染矽尘大鼠早期肺组织差异基因表达谱的研究

目的 研究染矽尘大鼠早期肺组织与正常肺组织的差异基因表达谱.方法 应用气管暴露法建立雄性Wistar大鼠染矽尘模型和对照组,每组3只,应用Illumina激光共聚焦光纤微珠基因芯片技术,研究建模后14 d时的大鼠肺组织差异基因表达谱,并采用DAVID生物信息学分析工具,进行Fisher精确概率检验,对差异基因的基因功能和生物学通路进行富集统计学分析.结果 检测出的有效基因共22 107个,筛选出染矽尘组与对照组的差异基因共1567个,其中上调基因为765个,下调基因为802个.在KEGG生物学通路数据库中,共406个差异基因获得注释,上调基因为204个,其中11个生物学通路相关基因显著上调;下调的基因有202个,其中3个生物学通路相关基因显著下调.Real-time PCR实验验证了血红素加氧酶1(HMOXl)、超氧化物歧化酶2(SOD2)基因上调的趋势和基因芯片结果是一致的.结论 本次实验筛选出了染矽尘早期大鼠肺组织差异基因,提示矽尘致肺纤维化过程中可能存在相互作用的基因簇.     

染矽尘大鼠早期肺组织病理变化观察

目的探讨大鼠染矽尘早期肺组织病理改变。方法 Wistar大鼠随机分为对照组和15、30、60mg/ml染矽尘实验组,每组42只。一次性气管内注入染尘建立大鼠矽肺模型,每组分6个时间点(1、3、7、14、21、28d)分别取7只大鼠处死,取肺脏称重,福尔马林固定,石蜡包埋,HE染色,普通光镜下观察肺组织病理变化。结果各剂量染尘大鼠各时间点肺组织脏器系数均高于对照组(P<0.05),且随时间延长和染尘剂量增加其增高幅度增大(P<0.05);肺组织肉眼观察可见,随着染尘时间的延长,肺表面逐渐出现颜色变深、体积增大、不规则斑块增多、弹性减弱等症状;HE染色显示,大鼠染尘后28d内,肺组织以炎症反应为主伴发肺间质的弥漫性纤维化。实验大鼠炎症反应程度随染尘剂量的增加加重,在染尘后7～14d肺组织的炎症反应比较明显。肺间质纤维化程度随实验时间的延长及染尘剂量的增加有逐渐加重的趋势。结论矽肺早期炎症反应明显,主要表现为细胞浸润聚集,肺泡间隔增厚,纤维组织增生,肺泡正常组织发生改变。     

染矽尘大鼠肺组织一氧化氮合酶的表达

目的　研究染矽尘大鼠早期炎性肺损伤过程中一氧化氮合酶 (NOS)的表达规律 ,为矽肺纤维化机制提供理论依据。方法　气管暴露法建立矽肺动物模型。测定支气管肺泡灌洗液 (BALF)中诱导型NOS(iNOS)的表达和总NOS的活力。在组织芯片上使用SP法检测大鼠肺组织iNOS的表达 ,并用Image ProPlus图像分析法对iNOS的表达进行定量测定。结果　iNOS主要表达在巨噬细胞和中性粒细胞胞浆内。与对照组相比 ,染矽尘大鼠肺组织中iNOS积分光密度于染尘后 3、7d时分别增加了1.47× 10 5 、2 .73× 10 5 ,2 8d时降低了 1.11× 10 5 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。大鼠BALF中iNOS活力在染尘后 3、7、14d时分别增加了 0 .86、1.89、0 .92U/ml ,差异均有显著性 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。BALF总NOS活力在染尘后 1、3、7、14d时分别增加了 1.43、2 .0 5、2 .61、2 .19U/ml,差异均有显著性 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。结论　在矽尘诱导下 ,大鼠肺组织中表达iNOS的细胞主要是肺泡巨噬细胞和中性粒细胞 ,其肺组织中iNOS的表达从染尘后 1d至 2 8d有一抛物线型的过程     

牛磺酸对染矽尘大鼠肺组织一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨饮食中添加牛磺酸对染矽尘大鼠肺组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的作用。方法采用气管暴露法建立矽肺动物模型，部分动物在饲料中添加牛磺酸(牛磺酸组)；高效液相色谱法测定动物血浆中牛磺酸含量。链霉抗生物素蛋白一过氧化物酶法(SP法)结合组织芯片技术检测矽肺动物模型的肺组织iNOS的表达，用Image-Pro Plus图像分析系统对iNOS定量分析。结果牛磺酸组大鼠各时间点血浆中牛磺酸含量高于对照组和染矽尘组，差异均有统计学意义(P＜0．05)。染矽尘组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中总NOS活力、iNOS活力和肺组织iNOS阳性面积百分比都在染尘后第14天左右达高峰，分别比对照组增加1．84u／ml、1．12u／ml和5．42％，差异均有统计学意义(P＜0．05)。牛磺酸组与染矽尘组相比，BALF总NOS活力、iNOS活力和肺组织iNOS阳性面积百分比差异均无统计学意义(P＞0．05)。结论牛磺酸对矽尘所诱导的大鼠肺组织iNOS蛋白表达的增加未见明显影响。     

牛磺酸对染矽尘大鼠肺组织炎性细胞影响

目的 探讨牛磺酸对染矽尘大鼠肺组织炎性细胞趋化的影响.方法 Wistar大鼠144只,随机分为对照组、染矽尘组和牛磺酸组,后2组气管内注入质量浓度为50 g/L的矽尘混悬液,牛磺酸组在实验开始前3d即给予含质量分数为2.5％的牛磺酸饲料持续喂养,对照组气管内注入等体积灭菌生理氯化钠溶液.偏振光显微镜观察肺纤维化发生情况,行在体全肺灌洗术,血细胞计数仪测定支气管肺泡灌洗液细胞数.结果 牛磺酸组第7、14、21和28天炎性细胞总数均低于染矽尘组,差异有统计学意义(P＜0.05).牛磺酸组第14、21天巨噬细胞数低于染矽尘组,差异有统计学意义(P＜0.05).牛磺酸组第21天中性粒细胞数低于染矽尘组,差异有统计学意义(P＜0.05).牛磺酸组第14、21天淋巴细胞数均低于染矽尘组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 牛磺酸对矽尘诱导大鼠肺组织巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的趋化具有抑制作用.     

染矽尘大鼠早期肺组织肿瘤坏死因子的表达

目的采用组织芯片和图像分析技术阐述染矽尘大鼠早期肺组织炎性损伤过程中肿瘤坏死因子-α(TNFα)表达的变化规律。方法采用气管暴露法建立矽肺动物模型。免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP)结合组织芯片技术检测肺组织TNFα的表达。用ImageProPlusVersion4.5forWindowsTM图像分析系统对TNFα的表达做定量分析。结果染矽尘组TNFα阳性细胞面积百分比于染尘后第3天时开始升高,一直持续到第14天,第21天后稍有回落。第7天时达高峰,染矽尘组阳性面积百分比较对照组高出6.57,差异有显著性(P<0.01)。结论矽尘可诱导大鼠肺组织炎性损伤早期TNFα的过度表达。     

甲亢肝阳上亢证大鼠肾上腺组织蛋白质组的双向电泳分析

目的观察甲亢肝阳上亢证大鼠与正常大鼠肾上腺中蛋白质的差异表达，以期发现诊断甲亢肝阳上亢证的标志物，为进一步探讨甲亢肝阳上亢证的分子机制提供依据。方法左旋甲状腺素（L-T4）和附子汤灌胃造成甲亢肝阳上亢证模型，应用蛋白质组学技术比较模型组与正常组中肾上腺的差异蛋白质，结合生物信息学对其进行分析鉴定。结果模型组与正常组相比有33个蛋白质上升和6个蛋白质下降，进一步质谱鉴定，其中6个蛋白质为GrpE蛋白同系物1、60kDa热休克蛋白、脂酰辅酶A脱氢酶、钙网织蛋白前体、醛脱氢酶、异戊酰辅酶A脱氢酶。结论甲亢肝阳上亢证大鼠肾上腺中具有特异表达的蛋白质，经质谱鉴定后发现，其蛋白质的变化可能与甲亢肝阳上亢证的形成密切相关。     

染矽尘大鼠肺组织热应激蛋白HSP70的分布—免疫组织化学研究

采用免疫组织化学方法对染矽尘大鼠肺组织热激蛋白ＨＳＰ７０的分布进行了研究，结果染矽尘大鼠肺组织ＨＳＰ７０着色明显增多，着色细胞主要是巨噬细胞，矽尘作用下ＨＳＰ７０的增加很可能是巨噬细胞的一种自我保护机制，提高巨噬细胞热应激蛋白的表达可能为保护巨噬细胞，预防矽肺的发生发展提供一条新的途径。     

结核肺组织与正常肺组织蛋白质组双向电泳图谱的差异分析

目的对结核肺组织与正常肺组织双向电泳图谱进行比较分析,筛选差异表达蛋白质。方法利用双向电泳分离结核组及正常组总蛋白质,并通过计算机图像分析软件分析电泳图谱。结果在结核肺组织中检测有效蛋白点数为(190±11)个,正常肺组织中检测有效蛋白点数为(179±5)个。发现两者间共有15个差异蛋白点,蛋白点分子量(Mr)主要分布于15kD～80kD,PI为3～10。4个点在病灶组织中表达上调,11个点在病灶组织中表达下调。结论通过双向凝胶电泳和图像分析技术对结核肺组织及正常肺组织蛋白质组进行研究,获得了结核组与正常组的差异蛋白点,为进一步利用质谱分析技术做差异蛋白质鉴定奠定了基础,并为肺结核的早期诊断、发病机制探索、病情监测提供依据。     

染矽尘大鼠肺组织不同时间点FasL表达与细胞凋亡

目的探讨染矽尘大鼠肺组织FasL表达及细胞凋亡在矽肺病理变化中的意义。方法将96只Wistar大鼠随机分为对照组和染矽尘组。对染矽尘组以暴露式气管内一次注入二氧化硅粉尘悬液(1 ml,0．2 g/kg)建立大鼠矽肺模型,对照组气管内注入1 ml灭菌生理盐水。分别于处理后1、3、7、14、21和28 d,每组分别取8只大鼠处死取肺组织,用组织芯片技术结合免疫组化SP法检测大鼠肺组织不同时间点FasL的表达;末端脱氨核苷酸转移酶末端标记技术(TUNEL)法检测大鼠肺组织细胞凋亡,并采用Image-Pro Plus Version 4．5 for windowsTM图像分析计算积分光密度。结果染矽尘组大鼠肺组织FasL在染矽尘后的7、14、21和28 d时,表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0．05),14 d时表达最高为157．50±23．12;染矽尘组大鼠肺组织凋亡阳性细胞在染矽尘后的1、3、7、14、21和28 d时,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0．05),7和14d,分别最高为32．95±20．40和31．07±7．15。结论矽尘能导致肺组织细胞凋亡;FasL在染矽尘大鼠肺组织多种细胞中表达并介导细胞的凋亡,凋亡细胞主要以炎性细胞为主。     

急性脑外伤组织双向凝胶电泳分析

目的利用蛋白质组学方法，寻找急性脑外伤组织的特异蛋白质。方法提取脑外伤患者伤灶组织及正常组织的总蛋白质，通过双向凝胶电泳分离蛋白质，经生物质谱鉴定由图像分析软件所得出的具有表达差异的蛋白质点。结果2组蛋白斑点总体分布相似，主要分布在等电点p13—8，分子量Mr14．4—75kD，分析发现脑外伤组与正常组相比，有18个蛋白质上调和20个蛋白质下调，进一步质谱鉴定，其中7个蛋白质分别为NSFL1辅助因子、硫氧还蛋白、泛素羧基末端水解酶同工酶L1、血小板活化因子乙酰基水解酶IB—r亚单位、谷氨酸脱氢酶前体、二氢嘧啶酶相关蛋白2和微管蛋白。结论脑外伤组与正常组相比蛋白质的表达具有差异。推测，这些蛋白质的变化可能与脑外伤的发展变化具有密切的关系。     

白藜芦醇对UVB损伤HaCaT细胞保护作用的双向电泳图谱差异分析

目的利用双向电泳技术(2-DE)从蛋白质组学角度分析白藜芦醇对中波紫外线(UVB)照射的人角质形成细胞(HaCaT细胞)的保护作用,以探讨白藜芦醇防御UVB损伤的作用靶点及有关机制。方法 MTT法检测不同浓度的白藜芦醇对经或不经UVB照射的HaCaT细胞增殖的影响。2-DE实验分对照组、UVB组、白藜芦醇组、UVB+白藜芦醇干预组(共同干预组),提取各组蛋白进行2-DE实验,结合质谱(MALDI-TOF-MS)分析与数据库检索对差异蛋白质点进行鉴定。结果筛选10个存在明显差异的蛋白点,质谱鉴定出8种蛋白质,除4种功能未知蛋白外,其余4种蛋白分别为转录起始因子IIE-β(TFIIE-β)、组蛋白H1.2、锌指蛋白、MAGOH蛋白。UVB组细胞内组蛋白H1.2水平较其它各组明显增高(P<0.05);UVB组、UVB+白藜芦醇干预组的TFIIE-β及锌指蛋白表达水平均降低,UVB组下降最为明显(P<0.05);UVB组的MAGOH蛋白较各组明显减少(P<0.05)。结论应用2-DE联合质谱技术发现了白藜芦醇对UVB诱导的HaCaT细胞损伤防护作用相关的差异蛋白点。     

三邻甲苯磷酸酯染毒鸡大脑组织中迟发性神经毒性相关蛋白的筛选

目的 从三邻甲苯磷酸酯(TOCP)染毒鸡大脑组织中筛选迟发性神经毒性(OPIDN)相关差异表达蛋白,为进一步探讨OPIDN机制提供靶标蛋白.方法 成年罗曼鹤母鸡32只随机分成1000mg/kg TOCP组(染毒组)、先给40mg/kg PMSF后24 h再给予1000 mg/kg TOCP组(PMSF干预组)、给予40 mg/kg PMSF组(PMSF组)和给予生理盐水的对照组,每组8只.一次性染毒后第5天处死动物,低温环境下分离大脑,匀浆,高速离心提取总蛋白.通过双向凝胶电泳获得完整的全蛋白质图谱,运用图像分析软件(Image Master 2D)对银离子染色的电泳图谱进行分析,并对所选取的蛋白点进行质谱鉴定.结果 染毒组、PMSF干预组和PMSF组鸡大脑组织总蛋白中,分别检测到1185、1294和1063个蛋白点,对照组检测到1332个蛋白点.与对照组比较,染毒组、PMSF干预组和PMSF组匹配率分别为78.32%、79.56%、80.93%.与对照组比较,染毒组差异表达蛋白点有235个,其中,上调点有158个,下调点有77个.根据PMSF的作用特点,在TOCP组中选择与对照组比较差异明显且与PMSF干预组无明显差异的蛋白匹配点,共获得有102个.其中差异表达4倍以上且与PMSF组二次匹配差异无统计学意义的蛋白点有13个.对这些蛋白点做进一步质谱分析和鉴定,获得7个蛋白:homer-1b、Destrin蛋白、热休克蛋白70、真核翻译起始因子、蛋白酶体α1亚基、乳酸脱氢酶B、代谢性谷氨酰胺合成酶.结论 TOCP染毒鸡大脑组织中有112个差异表达蛋白点,可能与OPIDN诱发有关,其中13个差异表达蛋白点可能与OPIDN诱发有密切的关联性.质谱鉴定出7个可能与OPIDN机制关联的蛋白.

Abstract：

Objective To screen the proteins with differential expression levels in the cerebral tissue of hens exposed to tri-ortho-cresyl phosphate (TOCP),and to provide target proteins for studying the mechanism of organophosphoms ester-induced delayed neurotoxicity (OPIDN). Methods Thirty two adult Roman hens were randomly divided into four groups: TOCP group was exposed to 1000 mg/kg TOCP, PMSF group was exposed to 40 mg/kg PMSF, PMSF plus TOCP group was exposed to 40 mg/kg PMSF and after 24 h exposed to 1000 mg/kg TOCP, control group was exposed to normal saline. All hens exposed to chemicals by gastro-intestine for 5 days were sacrificed, and the cerebral tissue were dissected and homogenized in ice bath. Total proteins extracted from the cerebral tissue were separated by isoelectric focusing as the first dimension and SDS-PAGE as the second dimension. The 2-DE maps were visualized after silver staining and analyzed by Image Master 2D software. At last ,the expressed protein spots were identified by Mass spectrometry. Results From total proteins in TOCP group, the PMSF plus TOCP group and PMSF group, 1185, 1294 and 1063 spots were detected, respectively. One thousand three hundred thirty two spots from total proteins in control group were detected. The match rates of protein spots in TOCP group, the PMSF plus TOCP group and PMSF group were 78.32 %, 79.56 % and 80.93%, respectively. There were 235 protein spots with differential expression levels between TOCP group and control group, which included 158 up regulation spots and 77 down regulation spots. According to the PMSF features, there were 102 spots with differential expression levels between TOCP group and control group and without differential expression levels between TOCP group and PMSF plus TOCP group, among them there were 13 spots with 4 fold differential expression levels between TOCP group and control group and without differential expression levels between TOCP group and PMSF group. Seven protein spots (homer-1b, Destrin, heat shock protein 70, eukaryotic translation initiation factors, proteasome α1 subunit, lactate dehydrogenase B, glutamine synthetase) were detected by Mass spectrometry. Conclusion There are 112 protein spots with differential expression levels of the cerebral tissue in TOCP group,which may be related to OPIDN,among them 13 protein spots with differential expression levels are associated closely with OPIDN.Seven protein spots detected by Mass spectrometry may be related to the mechanism induced by OPIDN.     

手掌参醇提取物对染尘大鼠早期肺组织蛋白谱的影响

目的 应用比较蛋白质组学方法分析手掌参醇提取物对染尘大鼠早期肺组织蛋白表达的影响,以寻找低毒有效的矽肺防治药物并初步探讨手掌参干预后的分子机制.方法 随机将Wistar大鼠分为染尘组和手掌参干预组,每组4只,气管暴露法给予1 ml SiO2混悬液(50 mg/ml)建立大鼠模型.染尘后第2天,干预组给予手掌参醇提取物按0.8 g/100 g(0.8 ml/100 g)的量每天灌胃,染尘组给予蒸馏水2 ml每天灌胃共14d处死大鼠.取肺组织,提取总蛋白,双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析鉴定差异蛋白.免疫印迹(Western blot)法验证差异蛋白在肺组织中的表达.结果 染尘组大鼠肺泡隔水肿增厚,淋巴细胞、巨噬细胞及少数中性粒细胞浸润,伴有较多的成纤维细胞和平滑肌细胞增生.胶原纤维聚集,肺泡结构破坏,出现斑片状纤维化,细胞性结节的数量多、体积大.手掌参干预组肺组织的变化与染尘组基本相似,但病理改变较之减轻.鉴定出组织蛋白酶D前体、硫氧还蛋白过氧化物酶-1(peroxiredoxin-1,Prx-1)和SECI4类蛋白33种表达差异的蛋白.与染矽尘组相比,手掌参干预组中组织蛋白酶D前体、Prx-1表达下调,SEC14类蛋白3表达上调,差异均有统计学意义(P＜0.01).用Western blot法分析显示,手掌参干预组大鼠肺组织中Prx-1表达为(0.26±0.02),明显低于染矽尘组(0.35±0.04),差异有统计学意义P＜0.01).结论 手掌参醇提取物可能多环节干预肺纤维化的形成,而组织蛋白酶D前体、Prx-1和SEC14类蛋白3可能是手掌参醇提取物起作用的相关蛋白.     

大剂量N-乙酰半胱氨酸对染尘大鼠肺组织的影响

目的 观察大剂量N-乙酰半胱氨酸(NAC)对矽肺形成过程中炎症和纤维化反应的影响.方法 将Wisar大鼠随机分为模型组、干预组、对照组,每组32只.模型组和干预组以二氧化硅结晶体诱发染尘大鼠模型,干预组以大剂量NAC进行干预.分别在染尘后的第3、7、14、28天处死8只大鼠.对大鼠肺组织进行HE染色及Masson染色,观察肺组织病理变化.用酶联免疫法(EusA)测定肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-8(IL-8)的含量.结果 NAC干预组病理观察显示,肺泡炎症和纤维化程度均较模型组明显减轻.与模型组(13.84±1.61、9.23±0.87、11.23±1.25、9.56±0.76)比较,第3、7、14、28天十预组肺脏系数(9.30±0.78、6.29±0.74、7.63±0.88、6.06±1.16)均明显降低.差异有统计学意义(P＜0.01.与对照组相比,各时间点模型组肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组相比,各时间点干预组的TNF-α和IL-8含量均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 早期大剂量NAC干预能够明显减轻染尘大鼠的肺组织炎症,降低肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量,抑制和延缓肺纤维化的发生.

Abstract：

Objective To explore the effects of high-dose N-acetylcysteine on the lung tissues of rats exposed to silica. Methods Ninety-six Wistar rats were randomly divided into model group, intervention group and control group (32 rats for each group). The rats of model group and intervention group were exposed to silica by intratracheal infusion of silica dust suspension. The rats in the intervention group were orally given high dose N-acetylcysteine. In 3,7,14,28 days after exposure, eight rats in each group were sacrificed, respectively and the lung samples were collected. The pathological changes of lung were evaluated by HE and Masson staining methods. The levels of TNF-α and IL-8 in the BALF were detected by ELISA. Results Compared with the control group, the alveolitis and pulmonary fibrosis in the intervention group were significantly reduced. In 3,7,14,28 days after exposure, the lung/body coefficients in the intervention group were 9.30±0.78, 6.29±0.74,7.63±0.88,6.06+1.16 respectively, which were significantly lower than those (13.84±1.61,9.23±0.87, 11.23±1.25,9.56±0.76, P＜0.01 )in the model group (P＜0.01). At the different time points, the levels of TNF-α and IL-8 in the BALF in the intervention group were significantly higher than those in the control group (P＜0.01), but were significantly lower than those in the model group (P＜0.01). Conclusion The intervention with high dose N-acetylcysteine can significantly reduce the alveolitis and the TNF-α and IL-8 levels in the BALF, therefore, inhibit and delay the development of pulmonary fibrosis of rats exposed to silicon dioxide.     

深圳市志贺菌脉冲场电泳分子分型分析

目的 分析深圳市2001-2006年分离志贺菌菌株之间的相关性,初步建立志贺菌的脉冲场电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分子分型监测网络.方法 55株志贺菌基因组DNA经Xba Ⅰ酶切,通过PFGE获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析.结果 55株志贺菌被分为41种PFGE图谱,聚类分析显示32株细菌谱型属于同一个群,其余菌株谱型差异较大.结论 深圳地区存在遗传紧密相关的志贺菌流行克隆,也存在遗传不相关克隆.PFGE分子分型监测网络的建立,有助于细菌性痢疾的主动监测、暴发调查和传染源追踪.     

应用脉冲场凝胶电泳分型技术溯源副溶血弧菌食物中毒

目的应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对副溶血弧菌食物中毒进行分析。方法采用限制性内切酶NotⅠ,对一起广州市某餐厅副溶血弧菌食物中毒中30株副溶血弧菌进行PFGE分子分型,用BioNumerics Version4．0软件（复选Dice相关系数和UPGMA方法）进行聚类分析。结果分离的30株副溶血弧菌特异性toxR基因均为阳性,毒力基因tdh阳性,而trh阴性。30株副溶血弧菌PFGE型别相同。结论PFGE分型可揭示人、食品和公用具分离的副溶血弧菌菌株之间的流行病学联系,为疫情溯源提供分子流行病学证据和支持。