利用XcmⅠ构建T载体

目的:构建能自我复制的T载体.方法:设计一对引物,引入XcmⅠ酶切位点,通过PCR方法用PET-28(a)+作模板扩增550bp,插入Pa载体后用限制性内切酶、PCR及DNA测序等方法作鉴定.结果:用XcmⅠ酶切可见540bp及3810bp双酶切条带,用此载体作模板可扩增出550bp片段,测序结果与预期序列一致.结论:带有两个XcmⅠ位点的环状载体被成功构建.     

利用Xcm I构建T载体

目的：构建能自我复制的T载体。方法：设计一对引物，引入Xcm I酶切位点。通过PCR方法用PET－28（a)^ 作模板扩增550bp，插入Pa载体后用限制性内切酶，PCR及DNA测序等方法作鉴定。结果：用Xcm I酶切可见540bp及3810bp双酶切条带，用此载体人模板可扩增出550bp片段，测序结果与预期序列一致。结论:带有两个Xcm I位点的环状载体被成功构建。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnI的cDNA片段，设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体，并导入宿主菌BL21（DE3）中，采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因，重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致，测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

BALB/c小鼠MHCⅠ类基因的克隆与逆转录病毒载体的构建

目的：构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子的逆转录病毒表达载体。研究：用RT－PCR从BALB/c小鼠脾细胞基因组中扩增BALB/c小鼠MHCⅠ类分子H－2Dd的编码基因，克隆于载体pGEM-T中。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，亚克隆于逆转录病毒载体pMSCV，构建pMSCV-H2Dd4重组逆转录病毒表达质粒，并进行酶切和序列测定鉴定。结果：用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定证实，H－2Dd基因正确插入载体pMSCV,H-2Dd的编码基因经序列测定证实，与文献报道完全一致，阅读框架与设计相符。结论：成功构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子编码基因的逆转录病毒载体，为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用奠定了基础。     

分泌型碱性磷酸酶示踪的TA克隆真核表达载体的构建

目的制备具有分泌型碱性磷酸酶示踪作用和真核表达功能的TA克隆载体。方法把CMV启动子区-TA克隆位点-BGH多聚腺苷酸区序列克隆到pSEAP2-control载体中,构建成具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶（SEAP）的pcDNA5AP-前T载体。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因克隆到pcDNA5AP-T载体上并进行EGFP表达分析和SEAP活性检测。结果 pcDNA5AP-EGFP以400ng/孔转染6孔板293T细胞,EGFP表达率达50%,SEAP活性比对照组高20倍。结论成功构建了具有真核表达功能并外分泌碱性磷酸酶的pcDNA5AP-T载体。     

苦瓜MAP30基因的克隆与载体构建

目的对苦瓜中MAP30基因进行克隆,并采用基因工程手段构建植物表达载体。方法从苦瓜中提取基因组DNA,根据Genbank中已公开发表的MAP30序列,设计1ST-S、1ST-A、2nd-A 3个引物,并添加了SEKDEL序列、Kozak序列和组氨酸标签,采用PCR技术,从苦瓜的基因组DNA中扩增出一分子量在800~1 000 bp之间的片段,回收克隆测序。结果克隆获得片段与已公开发表的MAP30序列同源性达100%,对PCR检测阳性的质粒进行测序分析,目的基因已成功连接到pBI121载体上,构建成植物表达载体。结论成功构建MAP30基因植物表达载体,为将MAP30基因转入番茄、烟叶中,进一步大量获得MAP30奠定基础。     

血小板衍化内皮细胞生长因子原核表达载体的构建

目的 构建血小板衍化内皮细胞生长因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）的原核表达载体。方法 设计引物扩增ＰＤ－ＥＣＧＦ的ｃＤＮＡ,然后亚克隆入原核表达载体ｐＱＥ和ｐＱＥ－３２ａ,并转化入大肠杆菌ＪＭ１０９。结果 通过菌落原位杂交、ＰＣＲ和重组质粒酶切分析等方法,筛选出重组阳性克隆。结论 此重组质粒可用于原核表达等进一步研究。dir     

用pBluescript SK（＋）质粒自制T—A载体对DD RT—PCR产物进行克隆

ｍＲＮＡ差异显示技术可以显示ｍＲＮＡ表达水平的差异。为了对用ｍＲＮＡ差异显示技术得到的差异条带进行研究，该文用改良碱裂解法抽提ＰＢＳ质粒，用ＥＣＯＲ Ｖ将ＰＢＳ切成平头，ａｑ ＤＮＡ聚合酶的非模板依赖性，在ｄＴＴＰ存在的条件下，用切成平头的ＰＢＳ质粒自制了Ｔ－Ａ克隆载体，对用ｍＲＮＡ差异显示方法得到了差异条带进行了重组结果表明：用自制Ｔ－Ａ克隆载体对ＰＣＲ产物进行克隆的连接率较高，自制Ｔ－Ａ载体进     

maspin/PCR2.1表达载体的构建及意义

目的:构建maspin/PCR2.1表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法:PCR扩增maspin基因全长,将表达载体PCR2.1用Hind111 XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到人肝癌高转移细胞株MHCC-97中进行表达,检测转染前后maspin表达的变化.结果:重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增;提纯、纯化后,用HindⅢ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到PCR2.1表达载体,并在人肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达.结论:成功构建了maspin/PCR2.1表达载体,能在真核细胞中.     

人IL-18基因真核表达载体的构建

目的:通过克隆人的Interleukin-18基因,构建Interleukin-18基因的哺乳动物细胞真核表达载体。方法:把人基因组DNA通过PCR获得Interleukin-18,克隆载体pMD18-T/Interleukin-18,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行重组真核表达载体pCDNA3.1/Interleukin-18的构建和鉴定。结果:以人总DNA为模板扩增出580 bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除两个碱基外,其余的完全一致,翻译成的氨基酸序列相同。对重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论:重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18由真核载体pCDNA3.1和Interleukin-18片段组成。且插入的Interleukin-18片段与已知序列完全相同。     

大鼠pEGFP-C3／BMP-2真核表达载体的构建

目的通过克隆大鼠的BMP2基因,构建EGFP—C3／BMP2基因的真核细胞表达载体。方法把大鼠的基因组DNA通过PCR获得BMP2,克隆构建载体pEGFP／C3－BMP2,并将其转化到大肠杆菌里面,最后进行重组真核表达载体pEGFP—C3-BMP2的构建和鉴定,并可观察其在真核细胞中的表达。结果以大鼠总DNA为模板扩增出1200bp左右的特异性条带,测序结果与Gene—Bank测序结果相比,翻译成的氨基酸序列相同并完全一致．并可在真核细胞中表达。对重组质粒pEGFP—C3／BMP2进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论为进一步研究利用BMP2基因修饰骨组织工程骨,促进骨折愈合再生提供实验基础。     

抗腮腺炎病毒抗体Fab段基因的克隆及重组表达载体的构建

目的　构建抗腮腺炎病毒抗体Fab段基因重组表达载体。方法　从腮腺炎患者和腮腺炎抗体IgG阳性正常人群的淋巴细胞中提取总RNA ,逆转录成cDNA。用相应的引物进行PCR ,扩增出轻链和重链Fd段基因 ,经酶切后分别和噬粒载体pComb3连接 ,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1 blue菌株 ,将轻链和重链Fd基因先后克隆入pComb3中。结果　从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约 1 1 0 μg ,经逆转录、PCR ,分别扩增出约 70 0bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接 ,在 2 5kv,2 0 0Ω ,2 5 μF的条件下电转化 ,最终转化率为 :2 4 8× 1 0 7。随机挑取电转化后的 1 0个菌落 ,经PCR鉴定 ,共有 5个克隆同时含有轻链和重链Fd基因 ,抗体Fab的重组率为 5 0 %。结论　获得的抗体Fab重组表达载体是高效、实用的 ,为下一步构建抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库打下基础     

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)新型突变体克隆载体的构建

目的构建含有K10Q、R30I、S165W及K10Q/R30I/S165W4种t PA突变体。方法采用PCR重叠延伸法进行突变体的构建。结果成功地构建了上述4种t PA突变体克隆质粒 ,测序结果表明构建完全正确。结论PCR重叠延伸法为构建突变体的可靠快捷的方法。     

葡萄糖苷酶Ⅰ特异性siRNA-EGFP真核表达载体的构建及表达

目的:构建葡萄糖苷酶Ⅰ(glucosidaseⅠ, GluⅠ)特异性siRNA真核表达载体。方法:根据 siRNA靶序列选取原则,设计并合成针对鼠葡萄糖苷酶ⅠcDNA的寡聚DNA,退火并连接至载体 pSilencer1.0 U6,再将 U6 启动子及下游插入片断一起切下,克隆至真核表达载体 pEGFP C1,通过限制性酶切和测序对重组表达载体进行鉴定,最后将该质粒转染至HeLa细胞,共聚焦荧光显微镜观察其表达。结果:①限制性酶切和测序结果表明成功构建了带有EGFP基因的鼠GluⅠ特异性的siRNA真核表达载体 pC 1U6glu; ②共聚焦荧光显微镜观察结果表明p C1U6glu成功转染至HeLa细胞。结论:pC 1U6glu的成功构建及表达为进一步利用 siRNA研究葡萄糖苷酶Ⅰ的功能和治疗肿瘤奠定基础。     

pCDM8-GFP报告载体的构建及鉴定

1　实验资料　ｐＤＭ 8 ＰＢＬｃＤＮＡ文库由Ｊａｃｋｓｏｎ博士惠赠 ,ｐＥＧＦＰ Ｎ3真核表达载体购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司 .ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄⅢ和Ｔ4ＤＮＡ连接酶购自大连宝生物公司 .ＣＯＳ7细胞为本室冻存。ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载体的构建方法参照文献 .提取 ｐＣＤＭ8 Ｘ(Ｘ表示载体中插入的未知ｃＤＮＡ片段 )和 ｐＥＧＦＰ Ｎ3质粒 ,分别用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ进行双酶切 ,回收酶切片段 ,用Ｔ4连接酶进行连接 ,转化感受态宿主菌。挑单菌落培养 ,提取质粒用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切进行阳性克隆鉴定 .提取重组ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载…     

利用Adeasy-1系统构建npcl基因非复制型腺病毒载体并鉴定

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,细菌内同源重组法构建有npcl基因的腺病毒载体.方法利用限制性内切酶kpnl HindⅢ从带有朊病毒启动子的质粒prp-pro-mlpcl中切下目的基因npcl-1,克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV,再与PAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,经抗性筛选和酶切鉴定的质粒再利用脂质体转染人293例细胞中扩增,利用Adeasy-1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒,RT-PCR鉴定目的基因的表达.结果切酶切鉴定,正确的目的基因片断已克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV;卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论利用腺病毒载体系统Adeasy-1可构建能成功表达Pac Ⅰ基因的腺病毒载体,为对Niemann pick' s病C型的进一步研究提供了条件.     

果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体cDNA克隆及其载体的构建

目的克隆果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体(FGFR-1)全长基因序列,构建其真核表达载体pdFR1。方法采用PCR方法扩增果蝇FGFR-1基因全长序列,克隆人载体pT—Adv,转化大肠杆菌XL1-Blue,挑选白色菌落行酶切鉴定及测序。重组质粒pT—Adv／FGFR-1酶切,回收目的基因片段,将其克隆人真核表达载体pcDNA3．1( )中,命名为pdFR1,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pT-Adv／FGFR-1测序结果与GenBank完全一致,pdFR1行限制性内切酶酶切,酶切片段与预期值相符。结论克隆了果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体全长基因序列,构建了其真核表达载体pdFR1,为完善异种分子疫苗免疫理论莫定基础。     

c—erbB—2特异性核酶基因体外转录载体的构建与快速鉴定

构建ｃ－ｅｒｂＢ－２特异性的核酶基因及其靶基因的体外转录载体并探讨快速简便的筛选方法；在原设计的核酶ＲＺ１基因的３‘端加上新的限制性酶切位点ＥｃｐＲＶ，合成修饰后的ＲＺ１基因并将之定向克隆于载体ｐＧＥＭ３Ｚｆ，经用ＥｃｏＲＶ正筛选和ＸｂａＩ负筛选鉴定出重组子并测定鉴定。