用ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ方法对５３例ＨＩＶ抗体阳性和阴性标本进行了检测，以扩增ＨＩＶ特异性ＤＮＡ序列，结果美国ＡｂｂｏｔｔＨＩＶ阳性血清２份，新加坡阳性血清２份，国内阳性血清２份及ＨＩＶ－１病毒培养物１份，两套ＰＣＲ扩增反应物均为阳性，对其中一套ＰＣＲ扩增的ｇａｇ基因序列进行巢式ＰＣＲ也为阳性。采自西南边境地区的２３份ＥＬＩＳＡ和ＷＢ阳性血清，各种ＰＣＲ反应均为阳性；１１份ＥＬＩＳＡ可疑阳性、ＷＢ阴性标本中，有两例血清呈ＰＣＲ阳性，探针杂交亦为阳性。而１２例ＳＩＶ、ＳＲＶ及猴血清标本ＰＣＲ反应均为阴性。上述结果表明，采用ＰＣＲ方法检测血清中ＨＩＶ核酸序列是一种很有前途的ＨＩＶ感染诊断方法。     

标本前处理方法对乳汁HBV DNA检测的影响

目的探索一种简单易行的乳汁标本前处理方法 ,以便准确测定乳汁中的HBVDNA浓度。方法 4℃冰箱过夜后取中间层乳汁进行检测,以离心后的上清液、上清液浓缩、沉淀3种方法平行检测20份大三阳产妇的乳汁HBVDNA含量。结果沉淀方法检测阳性率为98%,明显高于其他2种方法 (均P0.01)。阳性标本HBVDNA的对数浓度为4.8±0.5,与其他2种方法比较,差异有统计学意义(均P0.01)。结论 4℃冰箱过夜后取中间层乳汁离心沉淀检测HBVDNA是比较准确可靠的,方法简单易行,值得临床推广应用。     

PCR在检测HBV DNA中的应用

ＰＣＲ在检测ＨＢＶＤＮＡ中的应用汤继光，黄立东，范友谊，李玉强，杨爱民，徐云，周光炎目前，国内文献报道用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）检测乙肝病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ，大多集中在方法学上［１，２］。我们用ＰＣＲ技术和酶联免疫试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测了６１２...