利多卡因对缺氧/复氧后肝细胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响

目的探讨利多卡因预处理对肝细胞缺氧/复氧后Bcl-2、Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法将体外培养的肝细胞分为三组:缺氧/复氧组(Ⅰ组)、利多卡因预处理组(Ⅱ组)和正常对照组(Ⅲ组),每组10份。检测肝细胞缺氧/复氧培养后细胞培养液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)浓度,肝细胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表达、肝细胞凋亡率及超微结构变化。结果Ⅰ、Ⅱ组细胞培养液中ALT、AST浓度、肝细胞Caspase-3蛋白表达和肝细胞凋亡率较Ⅲ组均升高(P<0.05),透射电镜示肝细胞损伤,可见凋亡细胞;Ⅱ组细胞复氧后培养液中ALT、AST浓度、肝细胞Caspase-3蛋白表达和细胞凋亡率均低于Ⅰ组(P<0.05),而肝细胞Bcl-2蛋白表达较Ⅰ组升高(P<0.05),透射电镜观察也显示Ⅱ组肝细胞比Ⅰ组损伤轻微。结论利多卡因预处理可以在一定程度上减轻缺氧/复氧后肝细胞损伤,降低细胞凋亡率,保护机制可能与Bcl-2、Caspase-3蛋白表达有关。     

基质交联分子1对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的:观察抑制基质交联分子1(STIM1)对前列腺癌PC-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法:将携带STIM1基因的小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体STIM1-pGCSIL-GFP转染人激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞,3d后荧光倒置显微镜观察转染效率;1周后RT-PCR及Western印迹验证STIM1抑制表达有效性,并采用Western印迹检测PC-3细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,survivin、激活型Caspase-3的表达水平。结果:倒置显微镜观察发现PC-3细胞病毒转染效率80%。转染1周后,RT-PCR及Western印迹显示STIM1被有效抑制。抑制STIM1表达后,对照组Bcl-2/Bax比率为1.24,干扰组PC-3细胞Bcl-2/Bax比率为0.31,比率显著下降;干扰组PC-3细胞survivin表达明显降低,相对表达量为对照组的0.14倍;Caspase-3裂解激活相对表达量为对照组的1.52倍(P0.05)。结论:STIM1在前列腺癌PC-3细胞中可视为致癌基因,抑制其表达可通过下调Bcl-2/Bax比率,降低survivin表达,激活Caspase-3级联通路,诱导细胞凋亡。     

一氧化氮合酶、p38MAPK、Caspase-3介导缺氧神经细胞凋亡机制的研究

目的探讨缺氧引起PC12细胞凋亡和NOS、p38MAPK和(Caspase-3在缺氧后神经细胞凋亡中的共同作用机制。方法应用噻唑蓝(MTT)法测定缺氧对PC12细胞的生长抑制率,荧光显微镜观察缺氧对PC12细胞损伤,比色法测定PC12细胞在缺氧环境下乳酸脱氢酶(LDH)活性,流式细胞术(FCM)检测缺氧PC12细胞NT阳性细胞百分比,以及细胞周期改变和细胞凋亡率, RT-PCR半定量分析nNOS、iNOS、p38MAPK和Caspase-3 mRNA的表达。结果MTT法测定缺氧抑制PC12细胞生长趋势;AO荧光染色缺氧24 h时PC12细胞可见凋亡小体;缺氧时间延长,LDH渗出量增多,NT阳性细胞百分比增大,S期细胞增多,细胞凋亡率升高,缺氧24 h调亡率达到45.67%;PCR结果分析显示nNOS mRNA在缺氧早期表达,iNOS、p38MAPK和Caspase-3 mRNA主要在缺氧晚期表达。结论缺氧能够引起PC12细胞凋亡现象,nNOS、iNOS分别在缺氧早期和晚期发挥神经毒性作用,NOS,p38MAPK和Caspase-3三种基因共同介导缺氧后PC12细胞凋亡。     

丙泊酚诱导血红素氧化酶-1表达抑制氧糖剥夺大鼠海马神经元凋亡及机制研究

目的 研究丙泊酚诱导血红素氧化酶-1(HO-1)蛋白表达抑制氧糖剥夺海马神经元凋亡的机制.方法 将培养7d的新生(出生24～48 h)SD大鼠海马神经元随机均分为五组:C1组,海马神经元全量换液后再继续培养24 h;C2组,海马神经元接受50μmol/L丙泊酚处理1h后,再继续培养24 h;D组,海马神经元进行缺糖缺氧培养1h后复糖复氧,再继续培养24 h;P组,海马神经元缺糖缺氧的同时接受50 μmol/L丙泊酚处理;Z组,在海马神经元进行缺糖缺氧的同时加入锌原卟啉(ZnpplX)使其终浓度为10 μmol/L后处理同P组.每组分别取12孔海马神经元,用Hoechst33342染色法检测细胞凋亡,用免疫细胞化学染色法检测HO-1蛋白和Bcl-2蛋白的表达.结果 与C1组比较,C2、D及P组海马神经元HO-1和Bcl-2蛋白的表达均增加,D、P及Z组凋亡率显著升高(P＜0.05或P＜0.01).与D组比较,P组海马神经元HO-1和Bcl-2蛋白表达均增加,凋亡率下降(P＜0.01).与P组比较,Z组海马神经元HO-1和Bol-2蛋白的表达均降低,凋亡率则明显升高(P＜0.01).结论 丙泊酚通过诱导氧糖剥夺海马神经元表达HO-1,进而上调Bcl-2,从而抑制氧糖剥夺海马神经元的凋亡,可能是丙泊酚神经保护作用的机制之一.     

缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞凋亡的影响及相关机制

目的 :观察缺氧和营养缺乏对软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)凋亡的影响,探讨B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19-k Da结合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3,BNIP3)信号通路在其中的作用。方法 :从临床获取退变椎间盘软骨终板标本,分离培养软骨终板细胞,使用琼脂糖筛选获得CESCs并进行干细胞标志物鉴定,将第三代细胞分别在常氧/完全培养基(对照组)与缺氧和营养缺乏(实验组)条件下培养48h,通过流式细胞术检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞活性,Western Blot检测BNIP3、Bcl-2关联x蛋白(Bax)、Bcl-2关联k蛋白(Bak)和低氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达水平。使用BNIP3小干扰RNA(siRNA)干扰CESCs中BNIP3基因,同时设置阴性干扰对照组(Scramble siRNA),同前分组处理后再次检测细胞凋亡率、细胞活性及BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达水平。结果:对5例标本获得的CESCs进行了干细胞标志物鉴定,其中细胞表面粘附分子44(CD44)、CD73、CD90和CD105为阳性,CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR为阴性,提示CESCs具有干细胞特性。实验组细胞凋亡率为(29.12±0.65)%显著高于对照组的(14.87±2.03)%(P0.05);实验组的细胞增殖活性明显降低,为对照组的56.18%(P0.05)。与对照组相比,实验组BNIP3、Bax、Bak蛋白的表达均显著上调(P0.05)。使用BNIP3 siRNA干扰后,缺氧和营养缺乏引起的细胞凋亡增加和细胞增殖活力下降均被明显抑制;同时,缺氧和营养缺乏导致CESCs中BNIP3、Bax和Bak的蛋白表达升高也被显著逆转(P0.05)。结论:缺氧和营养缺乏能够诱导CESCs发生凋亡,此过程可能是通过上调BNIP3、Bax和Bak蛋白表达而发挥作用的。     

红景天苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤及其诱导凋亡作用的影响

目的探索红景天苷对大鼠肝脏缺血再灌注(IR)损伤的保护作用及其相关机制。方法将54只SD大鼠随机分成3组(假手术组、IR组、红景天苷组),每组各18只。实验前7 d,红景天苷组每天腹腔注射方式给药(30 mg·kg-1·d-1),IR组和假手术组以相同体积等渗Na Cl溶液代替。建立大鼠肝脏70%IR模型,缺血45 min后恢复血供,再灌注后4、8、16 h每组各处死6只大鼠,立即下腔静脉采血并取肝组织标本。检测大鼠再灌注后不同时间点血清ALT、AST水平;蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9的表达;免疫组织化学法观察上述相关凋亡相关分子阳性细胞表达并进行半定量分析;流式细胞仪检测肝细胞凋亡率。采用单因素方差分析比较各组大鼠再灌注后不同时间点血清ALT和AST含量、凋亡相关蛋白相对表达量及细胞凋亡率。结果与假手术组相比,IR组各时间点ALT、AST均上升,红景天苷组ALT、AST均低于IR组(P均0.05)。与IR组相比,红景天苷组Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达降低,Bcl-2表达增加;2组再灌注后各时间点Bcl-2、Bax相对表达量差异均具有统计学意义,再灌注后4 h Caspase-3相对表达量差异有统计学意义,再灌注后8、16 h Caspase-8、Caspase-9相对表达量差异有统计学意义(P均0.05)。再灌注后8 h,红景天苷组、IR组和假手术组肝细胞凋亡率分别为(24.09±2.43)%、(45.71±3.19)%和(5.46±0.34)%,差异有统计学意义(F=4.08,P0.05)。结论红景天苷预处理可以减轻肝脏缺血再灌注损伤,可能与其抑制细胞凋亡内源性和外源性途径有关。     

Bcl-2过表达对TNF-α诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响

目的 探讨凋亡相关基因Bcl-2过表达对TNF-α诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响及相关机制。方法将含有Bcl-2cDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB质粒转染原代培养的大鼠成骨细胞并且进行阳性克隆筛选。用30 ng/ml TNF-α刺激转染组和对照组细胞24 h,流式细胞术、透射电镜检测细胞凋亡,应用免疫组化结合计算机图像分析技术检测转染组和对照组细胞Bcl-2蛋白及TNF-α刺激前后Caspase-3蛋白表达。结果 Bcl-2蛋白表达在转染加压筛选组显著高于对照组(P<0.05)。TNF-α刺激后转染组细胞亚二倍体凋亡峰比例为6.6％,对照组为16.1％。TNF-α刺激后转染组细胞.超微结构大多正常,对照组细胞出现明显凋亡征象。TNF-α刺激后两组细胞 Ciaspase-3蛋白表达均升高;TNF-α刺激前Caspase-3蛋白表达转染组与对照组比较差异无显著性(P>0.05),TNF-α刺激后Cas-pase-3表达对照组较转染组显著高(P<0.05)。结论 Bcl-2过表达对TNF-α诱导的成骨细胞凋亡有抵抗作用,Bcl-2过表达的抗凋亡作用可能部分通过抑制TNF-α刺激引起的Caspase-3蛋白表达升高实现,有望作为抑制成骨细胞凋亡的侯选基因。     

电刺激对LPS诱导M1型小胶质细胞活化的影响

目的评价电刺激对LPS诱导M1型小胶质细胞活化的影响。方法将生长良好的BV2小胶质细胞采用随机数字表法分为3组(n=18):对照组(C组)、LPS组和LPS+电刺激组(LE组)。C组常规培养24 h, LPS组和LE组加入浓度为100 ng/ml的LPS培养基孵育24 h, LE组于LPS孵育前给予100 mV/mm的直流电刺激4 h。采用ELISA法检测上清液TNF-α和IL-1β浓度;免疫荧光染色法检测M1型小胶质细胞表面标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达水平;qRT-PCR法检测细胞CD32和iNOS的mRNA表达水平。结果与C组相比, LPS组和LE组上清液TNF-α和IL-1β浓度升高, 细胞CD32和iNOS及其mRNA表达上调(P<0.05);与LPS组相比, LE组上清液TNF-α和IL-1β浓度降低, 细胞CD32和iNOS及其mRNA表达下调(P<0.05)。结论电刺激可抑制LPS诱导M1型小胶质细胞活化, 从而减轻炎症反应。     

矢车菊素-3-葡萄糖苷诱导人胃癌细胞株SGC7901凋亡及其机制

目的 观察矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)在体外诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡的生物学效应,并初步探讨其分子机制.方法 分别采用不同浓度梯度的C3G处理SGC7901胃癌细胞,MTT比色法检测细胞生长率;激光共聚焦显微镜观察细胞形态改变;TUNEL法分析细胞凋亡率;Western blot法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3、ICAD蛋白表达的情况.结果 C3G在体外能明显抑制人胃癌SGC7901细胞的生长增殖,且呈浓度、时间依赖性(P＜0.01).激光共聚焦显微镜下可见Hoechst33258荧光染色细胞呈凋亡特征性改变;TUNEL法检测实验组细胞凋亡率均明显高于阴性对照组(P＜0.01);C3G可下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,降低Bcl-2/Bax蛋白的比值,促使Caspase-3酶原蛋白活化,下调ICAD蛋白表达(P＜0.01).结论 C3G具有在体外抑制胃癌细胞增殖的作用,并能诱导其凋亡,其机制可能与Bcl-2/Bax降低导致Caspase-3活化、ICAD蛋白表达下降相关.     

神经细胞炎症模型的构建：小胶质细胞-神经元共培养系统

目的通过建立小胶质细胞-神经元共培养系统, 制备体外神经细胞炎症模型。方法选用小鼠BV-2小胶质细胞、NSC34运动神经元、HT-22海马神经元。实验Ⅰ采用不同浓度LPS(10、100、500和1 000 ng/ml)刺激BV-2小胶质细胞, 提取小胶质细胞培养上清液即条件培养基, 分别培养两种神经元, 采用CCK-8法选取导致神经元活力明显下降50%的LPS浓度用于Transwell共培养系统的建立。实验Ⅱ将小胶质细胞接种于Transwell上室, 神经元种于下室。采用随机数字表法分为2组(n=12):对照组和LPS组, 小胶质细胞分别用细胞培养基、LPS培养或孵育6 h, 随后更换新鲜培养基继续培养12 h, 合并上、下室细胞继续培养。BV-2-NSC34 Transwell共培养系统共培养12 h, BV-2-HT-22 Transwell共培养系统共培养24 h。采用ELISA法检测神经元培养液IL-1β、IL-18浓度, 采用流式细胞术检测神经元凋亡率, 采用qRT-PCR检测神经元Bcl-2、Bax的mRNA表达, 采用Western blot法检测神经元cleaved c...     

一氧化氮合酶反义RNA重组腺相关病毒载体体外提高PC12细胞耐缺氧的能力

目的探讨2种分别携带神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）反义RNA重组腺相关病毒载体（rAAV-AsnNOS和rAAV-AsiNOS）提高PC12细胞耐氧能力和抑制PC12细胞凋亡的作用机制。方法将PC12细胞培养基换成分别含有rAAV—AsnNOS、rAAV-Asi—NOS和rAAV-LacZ（携带β-半乳糖苷酶的结构基因重组腺相关病毒载体）的10％胎牛血清DMEM，设立对照组，测定不同rAAV转染后PCI2细胞在不同缺氧时间下细胞生长趋势和乳酸脱氢酶（LDH）活性改变，流式细胞仪（FCM）测定细胞凋亡率，FCM和半定量RT—PCR分别分析nNOS、iNOS、p38MAPK和Caspase-3阳性细胞百分比和mRNA的表达。结果一定感染复数的rAAV对PC12细胞生长趋势无明显影响；转染rAAV-AsnNOS的PC12细胞在缺氧1—6h时LDH活性、细胞凋亡率以及nNOS、p38MAPK和Caspase-3阳性细胞百分比和mRNA表达量均较对照组、rAAV-LacZ组和rAAV-AsiNOS组均降低；转染rAAV—AsiNOS的PC12细胞在缺氧6～24h时LDH活性、细胞凋亡率以及iNOS、p38MAPK和Caspase-3阳性细胞百分比和mRNA表达量也均较对照组、rAAV—LacZ组和rAAV-AsnNOS组降低。结论在体外神经细胞缺氧模型中，转染后PC12细胞能够耐受缺氧损伤；转染rAAV-AsnNOS病毒载体的PC12细胞能够在缺氧早期抑制nNOS、p38MAPK和Caspase-3的表达，转染rAAV-AsiNOS病毒载体的PC12细胞能够在缺氧晚期抑制iNOS、p38MAPK和Caspase-3的表达。     

缺氧诱导因子1α对人羊膜间充质干细胞耐受缺氧能力影响的实验研究

目的通过瞬时转染缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因,观察缺氧处理后人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)成活及凋亡情况,探讨HIF-1α对hAMSCs耐受缺氧能力的影响。方法取健康剖宫产产妇自愿捐赠的羊膜组织分离、培养hAMSCs,通过倒置相差显微镜观察细胞形态及免疫荧光法检测干细胞标志物OCT-4、NANOG表达,对培养细胞进行鉴定。取第3代hAMSCs进行缺氧处理(200μmol/L CoCl_2)后,按以下分组瞬时转染对应质粒:A组为hAMSCs空白组,B组为pcDNA3.1阴性对照组,C组为shRNA阴性对照组,D组为shRNA-HIF-1α干扰组,E组为pcDNA3.1-HIF-1α过表达组。缺氧处理后12、24、48 h采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测各组细胞成活率;24 h采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,并采用Western blot检测HIF-1α、VEGF、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma2,Bcl-2)、Bax、活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3,C-Caspase-3)蛋白表达。结果 CCK-8法检测示,缺氧处理后各时间点与A、C组比较,D组细胞成活率明显降低(P0.05);与A、B组比较,E组细胞成活率明显升高,其中24 h组间比较差异有统计学意义(P0.05);E组内24 h时细胞成活率明显高于12、48 h时(P0.05)。流式细胞仪检测示,与A、C组比较,D组细胞凋亡率明显升高(P0.05);与A、B组比较,E组细胞凋亡率明显降低(P0.05)。Western blot检测示,与A、C组比较,D组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax、CCaspase-3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P0.05);而E组结果相反,与A、B组比较,E组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax、C-Caspase-3蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论 HIF-1α基因过表达能够明显改善hAMSCs耐受缺氧能力,其机制可能与上调VEGF和Bcl-2表达及下调Bax和C-Caspase-3表达作用相关。     

SH2B1沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡及PI3K/Akt通路的影响

目的:探讨RNA干扰技术(RNAi)沉默Src同源性2B衔接蛋白1(SH2B1)对乳腺癌细胞增殖、凋亡及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法:体外培养人正常乳腺上皮细胞MCF-10a与乳腺癌细胞MCF-7,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹(WB)法检测细胞中SH2B1 mRNA及蛋白表达水平。采用RNAi技术将SH2B1阴性对照质粒、si-SH2B1分别转染至MCF-7细胞,分别命名为si-NC组、si-SH2B1组,未经处理的MCF-7细胞命名为空白对照组。采用RT-PCR法检测各组MCF-7细胞中SH2B1、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白X(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)mRNA表达水平;CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期情况;Western blot法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、PI3K及其磷酸化蛋白(p-PI3K)、Akt及其磷酸化蛋白(p-Akt)等蛋白表达情况。结果:与MCF-10a细胞相比,MCF-7细胞中SH2B1 mRNA及蛋白表达均显著升高(P0.05);与空白对照组、si-NC组相比,si-SH2B1组SH2B1 mRNA及蛋白表达、S期与G_2/M期DNA量、Bcl-2 mRNA及蛋白表达均显著降低(P0.05);MCF-7细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、G_0/G_1期DNA量、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达均显著升高(P0.05);WB法显示,si-SH2B1组MCF-7细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表达均显著低于空白对照组、si-NC组(P0.05)。结论:SH2B1沉默可抑制乳腺癌细胞增殖,诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡,其作用机制可能与下调PI3K/Akt信号通路有关。     

上调NICD对人牙周膜干细胞增殖及迁移能力的影响

目的:研究上调Notch胞内区域(Notch Intracellular Domain,NICD)对人牙周膜干细胞增殖及迁移能力的影响。方法:将细胞分为上调组、对照组及空白组,使用MTT比色法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,采用细胞划痕实验检测细胞迁移情况,并使用Western blot检测人牙周膜干细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白(TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Caspase-3、Bax、Bcl-2)表达量。结果:对照组各时间点的人牙周膜干细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、迁移、黏附个数、TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量均低于空白组,且凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达量高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。上调组各时间点人牙周膜干细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、迁移、黏附个数、TGF-β、BMP-2、β-caten、LEF-1、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量均高于空白组和对照组,且凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达量均低于空...     

西罗莫司诱导人肝癌细胞株BEL-7402凋亡及其机制

目的探讨西罗莫司（SRL）在体外诱导人肝癌细胞株BEL-7402的凋亡作用及其机制。方法以不同浓度的SRL（5、10、20、30、40和50nmol／L）作用于体外培养的人肝癌细胞株BEL-7402，应用流式细胞仪检测培养24、48和72h时的细胞凋亡情况；Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡时的形态学变化；Western Blot法观察BEL-7402细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bcl-xl和Bax基因的表达变化；采用Caspase-3试剂盒检测Caspase-3酶的活性；JCl染色法检测细胞线粒体膜电位（△ψbm）。结果SRL可诱导BEL-7402细胞凋亡，并与药物浓度和作用时间呈正相关。SRL作用BEL-7402细胞后48h，在Hoechst33258荧光染色图片上可见核浓缩及核碎裂等典型的细胞凋亡特征，凋亡过程中线粒体膜电位下降及Caspase-3酶原蛋白激活，伴有Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达的降低和Bax蛋白上调。结论SRL能使抗凋亡蛋白Bcl-2、gcl-xl表达降低，促凋亡蛋白Bax表达上调，线粒体膜电位下降，激活Caspase-3酶原蛋白，从而诱导细胞凋亡。     

缺氧诱导因子1α对人羊膜间充质干细胞耐受缺氧能力影响的实验研究北大核心CSCD

目的通过瞬时转染缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因,观察缺氧处理后人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)成活及凋亡情况,探讨HIF-1α对hAMSCs耐受缺氧能力的影响。方法取健康剖宫产产妇自愿捐赠的羊膜组织分离、培养hAMSCs,通过倒置相差显微镜观察细胞形态及免疫荧光法检测干细胞标志物OCT-4、NANOG表达,对培养细胞进行鉴定。取第3代hAMSCs进行缺氧处理(200μmol/L CoCl_2)后,按以下分组瞬时转染对应质粒:A组为hAMSCs空白组,B组为pcDNA3.1阴性对照组,C组为shRNA阴性对照组,D组为shRNA-HIF-1α干扰组,E组为pcDNA3.1-HIF-1α过表达组。缺氧处理后12、24、48 h采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测各组细胞成活率;24 h采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,并采用Western blot检测HIF-1α、VEGF、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma2,Bcl-2)、Bax、活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3,C-Caspase-3)蛋白表达。结果 CCK-8法检测示,缺氧处理后各时间点与A、C组比较,D组细胞成活率明显降低(P<0.05);与A、B组比较,E组细胞成活率明显升高,其中24 h组间比较差异有统计学意义(P<0.05);E组内24 h时细胞成活率明显高于12、48 h时(P<0.05)。流式细胞仪检测示,与A、C组比较,D组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与A、B组比较,E组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。Western blot检测示,与A、C组比较,D组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax、CCaspase-3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而E组结果相反,与A、B组比较,E组细胞中HIF-1α、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax、C-Caspase-3蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HIF-1α基因过表达能够明显改善hAMSCs耐受缺氧能力,其机制可能与上调VEGF和Bcl-2表达及下调Bax和C-Caspase-3表达作用相关。     

脊髓损伤后凋亡调控基因Bcl-2、Bax的表达及意义

目的：观察探讨大白鼠脊髓损伤后细胞凋亡及调控基因Bcl-2、Bax的表达及意义。方法：28只SD大鼠随机分为7组，Allen’s法致伤脊髓，于术后4、8、24、48、72、168h采集脊髓标本，1组作为对照组，分别行HE染色、TUNEL染色和免疫组化技术检测Bcl-2、Bax的表达。结果：TUNEL染色显示有神经元和胶质细胞凋亡。Bcl-2在术后4h开始出现阳性表达，24h达高峰。Bax术后4h出现阳性表达，8h时达高峰。结论：脊髓损伤后存在神经元和胶质细胞的凋亡，Bcl-2、Bax基因对调控细胞凋亡可能具有重要作用。     

MiR-490-3p靶向HMGA2在骨肉瘤细胞凋亡中的作用

目的以人骨肉瘤MG-63细胞为研究对象,探讨miR-490-3p诱导MG-63细胞凋亡的作用及其分子机制。方法分别设立miR-490-3p mimics组(对照组)、慢病毒lenti-sh miR-490-3p组(药物组),每组设6个复孔。采用MTT法检测miR-490-3p对细胞生长抑制作用;采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测不同实验条件下miR-490-3p对MG-63细胞凋亡率的影响;Western blot检测miR-490-3p对HMGA2、Bcl-2、BAX和Caspase-3蛋白表达的影响。结果 MiR-490-3p能抑制MG-63细胞增殖,药物组与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。经3次实验结果,药物组的早期凋亡的细胞比例为58.90%±0.89%,明显高于对照组的5.34%±0.34%,差异有统计学意义(P0.05)。通过Western blot检测MG-63细胞中HMGA2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin蛋白表达,结果显示miR-490-3p转染后,促进凋亡蛋白Bax表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,Bax或Bcl-2比率增高,而线粒体凋亡途径下游的Caspase-3蛋白被激活,表达量降低。结论 MiR-490-3p能显著抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,其作用机制可能与靶向HMGA2的表达、上调Bax/Bcl-2蛋白表达比例、激活Caspase-3蛋白级联反应和调控Survivin蛋白表达有关。     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

缺氧诱导小鼠神经干细胞诱导型一氧化氮合酶的表达

目的　探讨缺氧对小鼠神经干细胞 (NSC)中诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)表达的诱导作用。方法　用含表皮生长因子的培养基原代培养NSC ;用免疫组织化学法检测在急性缺氧诱导下iNOS的表达 ;在每张免疫组织化学图像中随机选取 10个细胞 ,用图像分析系统分析经不同缺氧时间处理后平均灰度级变化 ,其灰度级均数间接反映酶表达强度的改变。结果　原代培养的细胞能连续增殖并分化为神经元及神经胶质细胞样细胞 ;行免疫组织化学检测 ,在一般培养条件下 ,NSC及分化细胞中iNOS呈阴性表达 ;经缺氧处理后呈阳性表达。图像分析缺氧诱导 10、3 0min与非缺氧组灰度级均数分别为 :15 8.7± 5 .95、12 8.4± 5 .73、2 0 0 .3± 5 .5 5。结论　用缺氧方法能诱导NSC表达iNOS ,其表达强度与缺氧时间呈正相关。第四军医大学西京医院全军神经外科研究所