Zip1 转染骨髓间充质干细胞对WNT1/β-catenin信号成骨通路的影响

目的观察ZIP1 siRNA转染的骨髓间充质干细胞对Wnt1/β-catenin信号成骨通路的影响。方法从成年雄性新西兰兔股骨骨髓中提取骨髓间充质干细胞并培养传代,然后使用0.03 mol/L,0.09 mol/L,0.15 mol/L,0.21 mol/L酒精进行培养,经ZIP1 siRNA及ZIP1表达转染后,检测各组骨髓间充质干细胞中ALP、I型胶原、OCN及Runx2蛋白的表达量。结果与空白对照组相比,不同酒精组的ALP、I型胶原、OCN及Runx2蛋白表达量均有所下降,随着浓度升高,其表达量逐渐下降,但0.03 mol/L组中ALP及OCN下降不明显,统计学无明显意义(P0.05),其他各组均有明显的统计学意义(P0.05),不同酒精组中的I型胶原及Runx2与正常组之间差异均有明显统计学意义(P0.05)。与空白对照组对比,ZIP1表达组ALP、I型胶原及OCN表达量明显升高,差异具有明显的统计学意义(P0.05),ZIP1siRNA组ALP、OCN表达量明显降低,差异具有明显的统计学意义(P0.05),而I型胶原表达量下降不明显,差异无统计学意义(P0.05);与ZIP1siRNA组相比,ZIP1表达组ALP、I型胶原及OCN表达量明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 ZIP1能促使骨髓间质干细胞向成骨分化,从而促进骨修复及骨代谢。沉默ZIP1表达能抑制骨髓间充质干细胞的WNT1/β-catenin信号成骨通路的表达,从而抑制促进细胞的成骨分化能力。     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

慢病毒介导TGF-β1基因诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化

[目的]探讨慢病毒介导转化生长因子β1(tansforming growth factor bata 1,TGF-β1)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导成软骨细胞分化的作用。[方法]密度梯度离心法分离培养BMSCs,探索病毒感染最佳条件,取第3代细胞,分为实验组和对照组,通过慢病毒载体将外源性TGF-β1基因转染入细胞,观察绿色荧光表达情况,Real-time PCR法和western blot法检测TGF-β1基因的mRNA和蛋白表达情况,7、14 d时行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和Real-time PCR检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的表达。[结果]TGF-β1基因转染BMSCs后能够稳定表达。转染7、14 d时,实验组免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。转染7、14 d时,实验组II型胶原mRNA均显著高于对照组(P<0.01)。转染7 d时,实验组聚集蛋白聚糖mRNA变化不明显,而14 d时显著高于对照组(P<0.01)。[结论]慢病毒介导的TGF-β1基因可成功转染大鼠BMSCs,并诱导其向软骨细胞分化。在此过程中软骨特异性标志Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达具有时间差异性。     

慢病毒介导siRNA hsa-circ-0000885转染BMSCs与破骨细胞共培养体系对细胞分化、增殖和凋亡相关研究

目的:探究将siRNA hsa-circ-0000885修饰的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后与破骨细胞共培养对BMSCs的成骨分化、细胞增殖和凋亡的影响,为临床上骨质疏松症(osteoporosis,OP)的治疗提供新的思路和方法。方法:选择自2018年9月至2020年2月收治的13例骨质疏松患者为研究对象,其中女11例,男2例,年龄(65.45±10.77)岁;取得患者知情同意后,抽取患者外周血组织。然后用circ RNA芯片检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的circRNA的表达水平,用siRNA技术沉默circ RNA的表达,通过慢病毒转染BMSCs,根据是否转染hsa-circ-0000885的siRNA干扰质粒,将细胞分成空白组,空载体组和siRNA干扰组。各组细胞处理72 h后,用流式细胞仪检测细胞的周期,用AV-PI试剂盒检测细胞的凋亡水平,用ALP染色检测BMSCs的成骨分化能力。结果 :OP患者外周血PBMC中hsa-circ-0000885的表达量明显高于健康对照组患者(t=2.119,P0.05)。ALP染色结果表明,siRNA hsa-circ-0000885质粒可以促进BMSCs的成骨分化,明显高于空白组和空白质粒组(F=9.132,q=2.995,2.897;P=0.009,0.0120.05)。CCK-8试剂盒检测结果显示,siRNA hsa-circ-0000885干扰组BMSCs的细胞增殖率明显高于空白组和空白质粒组(F=9.881,q=2.457,2.904;P=0.032,0.0160.05)。而AV-PI试剂盒检测结果显示,siRNA干扰组细胞的凋亡率明显低于空白组和空白质粒组(F=10.208;q=2.885,3.001;P=0.019,0.0110.05)。结论:慢病毒介导siRNA hsa-circ-0000885质粒转染BMSCs与破骨细胞共培养体系可以促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进BMSCs的成骨分化,可以作为OP患者潜在的治疗靶点。     

壮筋养血汤介导MAPK/P38-ERK通路调控成骨成脂分化的作用机制

目的 探讨壮筋养血汤（Zhuangjin Yangxue Decoction,ZJYXD）通过LncRNA ANRIL介导的MAPK/ P38-ERK 通路调控成骨成脂分化的作用机制。方法 提取骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并采用ANRIL慢病毒转染BMSCs;制备ZJYXD含药血清用于培养转染后的BMSCs。通过CCK-8检测BMSCs增殖活力;运用碱性磷酸酶、茜素红及油红O染色检测各组细胞成骨成脂分化情况;通过qRT-PCR、Western Blot法检测成骨、成脂、MAPK/ P38-ERK信号通路相关基因及蛋白的表达。选取24只SPF级C57BL/6雄性小鼠用于制作股骨横断骨折模型,造模后给予不同转染的BMSCs治疗并给予ZJYXD。通过X-ray与Micro-CT检测对照组、对照组+ZJYXD组、ANRIL过表达组、ANRIL过表达+ZJYXD组小鼠骨愈合情况。结果 与0 %含药血清相比,6 % ZJYXD含药血清对BMSCs细胞增殖能力最强（P<0.01）。ZJYXD干预后成骨染色加深,成骨相关基因OPN、RUNX2 mRNA及蛋白表达显著升高（P<0.01）;成脂染色减弱,相关基因PPARγ、C/EBPα mRNA及蛋白表达显著降低（P<0.01）。同时ZJYXD促进了P-ERK、P38蛋白表达（P<0.01）。X-ray及Micro-CT显示ZJYXD促进了小鼠骨折后愈合。当ANRIL过表达后,ZJYXD调节成骨成脂细胞分化作用消失,无法有效的促进骨折愈合。结论 壮筋养血汤具有促进成骨分化、抑制成脂分化的作用,而这种作用通过LncRNA ANRIL调控MAPK/ P38-ERK信号通路实现。     

骨形态发生蛋白-7的过表达载体对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的过表达载体对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响.方法 取10例健康志愿者的骨髓组织,培养原代BMSCs.采用流式细胞仪检测BMSCs的表面蛋白,对BM-SCs进行鉴定.利用基因编辑技术,构建BMP-7的过表达载体,通过慢病毒转染BMSCs,将BMSCs分成转染组和未...     

双基因pCDNA 3.1-NGF-IRES-BMP2真核质粒转染大鼠BMSCs诱导成骨的研究

[目的]研究双基因NGF与BMP2转染大鼠BMSCs并诱导BMSCs成骨分化后表达情况。[方法]将第三代大鼠BMSCs,分为五组,单基因pCDNA3.1-NGF转染组(A组),单基因pCDNA3.1-BMP2转染组(B组),双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2转染组(C组),空质粒对照组(D组)、阴性对照组(E组)。运用Lipofectamine2000介导将各组基因转染BMSCs,Western-blot检测目的基因蛋白表达情况,免疫组织化学染色检测I型胶原蛋白表达含量并测定灰度值。ALP试剂盒检测ALP表达含量,茜素红染色测定转染后各组钙结节并计数。[结果]各组基因转染BMSCs后,Western-blot、I型胶原免疫组化染色、ALP试剂盒检测、茜素红染色钙结节及统计学分析均提示双基因转染组的目的蛋白表达量、I型胶原蛋白表达量、ALP表达量、钙结节形成数目均高于单基因转染组、空质粒组及阴性对照组。[结论]转染双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2组BMSCs可同时表达两种目的蛋白,能诱导BMSCs向成骨细胞分化,NGF的加入能够增强BMP2的成骨作用。     

LncRNA DANCR靶向调控对绝经后骨质疏松BMSCs成骨分化的作用

目的 研究长链非编码RNA（lncRNA）分化非蛋白编码 RNA（DANCR）靶向微小RNA（miR）-19a-3p对绝经后骨质疏松（PMOP）骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的调控作用。方法 选择健康女性志愿者4例和PMOP患者4例，分离培养BMSCs；PMOP患者BMSCs进行分组，转染阴性对照（NC）siRNA、lncRNA DANCR siRNA、miR-NC抑制物、miR-19a-3p抑制物。检测lncRNA DANCR、miR-19a-3p、PTEN的表达水平，成骨诱导分化后检测茜素红染色的OD405水平、碱性磷酸酶（ALP）活力、骨钙素（OCN）及骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达水平。结果 PMOP患者BMSCs中lncRNA DANCR、PTEN的表达水平高于健康女性，miR-19a-3p的表达水平及成骨诱导后的OD405水平、ALP活力、OCN及OPN的表达水平均低于健康女性。在PMOP患者BMSCs中，si-DANCR组的lncRNA DANCR、PTEN的表达水平低于si-NC组，成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平高于si-NC组；si-DANCR+miR-19a-3p抑制物组成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物组，PTEN的表达水平高于si-DANCR+miR-NC抑制物组。结论 LncRNA DANCR靶向miR-19a-3p调控PMOP患者BMSCs的成骨分化。     

miR-23a对人炎症来源牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的探讨miR-23a对人炎症来源牙周膜干细胞成骨分化的影响。方法分离培养正常牙周组织的牙周膜干细胞(hPDLSCs)和牙周炎来源hPDLSCs(PPDLSCs),qRT-PCR检测miR-23a的表达。下调或上调PPDLSCs中miR-23a的表达并诱导其成骨分化,采用qRT-PCR检测相关蛋白表达,茜素红染色检测各组PPDLSCs的体外成骨分化能力。结果 PPDLSCs中miR-23a的表达水平明显高于hPDLSCs(P0.05);上调miR-23a表达后,成骨分化的标志基因Runx2、ALP、OCN的mRNA水平及钙化结节数明显降低(P0.05);下调miR-23a表达后,Runx2、ALP、OCN的mRNA水平及钙化结节数升高(P0.05)。结论体外条件下miR-23a可以抑制PPDLSCs的成骨分化。     

miR-187-5p 对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的调控作用

目的利用小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化模型,探讨miR-187-5p在成骨分化中的表达趋势及调控作用。方法通过切除雌性小鼠双侧卵巢构建小鼠骨质疏松模型;应用qRT-PCR技术检测组织和细胞中miR-187-5p的表达;应用基因转染技术观察过表达或敲减miR-187-5p对BMSCs向成骨分化的影响;应用茜素红和碱性磷酸酶染色检测BMSCs中矿化结节的数量和矿化区域的染色面积。结果 qRT-PCR结果显示miR-187-5p在骨质疏松模型小鼠的骨组织及BMSCs中均表达下降。过表达miR-187-5p可提高ALP、Collagen-1、Runx2、BMP4、OCN和OPN等成骨分化相关基因mRNA的表达,促进BMSCs向成骨分化;而敲减miR-187-5p降低ALP等成骨分化相关基因mRNA的表达,抑制BMSCs向成骨分化。在体实验同样证实,过表达miR-187-5p可以显著促进骨质疏松小鼠BMSCs向成骨分化,改善小鼠的骨质疏松表型。结论过表达miR-187-5p促进BMSCs向成骨分化,敲减miR-187-5p抑制BMSCs向成骨分化。     

siRNA慢病毒载体介导DKK-1基因沉默对骨髓间充质干细胞分化影响的实验研究

背景:激素性股骨头坏死(SONFH)发病机制尚不完全明确,可能与骨髓间充质干细胞(BMSC)的异常分化密切相关。目的:研究si RNA慢病毒载体介导的DKK-1基因沉默,通过调控Wnt/β-catenin信号通路对超生理剂量糖皮质激素作用下大鼠BMSC分化的影响,探索治疗SONFH的新途径。方法:提取、培养SD大鼠BMSC,并构建DKK-1基因慢病毒干扰载体。大鼠第3代BMSC分4组:对照组(A组)、激素组(B组)、激素+无序序列慢病毒载体组(C组)、激素+DKK-1基因慢病毒干扰载体组(D组)。A组用基础培养基培养,B组加入浓度为1×10^(-6)mol/L的地塞米松,C、D组除加入地塞米松外,各自加入相应的慢病毒载体转染BMSC。14 d后提取各组细胞RNA及蛋白,对DKK-1、成脂相关基因PPAR-γ2和成骨相关基因RUNX2进行Real-time PCR及Western-blot检测,并对各组进行油红O、茜素红染色,观察各组BMSC分化情况,对结果进行统计学分析。结果:Real-time PCR及Western-blot检测结果示B、C组与A、D组相比,成骨相关基因RUNX2的表达明显较低(P<0.05),而DKK-1及成脂相关基因PPAR-γ2的表达明显较高(P<0.05)。油红O染色结果显示B、C组呈阳性,A、D组呈阴性;茜素红染色结果显示A、D组呈阳性,B、C组呈阴性。结论:DKK-1基因沉默通过特异性抑制DKK-1过表达而重新激活Wnt/β-catenin信号通路,减少成脂基因PPAR-γ2的表达、增加成骨基因RUNX2的表达,抑制BMSC成脂分化,促进BMSC成骨分化。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨.方法 用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达, 判断感染效率;以四唑盐(MTT)实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶(ALP)活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异(P＞0.05);RT-PCR检测到BMP-7表达,在1 300 bp处出现特异性条带;ELISA检测24h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

插头框旋转录因子C2转染BMSCs后成骨作用的研究

[目的]观察过表达Foxc2基因对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨分化的影响。[方法]构建携带Foxc2和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒表达载体,分离、培养兔BMSCs,分别以Lenti-GFP(GFP组)、Lenti-Foxc2(Foxc2组)转染BMSCs,另设未转染BMSCs对照组。MTT法检测过表达Foxc2对细胞增殖能力;Western blot、Real time PCR检测转染后7d各组细胞Foxc2蛋白、m RNA表达;以及转染后1、2、4周各组细胞骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、一型胶原(COLⅠ)蛋白及m RNA表达;转染后2周,各组行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性检测。[结果]Foxc2组Foxc2 m RNA和蛋白高效表达;对照组、GFP组无Foxc2 m RNA及蛋白表达;MTT法检测示过表达Foxc2对BMSCs的增殖未产生显著影响;Foxc2组OCN、OPN、COLⅠm RNA和蛋白表达显著高于其他组(P<0.01),余组比较差异无统计学意义(P>0.05);Foxc2组ALP染色阳性区域大于其余两组;ALP活性显著高于其他各组(P<0.01)。[结论]过表达Foxc2不影响细胞增殖,可持续表达基因产物,并可促进BMSCs向成骨细胞分化。     

siRNA沉默HER2对人胰腺癌细胞PANC-1侵袭能力的影响

目的:探讨慢病毒介导的siRNA沉默HER2对人胰腺癌细胞株PANC-1侵袭能力的影响。方法:运用HER2基因小干扰RNA(siRNA)的重组慢病毒稳定转染PANC-1细胞,荧光定量RT-PCR和Western blotting观察HER2 mRNA和蛋白表达的改变,体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果:HER2基因小干扰RNA的重组慢病毒稳定转染PANC-1细胞可显著抑制HER2 mRNA和蛋白表达;体外侵袭实验显示siRNA沉默HER2后,PANC-1细胞侵袭能力明显下降。结论:HER2基因小干扰RNA的重组慢病毒能有效抑制HER2的表达,抑制胰腺癌细胞体外侵袭能力。siRNA沉默HER2可能为预防和治疗胰腺癌的侵袭转移提供一种新的策略。     

载基因脂多糖胺纳米囊泡诱导BMSCs定向成骨分化

目的制备并优化阳离子载体脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)性能,探讨其负载靶基因后体外诱导BMSCs定向成骨分化能力。方法采用接枝共聚的方法合成LNPs,探讨合成时不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0)对LNPs及LNPs/pBMP-2-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)复合物理化性能的影响;通过体外大鼠BMSCs细胞毒性及转染实验,筛选出具低毒高转染效能的LNPs,再用其负载pBMP-2-GFP基因转染大鼠BMSCs,通过定期观察细胞形态、测定细胞表达BMP-2蛋白水平和ALP活性、钙结节生成情况来评价LNPs/pBMP-2-GFP对BMSCs成骨分化的影响。结果 pH为8.5时合成的LNPs含氮量、粒径及zeta电位均低于其余pH值组,其细胞毒性最低(细胞成活率96.5%±1.4%)、转染效率最高(98.8%±0.1%)。BMSCs经LNPs/pBMP-2-GFP转染诱导处理后,在前4 d内,其BMP-2蛋白表达量均明显高于Lipofectamine2000(Lipo)/pBMP-2-GFP组、支链型聚乙烯亚胺25K/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05)。诱导后14 d其ALP活性高于Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05),与成骨诱导液处理组相当(P0.05);茜素红染色显示其和成骨诱导液处理组细胞出现明显钙结节,而Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组细胞出现凋亡、未见明显钙结节;诱导后21 d镜下观察见细胞中出现透明块状结节,呈成骨细胞形态特点。结论 pH为8.5时合成的LNPs具有低细胞毒性、高转染效率,能高效介导BMP-2基因转染大鼠BMSCs,并成功诱导BMSCs成骨定向分化,其成骨诱导效果与成骨诱导液处理相当。LNPs介导的基因转染可能是诱导干细胞定向分化的一种简便有效的手段。     

白茅苷对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞功能和骨量的影响

目的观察白茅苷治疗去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞功能和骨量的影响并初步探索可能机制。方法通过双侧去卵巢建立骨质疏松大鼠模型;随后随机分为假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)以及白茅苷组(BMG),每组10只;其中BMG组去卵巢大鼠每天给予白茅苷(20 mg/kg)灌胃治疗;待12周治疗结束后分离培养各组大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),使用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红(ARS)染色并使用蛋白质印迹检测BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1蛋白表达;进一步使用Micro-CT和骨生物力学检测观察治疗效果。结果 OVX组大鼠BMSCs向成骨细胞分化后ALP和ARS染色阳性面积以及BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表达较Sham组明显降低(P0.05);而经过BMG治疗,BMG组大鼠BMSCs向成骨细胞分化后ALP和ARS染色阳性面积以及BMP-2、Runx2、OPN、OCN、ALP和Col1表达较OVX组明显增加(P0.05)。OVX组股骨最大载荷和弹性模量、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th较Sham组明显降低,而Tb.Sp则明显升高(P0.05)。BMG组左侧股骨最大载荷和弹性模量、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显高于OVX组(P0.05),而Tb.Sp明显低于OVX组(P0.05)。结论白茅苷通过促进BMSCs诱导成骨分化来减少去卵巢大鼠骨骨密度、骨量和骨强度下降。