靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化。结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率。分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因。结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础。     

靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究EZH2基因在肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

MDR1 shRNA表达质粒的构建

目的构建由pSIREN—RetroQ-ZsGreeen载体介导、表达MDR1短发卡RNA（shorthairpinRNA,shRNA）的重组质粒。方法分别针对MDR1基因的两个不同位点,按BamHI＋Sense＋Loop＋Antisense＋终止信号＋EcoRI结构合成编码shRNA的DNA序列及其反义序列,退火连接及磷酸化形成双链后,将其依次导入pSIREN—RetroQ—ZsGreeen载体,构建成能产生MDR1shRNA的质粒,并进行序列分析。结果重组质粒（pSIREN—RetroQ-ZsGreeen—A和pSIREN—RetroQ—ZsGreeen—B）经酶切与测序证实两段寡核苷酸片段成功插入到预计位点,序列完全一致,无任何碱基突变。结论MDR1shRNA的表达载体pSIREN—RetroQ—ZsGreeen—A和pSIREN—Ret—roQ—ZsGreeen-B成功构建,为进一步研究肿瘤多药耐药逆转奠定了实验基础。     

APRIL shRNA表达载体的构建与筛选

目的 构建并筛选有效的、编码短发夹RNA(shRNA)的增殖诱导配体(APRIL)基因特异性真核表达裁体.方法 分别设计、合成4对寡核苷酸单链,经退火、连接得到APRIL-shRNA双链,定向克隆至带有H1启动子、绿色荧先蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和Neo基因的pGCsi-H1/Neo/GFP质粒裁体中,柏建4条含APRIL基因shRNA的pGCsi-H1/Neo/GFP-APRIL-shRNA真核表达裁体,转染高表达APRIL的结直肠癌细胞株SW480.G418筛选,荧光显微镜下现察转染效率,FQ-RT-PCR检测APRIL mRNA水平,Western印迹分析APRIL蛋白表达.结果 测序证实pGCsiH1/Neo/GFP-APRIL-shRNA(APRIL shRNA)构建成功,无碱基突变,4种不同shRNA质粒转染细胞后APRIL mRNA和蛋白表达差别有统计学显著性意义(P＜0.01).结论 成功地构建APRIL shRNA真核表达裁体,敲低效率85%以上,可用于后续的实验研究.     

MACC1基因shRNA真核表达载体的构建及其在OVCAR-3细胞中的表达

目的:构建结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1,MACC1)小发卡RNA(small hair RNA,shRNA)的真核表达载体,观察其在卵巢癌细胞OVCAR-3中的表达。方法:设计、合成MACC1特异性shRNA序列,插入载体p-super-EGFP-I中,重组载体转染OVCAR-3,半定量RT-PCR和western blot技术检测转染前后OVCAR-3细胞中MACC1的表达。结果:成功构建MACC1shRNA真核表达载体,转染后OVCAR-3细胞中MACC1的表达受到显著抑制。结论:成功构建MACC1特异性shRNA表达载体,为进一步研究MACC1参与卵巢癌发生发展的机制奠定实验基础。     

CHOP基因shRNA载体构建及沉默效应

背景:研究认为,CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)通路是内质网应激介导细胞凋亡的3条通路之一,目前国内外对内质网应激介导细胞凋亡在胃癌方面的研究较少。目的:构建针对人CHOP基因的短发卡RNA表达载体,观察RNA干扰对人胃癌细胞系BGC823细胞CHOP基因表达的抑制作用。方法:设计CHOP的shRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入真核表达载体pSUPER-EGFP1,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人胃癌细胞系BGC823细胞,采用RT-PCR和Western blotting分别检测CHOP基因mRNA和蛋白表达的变化。结果与结论:把针对CHOP基因的shRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPER-EGFP1载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blot检测显示,CHOP基因的表达水平明显降低,其中以CHOP-1为靶序列的shRNA沉默作用最强,CHOP的表达抑制率约67%。     

靶向人血管内皮生长因子-C基因的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建靶向人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因的shRNA真核表达载体并检测其对靶基因的沉默效应.方法:根据靶基因VEGF-C序列,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSIREN-RetroQ载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定;脂质体介导重组质粒转染乳腺癌MCF-7细胞株,荧光定量PCR及Westen-blot检测其对靶基因VEGF-C表达的影响.结果:酶切及测序鉴定重组质粒pSIREN-VEGF-C的序列正确;转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人VEGF-C基因的shRNA真核表达载体,并在乳腺癌MCF-7细胞中高效、特异地发挥靶基因沉默作用.     

靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒，为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并连接入pGenesil-2载体，并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中，经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体，为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体的构建

目的：构建单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体。 方法：实验于2002—10／2003-05在解放军第二军医大学中心实验室完成。①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段合成。（2）将发卡小分子干扰RNA克隆人质粒pSilencer产生重组质粒SiRNA—pSilencer-单核细胞趋化因子1。③分别用BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定，随机分为1，2样本，每份样本进行10次电泳，并且采用460bpi标准参照样。④将经酶切鉴定后的重组质粒作测序分析。 结果：①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段被成功克隆进pSilencer-U6质粒中。②BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定可切出450bpi大小的片段，结果表明样本1，2均与参照以及marker相一致，从片段大小的角度初步确定酶切的准确。③DNA测序分析显示，重组质粒小分子干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致。 结论：针对单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段的真核表达载体SiRNA—pSilencer-单核细胞趋化因子1的成功构建，为进一步研究其基因功能打下了基础。     

靶向转化生长因子β1的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建靶向转化生长因子β1（TGFβ1）小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体.[方法]设计二个siRNA作用靶点,体外合成的相应双链DNA被插入pSilencer-2.1质粒中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序.采用脂质体转入HSC-T6细胞中,利用RT-PCR法和western-blot分别检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达.[结果]靶向TGFβ1 的siRNA-a和siRNA-b二个表达质粒是成功构建; 与无关对照组相比,siRNA-b组对TGFβ1mRNA和蛋白表达均明显下调（ P 〈0.01）,siRNA-a组无明显下调（ P 〉0.05）.[结论]成功构建了靶向TGFβ1 基因的siRNA表达质粒,为进一步研究其阻断肝纤维化打下基础.     

GATA-3短发夹状RNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建GATA-3特异性短发夹状RNA(shRNA)逆转录病毒表达载体。方法设计、合成两对GATA-3编码基因的反向重复序列,中间插入9个碱基的短发夹,经退火形成互补双链,再克隆至逆转录病毒载体RNA i-Ready pSIREN-RetroQ。结果构建的重组逆转录病毒载体可以被限制性内切酶BamH I,EcoR I切开,电泳可显示相应条带,经测序其序列与设计的一致。结论成功构建GATA-3特异性shRNA逆转录病毒载体RetroQ/GATA-3/shRNA,为进一步进行肿瘤细胞GATA-3基因沉默的研究奠定了基础。     

人miR-152基因的慢病毒载体的构建及稳定株筛选

目的构建人miR-152基因重组慢病毒载体并筛选稳定表达株。方法 PCR扩增包括miR-152前体所在区域的基因组DNA,克隆到慢病毒载体表达质粒pGIPZ中,得到重组的pGIPZ-miR-152表达载体,通过与包装质粒共转染HEK-293T细胞,获得携带miR-152 minigene的重组慢病毒。用病毒感染HepG2细胞,72 h后用嘌呤霉素筛选。用real-time PCR法检测miR-152基因的表达。结果构建的重组质粒经双酶切验证和测序比对鉴定正确;该质粒转染293T细胞获取的慢病毒滴度达7.5×107TU/mL;用病毒感染HepG2细胞,感染效率达70%以上。药物筛选10 d后,获得的过表达株miR-152表达量比正常细胞高近10倍。结论成功构建人miR-152基因慢病毒载体质粒pGIPZ-miR-152,并筛选出miR-152过表达细胞株,为后续实验奠定基础。     

ICAT干扰慢病毒表达载体构建及稳转HL60细胞株的建立

目的构建ICAT基因的干扰慢病毒表达载体,建立稳定转染的HL60细胞系。方法人工设计、合成针对ICAT基因干扰序列,退火后连接到PGLV3干扰载体上,与PG-p1-VSVG、PG-p1-REV、PG-p1-RRE共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染HL60细胞,建立稳定细胞株;应用RT-PCR和Western Blot技术检测HL60稳定细胞中ICAT基因和蛋白表达情况,并与对照组进行比较。结果成功构建了针对ICAT基因的RNAi慢病毒表达载体,病毒滴度为2×10~8 TU/mL;建立稳定转染的HL60细胞株。有效干扰验证显示,shICAT能明显降低ICAT的mRNA及蛋白水平(P0.001)。结论成功构建ICAT基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰ICAT表达的HL60细胞株。     

mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定

目的构建mTORsiRNA重组表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞mTOR基因的相关研究奠定基础．方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6／GFP／Neo中构建重组表达载体,转化DH5c~菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染人巨噬细胞RAW264．7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Westernblot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTORsiRNA重组表达载体。Westernblot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约4l％。结论mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选,该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。     

中国人组织因子途径抑制物-2基因的真核表达载体的构建

目的 构建组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）-pcDNA3．1的表达载体，为进一步研究其表达和蛋白功能奠定基础。方法 设计带有BamHⅠ和XhoⅠ的上、下游引物，从TFPI-2-pcDNA2．1克隆载体中扩增TFPI-2基因片段，PCR产物电泳、胶回收。将回收产物与BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3．1表达载体连接，用酶切鉴定其长度和方向并正、反测序鉴定。结果 TFPL2成功插入pcDNA3．1表达载体，酶切鉴定其长度和方向均正确，测序结果也证实其正确的载人。结论 通过上述方法能成功构建TFPI-2-pcDNA3．1表达载体，为进-步研究其功能奠定基础。     

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景:survivin 基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关.目的:构建靶向survivin 基因的shRNA 重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin 基因mRNA 水平.方法:以survivin 基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA 序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6 建立重组表达载体pENTR/U6-SUR ;转化E.coli TOP10 菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR 和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3 细胞,RT-PCR 检测重组质粒对细胞survivin 基因mRNA 水平的抑制效果.结果与结论:将设计合成的shRNA 序列经退火后克隆至pENTR/U6 载体中,菌落PCR 可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR 重组质粒转染后PC3 细胞survivin 基因mRNA 表达水平显著下降,且24 h 比48 h 作用更明显.成功构建了靶向survivin 基因的shRNA 质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3 细胞中survivin 基因mRNA 水平.     

小发夹RNA对白血病K562细胞血管内皮生长因子受体Fit-1基因表达的抑制作用

本研究观察小发夹RNA对白血病细胞血管内皮生长N子受体flt-1基因表达的抑制作用并探讨其对白血病细胞侵袭能力的影响及作用机制。采用脂质体介导的方法将构建的人flt-1基N特异性shRNA真核表达载体转染入K562细胞,用（3418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组DNA,用PCR方法验证shRNA基因对K562细胞的转染;以RT—PCR和免疫印迹反应检测flt-1mRNA和蛋白表达量的变化;用Boyden小室体外侵袭实验检测白血病细胞的侵袭能力;RT～PCR方法检测白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达。结果表明,flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入白血病细胞株K562,G418筛选2周获得阳性克隆;PCR检测证实shRNA基因整合入白血病细胞基因DNA;携有shRNA的flt-1基因能明显下调白血病细胞内flt-1基因mRNA表达水平;设计的2种不同flt-1shRNA序列能不同程度干扰flt—1基因和蛋白在细胞中的表达,两纽阳性细胞中flt-1基因表达抑制率分别为46．1％和65．4％;flt—1 shRNA转染白血病细胞系K562细胞后,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平均较转染前明显下降;阳性细胞穿透人工重组基底膜的能力（4．3±1．2）％较对照组（12．7±1．9）％及（9．6±1．7）％明显降低（P〈0．01）。结论：VEGF受体flt-1特异性shRNA的真核表达载体能够高效转染入白血病细胞株K562,有效抑制flt-1基因的表达,并使白血病细胞体外侵袭能力减弱,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平下降。这提示VEGF可能通过与其受体结合调控MMP-2和MMP-9的方式,参与白血病细胞的转移。     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.