THANK基因的克隆和序列分析

目的 克隆ＴＨＡＮＫ基因全长及胞外区片段并测序。方法 采用ＰＴ－ＰＣＲ技术,唑人白血病细胞系ＨＬ－６０细胞总ＰＡＮ中扩增人ＴＨＡＮＫ ｃＤＮＡ,并定向克隆于ｐＭＤ－１８Ｔ载体,转染大肠杆菌、抽提质粒后,用ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ＾ＴＭ３７７ＸＬＤＮＡ 自动测义测序。结果ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个８５８ｂｐ的ＤＮＡ片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示：该８５８ｂｐ片段为编码入ＴＨＡＮＫ的ｃＤＮＡ,与公布     

人THANK基因真核表达载体的构建及其在人胚肾细胞中的表达

１材料和方法１．１材料　大肠杆菌Ｋ８０２、人胚肾细胞２９３由本室验室保存。细胞转染试剂脂质体Ｃｌｏｎｆｅｃｔｉｎ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。ＤＭＥＭ购自ＧＩＢ－ＣＯ公司。Ｇ４１８购自Ｓｉｇｍａ公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。鼠抗人ＴＨＡＮＫ单克隆抗体由倪健博士赠送。含有ＴＨＡＮＫ全长ｃＤＮＡ的质粒ｐＭＤ１８－ＴＨＡＮＫ为本实验室构建［］。真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１购自Ｉｎｖｉｏｔｒｏｇｅｎｅ公司。质粒ｐＭＤ１８－Ｔ购自ＴａＫａＲａ公司。ＤＮＡ胶回收试剂盒、细胞ＲＮＡ抽提试剂盒，购自华舜生物工程…     

人肿瘤转移抑制基因真核细胞表达质粒的构建

构建人肿瘤转移抑制基因ＮＭ２３－Ｈ１与真核表达载体ＰｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｒｏ的重组体。方法利用分子生物学克隆技术从质粒ｐｕｃ１８中酶切回收９００ｂｐ的人ＮＭ２３－Ｈ１基因片段,与ＰｃＤＮＡ３．１－Ｚｅｒｏ构成重组体,并根据表达载体与克隆基因核苷酸序列中酶切点分析、鉴定插入片段的正反连接。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9

目的：在Ｂａｃｍｉｄ－杆状病毒－昆虫细胞系统中表达人ＦＧＦ－９。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,自新鲜人脑胶质瘤组织获取人ＦＧＦ－９全编码区ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＣＲ＾ＴＭⅡ质粒及ｐＹＥＸ４Ｔ－１真核表达质粒,经ＤＮＡ自动测序仪进行ＤＮＡ序列测定。将人ＦＧＦ－９ｃＤＮＡ定向克隆入ｐＦａｓｔＢａｃ质粒,进一步将其转座入Ｂａｃｍｉｄ中,在昆虫细胞Ｓｆ９中进行表达,采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对表达产物进行分析。     

以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9

目的：在Ｂａｃｍｉｄ杆状病毒昆虫细胞系统中表达人ＦＧＦ９ 。方法：采用ＲＴＰＣＲ技术,自新鲜人脑胶质瘤组织获取人ＦＧＦ９ 全编码区ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＣＲＴＭ Ⅱ质粒及ｐＹＥＸ４Ｔ１ 真核表达质粒,经ＤＮＡ自动测序仪进行ＤＮＡ序列测定。将人ＦＧＦ９ ｃＤＮＡ 定向克隆入ｐＦａｓｔＢａｃ 质粒,进一步将其转座入Ｂａｃｍｉｄ 中,在昆虫细胞Ｓｆ９ 中进行表达,采用ＳＤＳＰＡＧＥ对表达产物进行分析。结果：在昆虫细胞表达系统中表达出人ＦＧＦ９ 重组蛋白。结论：人ＦＧＦ９ 在Ｂａｃｍｉｄ杆状病毒昆虫细胞系统中得到了表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 …

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶ Ｃ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达的核心抗原     

结核杆菌Ag85B DNA疫苗的制备及其免疫效应初探

将结核杆菌抗原Ａｇ85Ｂ基因克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ3中 ,构建成重组ｐｃＤＮＡ3 Ａｇ85Ｂ ,作为抗结核的ＤＮＡ疫苗 ,观察其对小鼠免疫应答的能力 ,为进一步研制抗结核疫苗提供依据。1 结核杆菌抗原Ａｇ85Ｂ真核表达载体的构建及在Ｃｏｓ 7细胞中的瞬时表达 :由本室构建的重组质粒ｐＵＣ1 8 Ａｇ85Ｂ ,经ＥｃｏＲⅠ /ＳａｌⅠ酶切 ,获得 860ｂｐＤＮＡ片段 ,插入经ＥｃｏＲⅠ /ＸｈｏⅠ酶切的载体ｐｃＤＮＡ3中 ,用ＨｉｎｄⅢ和ＸｈａⅠ酶切分析鉴定阳性克隆 ,获得表达载体ｐｃＤＮＡ3 Ａｇ85Ｂ。用 5μｇ纯化的重组质粒ｐｃＤＮ…     

人α-防御素HNP1基因在气管上皮细胞转染的表达研究

目的　探讨人α防御素ＨＮＰ１ 基因在气管上皮细胞转染表达的可行性。方法　采用脂质体转染法将ＨＮＰ１ ｃＤＮＡ 重组真核表达质粒ｐＢａｂｅＮｅｏＨＮＰ１ 导入无血清培养的人、兔气管粘膜上皮细胞,利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ） 法及免疫组化法,分别在核酸水平及蛋白质水平检测ＨＮＰ１ 的表达。结果　用ＲＴＰＣＲ 在人和兔的转染上皮细胞总ＲＮＡ 提取物中均扩增出１ 条３１９ｂｐ 的ＤＮＡ 片段,与ＨＮＰ１ ｃＤＮＡ 片段大小一致, 而在未转染的上皮细胞总ＲＮＡ 中没有扩增出相应ＤＮＡ片段。免疫组化法检测到转染细胞呈强阳性反应,未转染细胞呈阴性反应,与ＲＴＰＣＲ 法检测的结果一致。结论　实验在ｍ ＲＮＡ 和蛋白质水平上均提示重组真核表达质粒ｐＢａｂｅＮｅｏＨＮＰ１ 转染气管粘膜上皮细胞后,能有效表达ＨＮＰ１ 分子。     

发现2个FGFR1细胞外段同源的cDNA片段

目的：克隆表达人成纤维细胞生长因子受体。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ法,结果：在钓取人ｃＤＮＡ的过程中,意外地钓取到２个与ＦＧＦＲ１细胞外段同源的ｃＤＮＡ片段,经克隆和ＤＮＡ序列分析发现它们是ＦＧＦＲ１细胞外源的ｃＤＮＡ片段,。结论：虽然对这个２个ｃＤＮＡ片段的功能尚不明确,但这种抓住新现象并进行探究的意识对科研很重要。     

大鼠Fas配体基因的克隆

目的 研究Ｆａｓ配体（Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ,ＦａｓＬ）在移植免疫方面的作用,克隆其编码的全部ｃＤＮＡ序列,并添加Ｋｏｚａｋ序列,以便在直核细胞高效表达大鼠ＦａｓＬ。方法 从大鼠的睾丸组织中提取总ＲＮＡ。下游引物以ＲＴ－ＰＣＲ的方法扩增出－９３１ｂｐ的ＤＮＡ征段,将这一片段重组于ｐＢＲ－ＲＳＶ载体中,酶切鉴定插人片段正确后进行全列分析。结果 证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的大鼠ＦａｓＬ基因,与     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

人脑源性神经营养因子和神经营养素3真核双表达载体的构建与鉴定

背景：脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor,BDNF)和神经营养 素3 (Neurotrophines-3,NT-3)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目的：构建双基因共表达载体pIRES2-BDNF-NT-3并对其进行鉴定。 方法:BDNF和NT-3基因核心序列是通过直接PCR的方法从外周血单个核细胞的基因组DNA中获取。然后将BDNF的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建pIRES2-BDNF-EGFP载体,随后将NT-3 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体。实验通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与 Western-blot方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的BDNF和NT-3均与基因库报道序列一致。构建的pIRES2-BDNF-NT-3双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带,经Bam HⅠ/NotⅠ双酶切后切出IRES-NT-3片段,经Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后切出BDNF-IRES-NT-3片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后的HEK293细胞均能表达BDNF和NT-3 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功采用IRES序列构建了能分别表达的BDNF和NT-3双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

野生型和突变型PS1-EGFP真核共表达载体的构建与鉴定

为了构建人野生型和突变型PS1(早老素-1, presenilin-1)-EGPF共表达蛋白的真核表达重组质粒pcDNA3.1 /PS1-EG-FP,本研究应用下述方法:对野生型pcDNA3.1 /PS1(WT)质粒,采用一步法定点突变技术构建pcDNA3.1 /PS1(C407G)突变质粒;合成两对引物,利用PCR技术从pEGFP-C1质粒合成EGFP cDNA片断,在EGFP转录起始密码子ATG之前导入一BamHⅠ酶切位点,利用与pcDNA3.1 /PS1质粒共存的另一EcoRⅠ酶切位点,将合成的EGFP片断通过BamHⅠ和EcoRⅠ两个位点分别克隆入野生型及突变型pcDNA3.1 /PS1质粒的多克隆位点中,从而构建了野生型和突变型PS1与增强绿色荧光蛋白共表达载体。经限制性内切酶双酶切鉴定及DNA测序证实此蛋白共表达载体构建成功。利用此重组质粒瞬时转染SH-SY5Y细胞,72 h后荧光显微镜(激发波长488 nm)观察细胞内有绿色荧光蛋白表达。本研究成功构建了人野生型和突变型PS1-EGFP的真核表达载体,为下一步建立细胞模型,研究突变型PS1的生物学功能以及PS1在AD发病机制中的作用奠定了基础。     

人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达

目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。     

人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人白血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目标：构建双基因共表达载体pIRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定。 方法：是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-LIF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-LIF-EGFP中,最后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp。构建的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/NotI双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/NotI双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR 与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的克隆人Flt3配体（Flt3 LIg and，FL），并在CHO细胞中进行表达。方法从健康人外周血中提取总RNA，通过RT-PCR技术，扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段，经DNA测序证实后，将得到的片段基因插入pcDNA3．0表达载体，构建了pcDNA3．0-FL真核表达载体；将重组质粒pcDNA3．0-FL转染CHO细胞．经G418筛选出阳性细胞克隆，扩大培养，提取细胞总蛋白，用SDS—PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24000处有一显色条带。结果FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3．0中并在CHO细胞中成功表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．0-FL并在CHO细胞中成功表达，为FL的相关研究和应用开发奠定了基础。     

人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)cDNA的克隆

为了研究人碱性成纤维细胞生长因子在治疗神经系统疾病中的作用 ,克隆其 c DN A序列 ,并添加 K ozak序列 ,以用于真核细胞表达。本实验提取我国自建的脑胶质瘤细胞系 BT32 5总 RN A,设计上、下游引物用逆转录 PCR法扩增 c DNA片段 ,然后重组于 p GEM- 3zf( + )载体 ,酶切鉴定插入片段正确后测序。结果 :RT- PCR扩增到 4 73bp的带有 K ozak序列的 c DN A片段。显示 :克隆到碱性成纤维细胞生长因子 c DN A片段 ,可用于真核细胞表达