人牙乳头细胞内Smad2在TGF-β1信号转导中作用的研究

目的观察体外原代培养的人牙乳头细胞内Smad2蛋白的表达,以及Smad2蛋白在转化生长因子-β1信号转导中的作用,探讨Smad2信号途径在TGF-β1调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用机制.方法原代培养人牙乳头细胞,Westernblot杂交方法检测内源性Smad2的表达和TGF-β1调控下的表达变化,用免疫组化方法观察Smad2细胞内定位变化.结果培养的人牙乳头细胞表达Smad2蛋白,TGF-β1能引起Smad2从胞浆转位至核内聚集,而BMP-2无此功能;TGF-β1或BMP-2刺激作用6h、12h、24h和48h,牙乳头细胞内Smad2蛋白表达水平未见明显的改变.结论人牙乳头细胞内存在Smad2基因的表达,Smad2能被TGF-β1活化后转位至核内发挥作用,但Smad2基因的表达无明显变化,提示TGF-β1在调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化的过程中,Smad2信号途径可能发挥一定的作用.     

人牙乳头细胞内Smad2在TGF-β_1信号转导中作用的研究

目的　观察体外原代培养的人牙乳头细胞内Smad2蛋白的表达 ,以及Smad2蛋白在转化生长因子 β1信号转导中的作用 ,探讨Smad2信号途径在TGF β1调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用机制。方法　原代培养人牙乳头细胞 ,Westernblot杂交方法检测内源性Smad2的表达和TGF β1调控下的表达变化 ,用免疫组化方法观察Smad2细胞内定位变化。结果　培养的人牙乳头细胞表达Smad2蛋白 ,TGF β1能引起Smad2从胞浆转位至核内聚集 ,而BMP 2无此功能 ;TGF β1或BMP 2刺激作用 6h、12h、2 4h和 48h ,牙乳头细胞内Smad2蛋白表达水平未见明显的改变。结论　人牙乳头细胞内存在Smad2基因的表达 ,Smad2能被TGF β1活化后转位至核内发挥作用 ,但Smad2基因的表达无明显变化 ,提示TGF β1在调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化的过程中 ,Smad2信号途径可能发挥一定的作用。     

BMP2作用下人牙乳头细胞内Smad 1 mRNA表达的变化

目的：观察人牙乳头细胞内Smad1 mRNA的表达及在BMP2作用下，细胞内Smad1 mRNA的表达变化，探讨人牙乳头细胞内Smad1信号途径在BMP2调控牙乳头细胞分化中的作用。方法：原代培养的人牙乳头细胞用BMP2处理后，提取总RNA，采用Northern blot法，从mRNA水平观察Smad1基因的表达及含量变化。结果：从mRNA水平观察到Smad1基因在人牙乳头细胞内的表达，但在BMP2作用6、12、24h后，Smad1 mRNA表达量无显著变化。结论：人牙乳头细胞内存在Smad1信号转导途径，牙乳头细胞内Smad1 mRNA表达量不受BMP2调控。     

骨形成蛋白-2对人牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量的影响

目的：观察人牙乳头细胞内Smad1蛋白的表达及骨形成蛋白－2（bone morphogenetic protein-2,BMP2)对人牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量影响，方法：原代培养的人牙乳头细胞用BMP2处理6h,12h,24h,48h后，提取总蛋白质，采用Western Bolt法，从翻译水平观察Smad1基因的表达变化。结果：从翻译水平观察到Smad1基因在人牙乳头细胞内的表达，但在BMP2作用48h内，Smad1蛋白表达量无显著变化，结论：人牙乳头细胞内存在Smad1信号转导途径，牙乳头细胞内Smad1蛋白表达量不受MBP2影响。     

Smad8在成牙本质细胞系MDPC-23内BMP-2信号转导中的作用

目的：观察成牙本质细胞系MDPC-23内Smad8蛋白的表达,以及Smad8蛋白在骨形成蛋白-2（bonemorphogenetic protein-2,BMP-2）信号转导中的作用.方法：免疫组化法观察MDPC-23细胞内Smad8蛋白的表达,以及BMP-2和转化生长因子β1（TGF-β1）对MDPC-23细胞内Smad8分子定位的改变.结果：MDPC-23细胞的胞浆和胞核均有Smad8表达,在BMP-2刺激1 h后,Smad8从胞浆向胞核转位聚集.TGF-β1刺激后无类似现象发生.结论：成牙本质细胞系MDPC-23内存在Smad8的表达,且Smad8可特异性地将BMP-2的信号由胞浆转至胞核,但不能转导TGF-β1信号.     

人牙乳头细胞内Smad5蛋白表达的免疫组化研究

目的：观察Smad5蛋白在体外原代培养的人牙乳头细胞内的表达及其在转化生长因子－β超家族信号转导中的作用。方法：原代培养的人牙乳头细胞，分别以骨形成蛋白－2（bone morphogenetic protein-2,BMP－2）和转化生长因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）刺激，免疫组化检测Smad5的表达，图像分析仪半定量。结果：人牙乳头细胞（空白对照组）胞浆内可见Smad5阳性表达，胞核内未见阳性表达；BMP－2实验组胞核内Smad5强阳性表达，胞浆内为弱阳性表达；TGF－β1实验组细胞胞浆Smad5阳性，胞核未见表达。结论：人牙乳头细胞内存在Smad5的表达，Smad5能转导BMP－2信号至核内发挥作用，但不能TGF－β1信号，提示BMP－2在牙齿发育过程中信号传递可能是通过Smad5的信号途径实现的。     

MDPC-23细胞内Smad信号途径在转化生长因子β1调控Smad7基因转录中的作用

目的：研究成牙本质细胞系MDPC-23内Smad信号途径在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)调控Smad7基因转录调控中的作用，从基因转录水平探讨成牙本质细胞内TGF-β调控Smad7基因表达的分子机制。方法：培养MDPC-23细胞，通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad蛋白分子对Smad7启动子活性的影响，实验数据采用单因素方差分析。结果：当Smad7启动子(-408bp至 112bp)荧光素酶活性载体表达在MDPC-23细胞时，其基础启动子活性被TGF-β1显著诱导增加，而骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)对其活性无明显影响。单独过表达Smad1、2、4、5对Smad7启动子活性无明显影响。Smad3过表达显著增强Smad7启动子活性，而Smad3与Smad4共转染进一步增强了Smad3的作用。过表达Smad3突变型载体或Smad3反义cDNA(AS-Smad3)均显著抑制TGF-β1对Smad7启动子活性的诱导作用。结论：在成牙本质细胞系MDPC-23内，TGF-β通过Smad3与Smad4协同调控Smad7基因转录。     

MDPG-23细胞内Smad信号途径在转化生长因子β1调控Smad7基因转录中的作用

目的研究成牙本质细胞系MDPC-23内Smad信号途径在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)调控Smad7基因转录调控中的作用,从基因转录水平探讨成牙本质细胞内TGF-β调控Smad7基因表达的分子机制.方法培养MDPC-23细胞,通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad蛋白分子对Smad7启动子活性的影响,实验数据采用单因素方差分析.结果当Smad7启动子(-408 bp至+112bp)荧光素酶活性载体表达在MDPC-23细胞时,其基础启动子活性被TGF-β1显著诱导增加,而骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对其活性无明显影响.单独过表达Smad1、2、4、5对Smad7启动子活性无明显影响.Smad3过表达显著增强Smad7启动子活性,而Smad3与Smad4共转染进一步增强了Smad3的作用.过表达Smad3突变型载体或Smad3反义cDNA(AS-Smad3)均显著抑制TGF-β1对Smad7启动子活性的诱导作用.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,TGF-β通过Smad3与Smad4协同调控Smad7基因转录.     

人牙乳头细胞内Smad4表达的免疫组化研究

观察转化生长因子－β超家族的细胞内信号转导分子Ｓｍａｄ４在人牙乳头细胞内的表达及信号转位过程,从细胞内信号转导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法：原代培养人牙乳头细胞,用转化生长因子－β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｎｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β１,ＴＧＦ－β１）和骨形成蛋白－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｎｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ,ｒｈＢＭＰ－２）刺激培养     

Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23中的表达及功能

目的研究Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23作为转化生长因子(TGF)β信号分子的作用。方法常规条件下培养MDPC-23细胞,在TGF-β1刺激培养1h后,观察细胞内Smad分子的定位变化。将Smads真核表达载体分别与报告基因载体p3TP-Lux瞬时共转染至MDPC-23,在TGF-β1刺激培养24h后,裂解细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞裂解液中的荧光素酶活性。结果MDPC-23细胞表达Smad2和Smad3蛋白分子,主要定位于细胞质,在TGF-β1刺激1h后,Smad2和Smad3从胞质向胞核转位聚集。TGF-β1可诱导p3TP-Lux基础启动子活性,约增加13倍。过表达野生型Smad3蛋白可促进TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,但是过表达Smad3突变体抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导。和Smad3作用相比,过表达Smad2野生型或突变型蛋白对TGF-β1诱导p3TP-Lux启动子活性无明显影响。结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad信号途径存在并参与介导TGF-β1诱导的转录调控。     

Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子β信号转导中的作用

目的研究Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子(transforming growth factor-β1, TGF-β)信号转导的作用.方法培养MDPC-23细胞,免疫组化法观察TGF-β1对MDPC-23细胞内Smad7分子定位改变.通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad7分子对TGF-β1调控目的基因转录的影响.结果MDPC-23细胞表达Smad7蛋白,主要定位于细胞胞浆,在转化生长因子β1刺激30 min后,Smad7从胞核向胞浆转位聚集.TGF-β1显著诱导p3TP-Lux基础启动子活性.过表达Smad7完全抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,而过表达Smad7反义cDNA载体则显著促进了TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad7可能作为一种抑制性Smad分子在拮抗TGF-β1信号转导过程中发挥重要的作用.     

Smad4基因在人牙乳头细胞内的表达及其意义的探讨

目的：观察转化生长因子－β超家族特异的细胞内信号转导基因Ｓｍａｄ４在人牙乳头细胞内的表达,及其在转化生长因子－β１１（ＴＧＦ－β１）的骨形成蛋白－２（ＢＭＰ－２）作用下的变化,从细胞内信号转导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法：原代培养人牙乳头细胞,用ＴＧＦ－β１和ＢＭＰ－２刺激培养的细胞,分别从刺激前后的细胞中提取总ＲＮＡ和总蛋白,采用Ｎｌｒｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交方法     

人牙髓细胞内Smad 2、3在转化生长因子β1信号转导中的作用

目的：探讨人牙髓细胞内Smad 2、3在转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号转导过程中的作用。方法：原代培养人牙髓细胞，用激光共聚焦显微镜观察TGF－β1刺激初期牙髓细胞内Smad 2、3由胞质向胞核转位的现象，同时采用Western blot方法检测刺激后期Smad 2、3蛋白表达的变化。结果：TGF－β1刺激2h内，Smad2、3在胞质中表达渐弱，在胞核内表达渐强，呈现由胞质向胞核逐步转位的趋势。Smad 2蛋白总量在TGF－β1刺激前后几乎无变化，而Smad 3在刺激后24h表达量明显下降，48h后表达十分微弱。结论：Smad 2、3可能是人牙髓细胞内TGF－β1的信号转导分子。TGF－β1刺激初期Smad 2、3通过发生转位参与转导TGF－β1信号至核内，刺激后期Smad 3表达水平的下调可能与TGF－β1负反馈调节自身的信号有关。     

人牙乳头细胞Smad1基因MH2结构域的cDNA的分子克隆

目的：从人牙乳头细胞内克隆骨形成蛋白（BMP）细胞内信号转导基因Smad1的功能性结构域－－MH2结构域。方法：原代培养人牙乳头细胞,从培养的细胞中提取总DNA,逆转录合成cDNA第1条链;设计上下游引物,进行RT－PCR,扩增Smad1基因MH2结构域的基因片段;将所获得的基因片段定向插入PUC19载体;转化大肠杆菌JM109,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。结果：获得的Smad1 MH2结构域的cDAN片段大小为444bp,并且成功构建PUC19／MH2重组质粒。结论：人牙乳头细胞内存在Smad1信号转导途径,BMP调控人牙乳头细胞分化可能是通过Smad1信号途径实现的。     

rhBMP_2作用下人牙乳头细胞内Smad1分子的转位变化

目的:观察骨形成蛋白(bone morphogenetic protein)特异的细胞内信号转导分子Smadl在人牙乳头细胞内的表达及信号转位过程,从细胞内信号转导水平探讨牙齿发育过程中成牙本质细胞的分化机制。方法:原代培养人牙乳头细胞,用转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和重组人骨形成蛋白骨形成蛋白2(recombinant hu-man bone morphogenetic protein,rhBMP2)刺激培养的细胞,对照组用0.2％FCS的DMEM的培养液培养,不加任何刺激。免疫组化观察。结果: TGF-β1和rhBMP2刺激组均可见Smadl蛋白表达,但与对照组相比无明显差异;rhBMP2组可见Smadl从胞浆转位至核内聚集,TGF-β1组未见此作用。结论:首次观察到Smadl基因在人牙乳头细胞内的表达并参与信号转位过程,提示BMP2在牙乳头细胞内信号传递可能是通过Smadl转位至核内引起基因表达实现的。     

Smad3在转化生长因子β1调控人牙本质基质蛋白1基因表达中的作用

目的：观察Smad3在转化生长因子β1（TGF-β1）调控人牙本质基质蛋白1（DMP1）转录表达中的作用并对DMP1基因启动子上的结合位点进行初步定位。方法：将Smad3瞬时转染至具有矿化活性的人牙髓干细胞（HDPSC）中,观察Smad3蛋白表达和转位情况,并检测在有无TGF-β1的刺激下细胞中pGL3-P-193～＋86和pGL3-P-505～＋86启动子活性的变化。pGL3-P-505～＋86与Smad3共转染至细胞中,10ng/ml TGF-β1刺激2h后,提取细胞核蛋白,EMSA法检测DMP1基因启动子-505～-193bp区存在的Smad3结合位点。结果：HDPSC中瞬时转染Smad3后,其主要表达于细胞胞浆中,随着TGF-β1刺激不同时间后,Smad3在细胞中的表达出现从胞浆到胞核的转位。Smad3可明显加强TGF-β1下调pGL3-P-193～＋86和pGL3-P-505～＋86启动子活性的作用,在DMP1基因启动子-505～-193bp区至少有一个Smad3结合区域为-209～-201bp区的GTCTAGTCA序列。结论：Smad3是TGF-β1信号通路的下游作用分子,可介导TGF-β1下调D...     

转化生长因子β1和骨形成蛋白2体外诱导成牙本质细胞分化

目的 观察转化生长因子β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）和骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein2,BMP2)对体外培养的鼠牙乳头成牙本质细胞分化的影响。方法 取17d胎龄小鼠下颌第一磨牙牙胚，胰蛋白酶消化分离牙乳头，置半固态培养基培养6d，半固态培养基中加入重组TGF-β1或BMP2与肝素，组织学观察。结果 TGF-β1或BMP2加肝素可诱导牙乳头周边细胞发生极化，并分泌胞外基质。TGF-β1或BMP2单独加入时未见细胞极化，但基质分泌增加。结论 TGF-β1和BMP2均能诱导成牙本质细胞的细胞学分化和分泌功能。     

TGF-β1/Smad3信号途径对牙本质涎磷蛋白基因表达的调控

目的：研究小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中TGF-β1及其信号分子Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白（dentinsialophosphoprotein，DSPP）基因表达中的调控作用。方法：PCR法制备DSPP引物、构建带有DSPP启动子片段的萤火虫荧光素酶基因报告载体，通过瞬时转染入MDPC-23细胞后，检测报告基因活性。结果：在TGF-β1的作用下，Smad3可以发生转位表达，由细胞浆转入细胞核内。同时，过表达野生型Smad3可以显著增强TGF-β1对DSPP启动子活性的下调作用。结论：TGF-β1可以通过Smad3信号通路对DSPP启动子进行调控；在DSPP启动子-2525-＋54bp之间，存在TGF-β1／Smad3信号途径的结合位点，从而发挥对DSPP基因的调控作用。     

Smad在牙本质涎磷蛋白基因表达中的作用

目的：研究Smad蛋白在牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因表达中的作用。方法：细胞培养,瞬时转染和报告基因检测。结果：转化生长因子β1(transforning growth factor-β1,TGF-β1)抑制DSPP基因启动子活性。过表达野生型Smad3蛋白显著增强了TGF-β1对DSPP基因表达的转录抑制,而过表达Smad3突变型蛋白则显著抑制了TGF-β1对DSPP基因启动子活性的影响。过表达Smad2野生型或突变型蛋白对TGF-β1抑制DSPP基因启动子活性无明显影响。结论：Smad3在介导TGF-b1对DSPP基因的转录调控中发挥重要的作用.     

转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形成蛋白2(BMP2)体外联合诱导成牙本质细胞样细胞分化

目的：观察转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）和骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）联合应用对体外培养的鼠牙乳头成牙本质细胞分化的影响。方法：取17d胎龄小鼠下颌第一磨牙牙胚,胰蛋白酶消化分离牙乳头,置半固态培养基培养6d,半固态培养基中单独加入重组TGFβ1、BMP2,或分别与肝素联合,或TGFβ1和BMP2联合,组织学观察牙乳头的形态学变化。结果：TGF-β1或BMP2单独加入时未见细胞极化,但基质分泌增加。TGF-β1或BMP2加肝素可诱导牙乳头周边细胞发生极化,并分泌胞外基质。半固态培养基中同时加入TGF-β1和BMP2的牙乳头培养6d后,牙乳头周边细胞出现极化和功能性分化,牙乳头周边胞外基质沉积明显,且可见牙乳头尖形态的维持及从牙乳头尖至牙乳头基底部成牙本质细胞分化梯度的维持。结论：本研究结果证实,在没有内釉上皮和完整的基底膜存在的情况下,TGF-β1和BMP2加肝素可诱导培养的牙乳头出现成牙本质细胞分化,并促进胞外基质的分泌。TGF-β1和BMP2均能诱导成牙本质细胞的细胞学分化和分泌功能,二者联合应用可协同发挥作用增强诱导效果。