人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

人纤溶酶真核表达重组质粒的构建

目的：构建人纤溶酶真核表达载体以用于抗栓、溶栓的研究。方法：人胎肝组织经PCR技术扩增人纤溶酶基因,定向克隆至真核表达质粒pC-DNA-3后测序。经测序鉴定正确后构建人纤溶酶真核表达重组质粒,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒的正确性。结果：目的基因 PCR扩增产物为1 740 bp,测序结果显示,目的基因PCR扩增产物与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的人纤溶
酶基因全长序列。结论：成功构建了含有人纤溶酶基因的真核表达重组质粒,并进行了鉴定。     

醛缩酶B基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建含ALDOB基因的重组PCMV5质粒并进行鉴定.方法 以人HEPG2细胞RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出ALDOB基因.将PCR产物克隆进真核载体PCMV5内,构建含ALDOB基因的重组真核表达质粒.重组质粒转染293T细胞,用免疫荧光和Western blot等方法检测ALDOB在293T细胞中的表达.结果 核酸序列分析的结果表明,克隆的ALDOB基因与GenBank中已登记ALDOB基因序列 100%同源.免疫荧光结果显示,ALDOB蛋白在细胞质表达;Western blot结果显示,在约40KD位置有目的 条带,与预期的重组ALDOB 蛋白大小一致.结论 成功构建了含ALDOB基因的真核表达质粒.     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3．0,并转入DH5ct宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA—MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA—MIC3．     

t-PA基因克隆及pcDNA3.1t-PA真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1t-PA质粒载体.方法采用高效Trizol试剂快速从人肺组织中提取RNA,RT-PCR获得t-PA cDNA,扩增、纯化、回收t-PA基因片段并将质粒pcDNA3.1和t-PA基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收1.9kb片段,再将回收的pcDNA3.1大片段与t-PA基因片段(1.9kb)重组.对重组pcDNA3.1t-PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定,并测序.结果成功地从胎儿肺组织中克隆了t-PA基因,并构建了以pcDNA3.1为载体的真核表达质粒载体.结论含t-PA基因新型表达质粒构建的成功将为基因防治血管重建术中局部血栓形成奠定基础.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

人穿孔素真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:观察克隆的人穿孔素(pfn)基因在COS-7细胞中的表达情况. 方法:用PCR方法获取人pfn全长基因,将所获基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1( ),转染COS-7细胞,RT-PCR检测pfn基因在COS-7细胞中的表达. 结果:成功获得人pfn全长基因,并构建了真核表达载体.转染COS-7后,检测出pfn基因的表达. 结论:人pfn全长基因可以在转染的COS-7细胞中表达.     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...     

pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP真核表达质粒构建

目的:构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP与pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒,并观察pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒在MCF-7和Bcap-37细胞中的表达。方法:①采用RT-PCR技术扩增CYP19 cDNA,插入pcDNA3.1(+)载体中,构建pcDNA3.1(+)-CYP19表达质粒;酶切pcDNA3.1(+)-CYP19(304bp BamHⅠ)-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19质粒,构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP表达质粒;②以pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒为模板,采用定点突变技术,构建pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP表达质粒;③pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒通过脂质体介导转染MCF-7和Bcap-37细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的表达。...     

重组人白介素27真核表达载体的构建

目的克隆人IL-27基因,构建其真核表达载体。方法从人外周血单核细胞诱导而成的树突状细胞中提取总RNA,采用RT-PCR克隆人IL-27亚基EBI3和p28基因,Xho I和EcoR I双酶切后插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建人IL-27真核表达载体pcDNA3.1-EBI3和pcDNA3.1-p28。结果双酶切及测序结果表明构建载体中的EBI3与p28序列与文献报道一致。结论重组人IL-27真核表达载体的构建成功,为表达出有活性的重组人IL-27奠定了基础。     

靶向大鼠gnas基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向大鼠gnas基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体.方法:根据大鼠gnas基因mRNA序列设计并合成3条shRNA特异性寡核苷酸片段,退火形成双链后克隆进入线性化pGenesil-1.1载体,并进行酶切鉴定和测序,同时构建针对大鼠GAPDH基因的阳性对照质粒和不具有基因同源性的非特异性基因的质粒做阴性对照.结果:经酶切和测序鉴定分析,构建的shRNA已成功插入载体,并且与设计序列完全相符.结论:成功构建了靶向大鼠gnas基因的shRNA真核表达载体,为后续研究Gs a 蛋白在心力衰竭中作用的体内外实验奠定了基础.     

人IL-37b基因真核表达载体的构建与表达

目的：构建pEGFP-N1/IL-37b真核表达载体,并检测其在THP-1细胞中的表达情况。方法：从人PBMCs中提取总RNA,利用RT-qPCR技术扩增出IL-37b基因编码区序列,克隆至pEGFP-N1真核表达载体,将构建的重组质粒pEGFP-N1/IL-37b转染到THP-1细胞中,通过RT-qPCR和Western blot检测IL-37的表达。结果：双酶切及基因测序结果显示 IL-37b基因正确插入真核表达载体pEGFP-N1中;RT-qPCR和Western blot结果显示转染THP-1细胞后,IL-37表达水平明显升高（P＜0.01）。结论：成功构建了新型抗炎因子IL-37真核表达载体pEGFP-N1/IL-37b,为进一步研究IL-37功能及与相关疾病的关系奠定基础。     

乙肝基因疫苗系列质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的 构建一系列乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白的真核细胞表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法 采用常规PCR法扩增S、前S2－S、前S1－前S2－S片断,利用重叠PCR法扩增出前S1－S片断后,分别插入Rc/CMV及pSG5UTPL/Flag载体质粒中,并在其ATG起始密码前加入KOZAK序列后转染SP2／0细胞,Western-Blot杂交检测所表达蛋白,并用核酸自动分析仪分析所插入片断的核酸序列。结果 插入片断的核苷酸序列与相应的大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的编码基因一致,Western-Blot杂交检测出了相应的目的蛋白。结论 获得了8个能高效表达乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白和前S1－S蛋白的真核细胞表达质粒。     

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建

目的：构建携带绿色荧光蛋白(GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。方法：应用RT-PCR方法扩增人转化生长因子基因，与GFP真核表达载体连接，构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体，并用限制性内切酶酶切鉴定。结果：构建的新质粒经酶切鉴定和DNA测序，证实新质粒的构建成功。结论：应用RT-PCR方法扩增目的DNA片段，简单快捷；双酶切定向克隆可以保证构建一步到位，免去正反向重组体筛选的问题。     

PSD-95酪氨酸突变体真核表达载体的构建及其表达

目的构建突变型PSD-95的重组表达质粒(Y432F、Y439F、Y523F和Y533F,酪氨酸突变为苯丙氨酸),并在COS-7细胞中表达。方法以野生型PSD-95-pcDNA3.1为模板,采用重叠延伸PCR法获得突变型PSD-95的局部或全长cDNA片段,并克隆至PSD-95-pcDNA3.1或pcDNA3.1载体;以脂质体法将构建好的重组质粒转染COS-7细胞;通过免疫印迹法鉴定PSD-95及其突变体的表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的突变型PSD-95基因完全正确。免疫印迹显示,转染的突变型重组质粒在相对分子质量9.5×104处均有相应条带出现。结论成功构建了4个PSD-95酪氨酸残基突变体的真核表达质粒,重组质粒在COS-7细胞中高效表达。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体的构建

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子bFGF基因真核表达载体,探讨bFGF基因转移治疗视网膜病变的方法.方法:将bFGF和GFP基因克隆到真核表达载体pcDNA3中.结果:酶切及琼脂糖电泳分析 pcFG中含有bFGF和GFP基因.结论:成功的构建了含有绿色荧光蛋白的人碱性成纤维细胞生长因子基因的真核表达载体.