不同种属钩端螺旋体疏水外膜蛋白的特征研究

研究钩端螺旋体外膜蛋白的结构和抗原特征，对不同种属钩端螺旋体疏水外膜蛋白进行了比较研究。方法 用Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１１４抽提１０株同种属钩体疏水外膜蛋白用不连续缓冲系统制备５％浓缩胶和１２％的分离胶，行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，在恒压下１８０Ｖ电泳５小时，考巴斯亮兰Ｇ－２５０染色。     

我国常见钩端螺旋体蛋白质免疫化学及免疫生物学特性…

分别用我国常见的１５群１５型钩端螺旋体多克隆抗体对我国常见的１５群１５型钩端螺旋体全菌蛋白进行了Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析。结果显示：用不同群的多克隆抗体与１５群１５型钩端螺旋体参考株的全菌蛋白反应，其图谱并不相同，表现在阳性反应带数量的多少和分子量的变化；而用同一群多克隆抗体与１５群１５型钩端螺旋体参考株的全菌蛋白反应，其Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ图谱非常相似，都有３条分子量分别     

不同毒力的问号钩端螺旋体对Vero及J774A.1细胞的黏附和内化

目的 探讨问号钩端螺旋体对传代细胞黏附和内化的能力及其差异。方法 实验中采用非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)和小鼠单核巨噬样细胞(J774A．1)细胞株。采用透射电镜、扫描电镜和Fontana镀银染色法，观察问号钩端螺旋体强毒株黄疸出血群赖型56601、弱毒株波摩那群波摩那型56608黏附细胞及内化能力及其差异，采用腐生性的双曲钩端螺旋体三宝垄群patoc型Patoc I株作为对照.结果 问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株和波摩那群波摩那型56608株均能以一端或两端黏附于Vero及J774A．1细胞。钩体56601株和56608株对J774A．1的黏附率分别为49％和46．9％，对Vero细胞黏附率分别为24．2％和22．9％。钩体56601株和56608株可侵入上述2株细胞，在胞质内形成典型的吞噬泡。钩体56601株还可侵入宿主细胞核内，56608株则否。双曲钩端螺旋体二宝垄群patoc型Patoc I株不能黏附和侵入细胞。结论 两株受试的不同毒力问号钩体株均能黏附细胞，并以内化方式侵入细胞。细胞株的差异可明显影响钩体黏附和内化能力。问号钩体毒力的强弱可能与黏附能力无关，而与其侵入胞核的能力密切相关。     

我国常见钩端螺旋体蛋白质免疫化学及免疫生物学特性的研究

分别用我国常见的１５群１５型钧端螺旋体多克隆抗体对我国常见的１５群１５型钧端螺旋体全菌蛋白进行了Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析。结果显示：用不同群的多克隆抗体与１５群１５型钩端螺旋体参考株的全菌蛋白反应，其图谱并不相同，表现在阳性反应带数量的多少和分子量的变化；而用同一群多克隆抗体与１５群１５型钩端螺旋体参考株的全菌蛋白反应，其Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ图谱非常相似，都有３条分子量分别为２５×１０~３、３２×１０~３和３４×１０~３上下的主要蛋白反应带和３～４条次要蛋白反应带，但其图谱并不完全相同，主要表现在不同群间１条主要蛋白的分子量在２５×１０~３上下变动，证实主要蛋白质可将不同群型钩端螺旋体进行区分；２５×１０~３，３２×１０~３和３４×１０~３蛋白质是所有１５群１５型钧端螺旋体参考株的主要外膜蛋白和抗原成分。这一研究结果对我国常见钩端螺旋体的分类和鉴定，诊断试剂盒、亚单位菌苗和基因工程菌苗的研制有重要意义。     

恶性疟原虫保护性单克隆抗体的分离和纯化

为制备亲和吸附剂,提取恶性疟原虫保护性抗原,我们用ProteinA亲和吸附柱,自小鼠腹水中提取抗恶性疟原虫保护性单克隆抗体。腹水上柱后,用0.1M PBS洗涤杂蛋白,用0.1M醋酸洗脱吸附的McAb。洗脱液经透折。浓缩后,用SDS—PAGE鉴定纯度,免疫荧光及双扩散试验检测其活性。 四个杂交瘤株(9_4D_1,9_4C_3,9_2D_4,9_3A_3)的腹水共60.3ml,过柱后收获McAb153.9mg,平均每毫升腹水可得2.25mg McAb,SDS—PAGE电泳图谱上显示二条区带,     

螺旋体的粘附与致病性的关系

本文结合自己的实验结果,综述了钩端螺旋体和梅毒螺旋体的毒力与粘附现象的关系以及粘附特性在螺旋体感染发病机理中的重要性。并对螺旋体的粘附与致病性和病理改变特     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

钩端螺旋体外膜提取物的理化特性及其免疫源性研究

从黄疸出血群赖型017株钩端螺旋体提取的外膜,电子显微镜下的形态呈圆形或条状化学组成中含蛋白质40％,碳水化合物6％,类脂质52％,并检测到2—酮基—3—脱氧酸(KDO)的存在。外膜提取物免疫家兔产生的抗体,在五个月中仍然保持一定水平。     

赖型钩端螺旋体毒力株新基因差异片段筛选和核苷酸序列分析

目的:筛选致病钩端螺旋体赖型017株毒力相关基因DNA差异片段,并进行核苷酸及基因信息学分析。方法:提取钩端螺旋体017株基因组DNA,根据抑制消减杂交(SSH)筛选的017株特有的153bp核苷酸短片段,采用盒式连接半巢式PCR技术,扩增相邻未知序列,进行序列测定、分析及同源性检索,并进行蛋白二级结构预测。结果:克隆获得580bp核苷酸长度的基因片段,包含4个重叠开放阅读框架(ORF),在氨基酸水平上与A型化脓性链球菌,肺炎链球菌保守的假想蛋白高度同源。被GenBank收录,收录号为AF495587。结论:本研究筛选并分析了可能是钩体毒力相关的基因片段,为进一步探讨该基因的生物学功能及阐明赖型钩端螺旋体致病分子机制打下了基础。     

钩端螺旋体c-di-AMP结合蛋白调控钾离子转运

目的寻找和鉴定钩端螺旋体中编码第二信使c-di-AMP结合蛋白KtrA, 并探究c-di-AMP-KtrA/B系统的功能及调控机制。方法采用PCR扩增ktrA基因并克隆入pET42a质粒获得pET42aktrA原核表达载体, 将其转入表达宿主菌中获得表达rKtrA的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-ktrA。通过亲和层析法提纯上述工程菌表达的重组蛋白rKtrA后, 运用BIAcore技术检测rKtrA与c-di-AMP的结合能力。采用细菌双杂交法检测钩端螺旋体Ktr系统中KtrA与KtrB的结合能力以及外源c-di-AMP对其结合的调控机制。通过在钾离子转运功能缺失大肠埃希菌LB2003株中回补相关基因, 分析c-di-AMP-KtrA/B通路功能。结果成功构建钩端螺旋体ktrA基因原核表达工程菌, 纯化的rKtrA可与c-di-AMP特异性结合;KtrA可与KtrB发生相互作用, 该结合作用可被c-di-AMP解离;KtrA/B系统参与调控钾离子的摄取, 该系统功能受c-di-AMP负调控。结论钩端螺旋体KtrA为c-di-AMP结合蛋白, c-di-AMP-KtrA/...     

问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定

目的　探讨 15群 15型问号钩端螺旋体 (简称钩体 )中国参考标准株及 2群 2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白 (MOMP)基因 (LipL32 ) ,克隆并构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫性。方法　常规酚 氯仿法提取上述钩体株基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统 ,不同浓度IPTG诱导后用SDS PAGE检测rMOMP表达情况。分别用兔抗TR patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性 ,显微镜凝集试验 (MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价 ,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果。结果　上述 17株钩体均有LipL32基因 ,但可分LipL32 1和LipL32 2两种基因型。 13个LipL32 1和 4个Li pL32 2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 95 .12 %～ 96 .6 0 %和 97.79%～ 98.16 %。IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的 4 0 %和 10 %。rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR patocⅠ血清发生结合反应 ,免疫家兔可对上述 17株钩体产生 1∶2～ 1∶6 4MAT效价的凝集抗体。 1∶2～ 1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附。结论　所有检测的钩体具有LipL32 1或LipL32 2基因。所     

我国常见钩端螺旋体蛋白质特性的研究

应用SDS-PAGE首次对我国常见的15群15型钩端螺旋体参考株的全菌蛋白进行了分析,发现15群15型参考株的全菌蛋白基本由33条谱带组成,其中主要蛋白谱带16条,它们的分子量分别为15500,16800,18000,23000,25000,29500,32000,39000,45000,70000,80000,84000,100000,110000,114000和128000;次要蛋白谱带17条,它们的分子量分别为     

中国钩端螺旋体rRNA基因限制性内切酶酶切位点多态性分类研究

目的初步建立我国致病性钩端螺旋体ｒＲＮＡ基因限制性内切酶酶切位点多态性分类体系。方法采用ｒＲＮＡ基因限制性内切酶酶切位点多态性（ＭＲＳＰ）方法对６５个血清型７５株国内外钩端螺旋体参考株及２７株野生株进行分析。结果１６ＳｒＲＮＡ及２３ＳｒＲＮＡ基因在ＨｉｎｆⅠ、ＤｄｅⅠ的酶切位点上呈多态性,分别存在１８种和２４种不同的图谱。结合两种方法则有３４种不同的图谱。致病性钩端螺旋体间ＭＲＳＰ谱型差别相对较小,遗传距离较近,而它们与非致病性钩端螺旋体的ＭＲＳＰ谱型相差大,遗传距离远。国内主要流行型的ＭＲＳＰ只表现为ＭＲＳＰ１型和２型,非主要流行型的ＭＲ－ＳＰ型变化较多。大多数野生株与相应的参考株的ＭＲＳＰ型相同,个别具有不同ＭＲＳＰ型的野生株与相应参考株的遗传距离较近。结论ｒＲＮＡ基因限制性内切酶酶切位点多态性（ＭＲＳＰ）可用于钩体分类,而且是钩体病分子流行病学调查的一种好方法     

问号钩端螺旋体血清群LipL41基因型分析及其表达产物的免疫学鉴定

目的 确定我国15群15株问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株和2群2株双曲钩体国际标准株携带LipL41基因情况，构建该基因的原核表达系统，鉴定表达产物的免疫原性。方法 常规酚—氯仿法提取上述17株钩体基因组DNA，高保真PCR扩增全长LipL41基因片段，T—A克隆后测序分型。构建LipL41基因原核表达系统，SDS-PAGE检测重组目的蛋白(rLipL41)表达情况。分别用钩体属特异性TP/patoe Ⅰ抗原、rLipL41兔抗血清的Western blot鉴定其免疫反应性和抗原性。分别用显微镜凝集试验(MAT)、钩体黏附J774A．1细胞模型检测兔抗rLipL41血清的交叉凝集效价和黏附阻断作用。结果 15株问号钩体均有LipL41基因，并可分为LipL41／1和LipL41／2两种基因型，2株双曲钩体则否。11个LipL41／1基因和4个LipL41／2基因克隆之间的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88．61％—88．67％和93．24％—97．18％。所构建的原核表达系统rLipL41／1和rLipL41／2的表达量分别占钩体总蛋白的30％和40％。rLipL41／1和rLipL41／2均能与TP/patoe Ⅰ抗血清发生结合反应，免疫家兔能产生抗体。rLipL41／1和rLipL41／2兔抗血清对上述15株问号钩体MAT效价为1：8，1：128、1：16～1：2．S6稀释时均能有效地阻断钩体对细胞的黏附。结论 我国主要的15群问号钩体代表株均有LipL41／1或LipL41／2基因。所构建原核表达系统能高效表达rLipL41／1和rLipL41／2。rLipL41／1和rLipL41／2是具有良好抗原性和免疫反应性、广泛存在于不同血清群问号钩体表面的蛋白抗原。     

钩端螺旋体内毒素的实验研究 Ⅴ 钩端螺旋体脂多糖增强机体特异性抗感染能力的作用

波摩那群波摩那型56608株钩端螺旋体脂多糖(L-LPS)免疫的豚鼠能抵抗同株钩端螺旋体的攻击而免于发病和死亡,旦其心血和肾脏培养阳性率也明显下降。L-LPS免疫动物后可产生以IgM为主的群特异性抗体。该抗体当有补体存在时,能在体外裂解钩端旋螺体。此外,L-LPS尚能特异性地抑制豚鼠腹腔巨噬细胞的粘附作用。实验结果提示L-LPS为一种保护性抗原,可特异性地增强机体抗感染的能力。     

豚鼠肝脏中钩端螺旋体数量与钩体病肺弥慢性出血关系的实验探讨(摘要)

采用对倍稀释培养法、组织镀银染色法和~(32)磷标记钩端螺旋体整体切片放射自显影法,探讨钩端螺旋体在豚鼠体内的动态分布,发现:肝脏中钩端螺旋体的数量明显居于体内各脏器之首。采用静脉途径大剂量感染黄疸出血群钩端螺旋体强毒株,除了被机体非特异免疫系统吞噬处理掉的以外,大部份钩端螺旋体是在肝脏中定居、存活并迅速繁殖起来。肝脏中钩     

钩端螺旋体核糖体提取物免疫保护作用的研究

本文对钩端螺旋体核糖体提取物的制备、鉴定、免疫保护作用及抗血清体外杀菌,吞噬调理活性进行了研究。用本文建立的方法制备了黄疸出血群赖型017株钩体核糖体提取物,该提取物中含65％RNA,30％蛋白质,2％DNA。RNA与蛋白质之比约为2:1。电镜负     

钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群众多,各群间交叉保护作用较弱或无,目前国内外均采用当地流行的钩体血清群来制备多价钩体疫苗,但对疫苗中未包含钩体血清群感染的保护作用极其有限,易造成钩体病的暴发流行。已知80℃灭活、生理盐水回收的腐生性双曲钩体PatocⅠ株全细胞抗原(TR PatocⅠ)能与所有钩体病人血清发生凝集反应,但其抗血清能否凝集不同血清群的问号钩端螺旋体尚不清楚。本研究中,我们采用TR PatocⅠ免疫的兔抗血清与我国15群17型问号钩体参考标准株、2群2型双曲钩体国际标准株进行了显微镜凝集试验(MAT) ,发现该抗血清能…     

用免疫缺陷雄性(CBA/N X BALB/c)F1小鼠制备非针对免疫显性位点脂多糖的直接抗肾脏钩端螺旋体蛋白单克隆抗体(文摘)

肾脏钩端螺旋体(简称钩体)是线起Wei—l's病和dairy热的病原体,外膜(OE)由糖类、脂类和至少9种蛋白组成。已知其OE复合抗原中脂多糖(LPS)有免疫保护和被动转移作用,故肾脏钩体OE抗原单克隆抗体(McAb)大多直接抗LPS,而有关OE蛋白的免疫作用及其功能鲜有报道。研究OE蛋自的一个重要步骤就是制备抗蛋白     

黄疸出血群钩端螺旋体MLVA分型研究

目的 初步探讨MLVA(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis)技术在黄疸出血群钩端螺旋体基因分型中的应用.方法 选取7个VNTR位点,对我国致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取基因组DNA,采用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术检测,应用BioNumerics(Ver-sion4.0)软件进行聚类分析.结果 共对117株钩端螺旋体的7个VNTR位点进行了检测,聚类分析分为3个群(A群、B群、C群)28种基因型,其中A群占11.97%(14/117)、B群占0.85%(1/117)、c群占87.18%(102/117);多态性指数介于0.0831与0.8005之间;MLVA基因型存在明显的地域性.结论 MLVA分型技术可初步对钩端螺旋体进行遗传学分类鉴定,应用该技术,将在钩体病分子流行病学研究中发挥重要的作用.