缺氧诱导因子1和缺氧诱导因子2在人类着床前胚胎的表达

目的研究缺氧诱导因子1(HIF-1)和缺氧诱导因子2(HIF-2)在人类着床前胚胎各个阶段的表达,探讨这两个氧调节基因在人类早期胚胎发育过程中的作用和意义。方法收集不育症患者捐赠的胚胎,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR分别定性和定量在5%和20%O2条件下体外培养的人胚胎的HIF-1α和HIF-2αmRNA。采用免疫荧光染色检测人胚胎的HIF-1α和HIF-2α蛋白。结果巢式RT-PCR分别检测了5%和20%O2体外培养的2、4、6、8细胞胚胎和囊胚发现,所有34个胚胎均表达HIF-1α和HIF-2αmRNA。实时荧光定量PCR5%O2培养的人囊胚HIF-1α与18SrRNA的Ct比值为(1.22±0.05);20%O2培养的人囊胚,这一比值是(1.02±0.07);两者比较差异显著(P<0.05)。人胚胎在体外常氧培养条件下的HIF-1αmRNA水平显著高于低氧培养。5%O2培养的人囊胚HIF-2α与18SrRNA的Ct的比值为(1.29±0.04);20%O2培养的人囊胚,这一比值是(1.19±0.11);两者比较无显著差异(P>0.05)。人胚胎在体外低氧培养条件下的HIF-2αmRNA水平与常氧培养无显著差异。5%和20%O2体外培养的2、4、6、8细胞,各个发育阶段人胚胎的HIF-1α和HIF-2α免疫荧光染色均阳性。结论研究结果显示人类着床前胚胎在体外常氧和低氧培养时均表达HIF-1α和HIF-2α。二者可能通过广泛的靶基因系统参与早期胚胎的生长发育和着床过程,在早期胚胎的调控可能不在转录水平,而在转录后水平。     

缺氧诱导因子1α调控wnt/β-catenin信号通路对常氧条件下大鼠髓核细胞衰老的作用及机制

【摘要】 目的：探究缺氧诱导因子1α（HIF-1α）调控wnt/β-catenin信号通路对常氧培养下大鼠髓核细胞衰老的影响及作用机制。方法：取5只4周龄雌性SD大鼠，提取鼠尾髓核原代细胞进行研究。（1）将髓核细胞分为5组：转染对照组[用磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理髓核细胞]、空载腺病毒组（用空载腺病毒处理髓核细胞）、过表达HIF-1α组（用载过表达HIF-1α质粒的腺病毒处理髓核细胞）、空载siRNA组（用空载siRNA处理髓核细胞）、敲减HIF-1α组（用siRNA敲减HIF-1α处理髓核细胞），在常氧下培养48h后，免疫蛋白印迹（western blot，WB）检测HIF-1α和衰老相关基因p53、p21、p16，β-gal染色检测细胞衰老，评估常氧条件下HIF-1α对于髓核细胞衰老的影响。（2）取髓核细胞，分为空载腺病毒组、过表达HIF-1α组、空载siRNA组、敲减HIF-1α组，处理方式同前，在常氧下培养48h后，WB检测HIF-1α、GSK-3β和β-catenin通路的表达。取髓核细胞，分为对照组（用PBS处理髓核细胞）、过表达HIF-1α组（用载过表达HIF-1α质粒的腺病毒处理髓核细胞）、XAV-939组（用XAV-939处理髓核细胞）、XAV-939+过表达HIF-1α组（用XAV-939+载过表达HIF-1α质粒的腺病毒处理髓核细胞），WB检测HIF-1α、p53、p21、p16和wnt/β-catenin的表达，β-gal染色检测细胞衰老，以检测HIF-1α与wnt/β-catenin信号通路的关系以及对髓核细胞衰老的影响。结果：（1）腺病毒转染HIF-1α后，与转染对照组和空载腺病毒组相比，过表达HIF-1α组HIF-1α表达增加（P<0.05）。小干扰RNA转染HIF-1α后，与转染对照组和空载siRNA组相比敲减HIF-1α组HIF-1α表达降低（P<0.05）。WB结果显示，与空载腺病毒组相比过表达HIF-1α组HIF-1α表达增加（P<0.05），而p53、p21和p16表达降低（P<0.05），与空载siRNA组相比敲减HIF-1α组HIF-1α表达降低（P<0.05），而p53和p16表达增加（P<0.05）。β-gal染色显示，在常氧条件下培养48h，与空载腺病毒组相比，过表达HIF-1α组衰老细胞降低（P<0.05），与空载siRNA组相比，敲减HIF-1α组衰老细胞数量则增加（P<0.001）。（2）与空载腺病毒组相比，过表达HIF-1α组β-catenin表达升高（P＜0.01），同时GSK-3β表达降低（P＜0.05）。与空载siRNA组相比敲减HIF-1α组β-catenin表达降低（P＜0.0001），同时GSK-3β表达升高（P＜0.05）。与对照组相比，XAV-939组β-catenin表达降低（P<0.001），p53、p21和p16的表达升高，XAV-939+过表达HIF-1α组β-catenin表达降低（P<0.05），p21表达升高（P<0.05）。与过表达HIF-1α组相比XAV-939+过表达HIF-1α组衰老细胞数增加（P<0.001），与对照组相比过表达HIF-1α组的细胞核内β-catenin表达更多，而XAV-939组和XAV-939+过表达HIF-1α组则相对较少（P<0.05）。结论：HIF-1α通过激活wnt/β-catenin信号通路抑制常氧条件培养下大鼠髓核细胞的衰老。     

缺氧时人肝癌细胞中乏氧诱导因为-1α、已糖激酶II表达及细胞周期调控的实验研究

目的探讨缺氧时肝癌细胞SMMC-7721中乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)、己糖激酶II(HKII)表达及对细胞周期调控机制的影响。方法人肝癌细胞SMMC-7721分成3组:缺氧12h组、缺氧24h组及对照组。缺氧组分别在缺氧条件下(37℃,5%CO2、2%O2饱和度)培养12h和24h,对照组置于正常氧浓度条件下(37℃,5%CO2、21%O2饱和度)培养24h。流式细胞仪检测细胞周期分布,免疫组织化学SP法检测HIF-1α表达,荧光定量PCR法检测HKIImRNA表达量。结果缺氧状态下细胞周期分析处于G0/G1期细胞百分比明显增多,处于G2/M期的细胞减少,并且可见到较明显的凋亡峰的形成,缺氧12h组、缺氧24h组的G0/G1期比例显著高于对照组(P<0.05);HIF-1α和HKII在两组缺氧组与对照组比较,其表达量明显增加(P<0.05),缺氧24h组与缺氧12h组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧导致细胞阻滞在G0/G1期,HIF-1α可刺激人肝癌细胞HKII表达的增加,以HIF-1α为药物靶点可望成为治疗肝癌的重要新方法。     

HIF-1α介导缺氧环境下肝癌Bel-7402细胞自噬的激活

目的:探讨缺氧环境肝癌细胞自噬的激活与H IF-1α的关系。方法:将肝癌B el-7402细胞分为常氧组、缺氧+C on sh R N A组和缺氧+H IF-1αsh R N A组,将慢病毒介导的H IF-1αsh R N A转染细胞,继续培养36 h,W estern blot检测H IF-1α蛋白表达;吖啶橙(A O)荧光染色检测自噬溶酶体的形成,丹酰尸胺(M D C)荧光染色检测自噬小体的形成,并应用流式细胞技术定量自噬溶酶体或者自噬小体的荧光强度;W estern blot检测自噬激活的标志蛋白LC 3-Ⅱ表达。结果:慢病毒介导的H IF-1αsh R N A降低了缺氧诱导的肝癌细胞中H IF-1α蛋白的生成(缺氧+H IF-1αsh R N A组vs缺氧+C on sh R N A组,P0.01),H IF-1α降低后,细胞中自噬小体及自噬溶酶体明显减少(缺氧+H IF-1αsh R N A组vs缺氧+C on sh R N A组,P0.01),自噬激活标志蛋白LC 3-Ⅱ明显减少(缺氧+H IF-1αsh R N A组vs C on sh R N A组,P0.01)。结论:缺氧环境下H IF-1α介导了肝癌细胞自噬的激活。     

缺氧诱导因子1α对缺氧条件下大鼠心肌细胞糖酵解的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对缺氧状态下大鼠心肌细胞糖酵解的影响。方法常规分离、培养大鼠心肌细胞,分为单纯缺氧组:使用无糖培养基在低氧混合气体(体积分数94%N2、5%CO2、1%O2)中培养;HIF-1α抑制组:先利用RNA干扰技术构建HIF-1α蛋白低表达的细胞模型,再作上述缺氧培养。两组细胞均设缺氧前(常规培养)及缺氧1、3、6、12、24h6个时相点,采用生物化学方法检测细胞中糖酵解关键酶己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性以及培养上清液中乳酸(LA)的含量。结果(1)HK、PFK活性:与缺氧前比较,两组心肌细胞两酶活性均呈先升高后下降的变化趋势。单纯缺氧组两酶活性峰值分别为(159±13)、(298±44)U/g.HIF-1α抑制组两酶活性在缺氧1、3、6h时均明显低于单纯缺氧组(P<0.05或0.01),其峰值分别为(133±55)、(188±55)U/g.(2)LDH活性、LA含量:与缺氧前(92±12)U/g比较,单纯缺氧组细胞LDH活性缺氧后显著升高,6h时达高峰(2568±125)U/g(P<0.01),随后逐渐下降;各时相点培养上清液中LA含量也成倍增加。HIF-1α抑制组细胞的LDH活性于缺氧3h时达峰值(2125±126)U/g,明显高于缺氧前(P<0.01);培养上清液中LA含量亦较缺氧前增高(P<0.01),但增幅较小。结论缺氧条件下大鼠心肌细胞中HIF-1α高表达是细胞糖酵解持续增强的直接原因,此为心肌细胞应对缺氧环境的重要内源性保护机制。     

低氧环境对椎间盘自发性吸收的影响及其作用机制

目的探讨低氧环境对椎间盘自发性吸收的影响及其作用机制。方法取SPF级成年日本大耳兔9只,雌雄不限,平均体质量2 kg。将兔处死后取脊柱髓核组织,经消化、分离、培养后获得传代髓核细胞,将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液。根据不同时效的低氧环境将细胞分为5组对照组(常氧浓度下培养6 h)、低氧6 h组(2%O2浓度下培养6 h)、低氧12 h组(2%O2浓度下培养12 h)、低氧24 h组(2%O2浓度下培养24 h)和低氧48 h组(2%O2浓度下培养48 h)。采用实时聚合酶链反应法检测缺氧诱导因子(HIF)-1α、3型酸敏感离子通道(ASIC3)及水通道蛋白3(AQP3)mRNA表达水平,采用流式细胞仪检测各组髓核细胞凋亡情况。采用SPSS 24.0软件对数据进行分析。结果与对照组比较,低氧各组细胞凋亡率均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);与低氧12、24和48 h组比较,低氧6 h组细胞凋亡率最高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。与对照组比较,低氧各组细胞HIF-1α和ASIC3 mRNA表达水平均明显上升,AQP3 mRNA表达水平均明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.01);与低氧12、24和48 h组比较,低氧6 h组HIF-1α和ASIC3 mRNA表达水平最高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论短时间低氧环境可以促进髓核细胞凋亡,从而加速椎间盘突出组织自发性吸收进程,其机制可能与HIF-1α和ASIC3的表达增加及AQP3的表达下降有关。     

PKD1基因对主动脉平滑肌细胞自噬的影响

目的阐明多囊肾病基因1(PKD1)对小鼠主动脉平滑肌细胞自噬的影响。方法构建PKD1基因的shRNA慢病毒干扰及PKD1基因促进剂ETS-1慢病毒过表达载体,转染小鼠主动脉平滑肌细胞,采用实时荧光定量核酸扩增(qPCR)检验干扰及过表达效率。同时通过qPCR及Western blotting检测对照组、shPKD1组及ETS-1组小鼠主动脉平滑肌细胞自噬标志分子Atg5、Beclin1和LC3的表达水平。结果与正常对照组相比,shPKD1组PKD1 mRNA表达量下降(P<0.05),而ETS-1组ETS-1 mRNA及PKD1 mRNA表达量明显升高(P<0.05)。与对照组相比,shPKD1组自噬标志物Atg5和Beclin1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),ETS-1组Atg5和Beclin1 mRNA表达水平明显升高(P<0.001)。与对照组相比,shPKD1组Atg5、Beclin1和LC3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),ETS-1组Atg5、Beclin1和LC3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论PKD1基因的表达能够影响小鼠主动脉平滑肌细胞自噬,即PKD1基因表达下调可抑制主动脉平滑肌细胞自噬,而PKD1基因过表达能够促进小鼠主动脉平滑肌细胞自噬。     

miR-21调节缺血缺氧诱导的大鼠肝卵圆细胞自噬的研究

目的探讨miR-21在缺血缺氧诱导的大鼠肝卵圆细胞自噬中的作用。方法体外培养肝卵圆细胞,慢病毒转染肝卵圆细胞构建稳定的细胞株,分别提取各组细胞RNA逆转录后行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测各组miR-21的表达,以转染好的稳定的细胞建立缺血缺氧模型,共分为3组:miR-21空载体慢病毒转染HOC自噬组,miR-21增强慢病毒载体转染HOC自噬组,miR-21-inhibition慢病毒载体转染HOC自噬组。Hoechst 33258染色观察细胞凋亡;应用丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色荧光定位法、观察各组细胞的自噬;免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达情况。结果与空载体组比,增强组miR-21基因水平表达增强,而MDC染色减弱(自噬减少),蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值减少;而抑制组miR-21基因水平表达减少,MDC染色增强(自噬增强),蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增多。结论抑制miR-21过表达可以增强缺血缺氧引起的肝卵圆细胞的自噬,有利于肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中稳定细胞内环境,维持细胞的存活。     

缺氧后处理和二氮嗪后处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧时钙网蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧后处理和二氮嗪后处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧时钙网蛋白(CRT)表达的影响.方法 健康雄性SD大鼠,4～5月龄,分离心肌细胞,培养18 h后,随机分为6组(n=8):对照组(C组)、缺氧复氧组(HR组)、缺氧后处理组(HP组)和二氮嗪后处理组(DP组).C组细胞于5%CO2培养箱内继续培养2 h;HR组细胞于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧45 min,然后于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h;HP组细胞于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧45 min,然后复氧3 min,缺氧3 min,重复3次,再于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h;DP组细胞于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧45 min,然后给予50 μmol/L二氮嗪处理10 min,再于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h.测定心肌细胞caspase-3活性、CRT表达和游离钙离子浓度.结果 与C组比较,其余各组caspase-3活性升高,HP组和DP组CRT表达上调,HR组游离钙离子浓度升高(P＜0.05或0.01);与HR组比较,HP组和DP组caspase-3活性降低,CRT表达上调,游离钙离子浓度降低(P＜0.01).结论 缺氧后处理和二氮嗪后处理可上调CRT的表达,减轻细胞内钙超载,减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤.     

急性缺血缺氧诱导肝癌细胞自噬及其相关机制

目的:研究急性缺血/缺氧时肝癌细胞HepG2增殖率及自噬的变化,探讨自噬的作用及机制。方法 :以Western印迹法检测缺氧诱导因子-1(hypoxia induced factor-1,HIF-1)表达并确定体外模拟模型的可靠性;吖啶橙染色后采用荧光显微镜定性观察自噬;以自噬特异性蛋白LC3及P62(P62/SQSTM1)信号蛋白的变化表明自噬的诱导和可能的调控机制;以CCK8检测3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬前后急性缺血/缺氧下HepG2细胞的增殖率变化。结果:急性缺血/缺氧2 h后,HepG2细胞显著表达HIF-1α蛋白,表明体外急性缺血/缺氧模型的可靠性。急性缺血/缺氧可快速诱导肝癌细胞HepG2产生自噬,继而出现HepG2细胞显著增殖活跃;3-MA抑制自噬后,可特异性抑制急性缺血/缺氧所诱导的HepG2细胞增殖;急性缺血/缺氧条件下HepG2细胞P62信号蛋白表达显著下调,自噬抑制后逐渐恢复正常表达水平。结论:自噬在肝癌体外急性缺血/缺氧过程中对肿瘤起到保护作用,其机制可能与P62蛋白的清除有关;抑制自噬可显著降低肝癌细胞增殖率。自噬可能成为肝癌治疗的新靶点。     

缺氧诱导因子-1α在去势前后大鼠腹叶前列腺中表达的变化

目的探讨与缺氧相关的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是否参与去势后前列腺萎缩过程.方法24只SD大鼠分为3组,其中A组(n=8)为假手术对照组,B组(n=8)为去势组,C组(n=8)为雄激素替代组(去势后肌注十一酸睾酮50mg/kg);术后3天处死,通过半定量RT-PCR检测与HIF-1α在去势前后前列腺表达变化.结果去势后大鼠前列腺的体积萎缩变小;雄激素替代组出现前列腺增生变大;对照组正常的大鼠前列腺有HIF-1 α mRNA低水平表达,去势组HIF-1α mRNA表达量增加,雄激素替代组HIF-1αmRNA表达量减少,与正常对照组比较,去势组的HIF-1α mRNA的表达量显著增加(P＜0.05),雄激素替代组的HIF-1αmRNA的表达量显著减少(P＜0.01).结论前列腺组织的缺氧参与去势后大鼠前列腺的早期萎缩过程.     

丙泊酚对缺氧诱导的大鼠肺泡上皮Ⅱ型细胞凋亡的调控作用

目的 探讨丙泊酚预处理对缺氧条件下大鼠Ⅱ型肺泡七皮(ATⅡ)细胞凋亡的影响.方法 体外分离并培养大鼠ATⅡ细胞,将细胞分为三组:缺氧组(H组)、丙泊酚-缺氧组(P组)和对照组(C组).测定各组细胞存活率、早期凋亡率、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA及Bnip3LmRNA 表达水平.结果 与C组比较,H组和P组细胞存活率显著降低(P＜0.05)、早期凋亡率显著升高(P＜0.05),HIF-1α mRNA及Bnip3LmRNA表达显著增强(P＜0.05).与H组比较,P组上述指标显著降低(P＜0.05).结论 丙泊酚预处理可抑制缺氧条件下大鼠ATⅡ细胞凋亡,推测其与丙泊酚-HIF-1α-缺氧反应元件(HRE)轴的抑制有关.     

低氧通过HIF-1α调控髓核细胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达

目的观察低氧环境及低氧诱导因子1α(HIF-1α)对髓核细胞中解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)-4和ADAMTS-5启动子活性的影响,探讨可能影响椎间盘退变的分子机制。方法将体外培养的大鼠髓核细胞分别置于常氧和低氧(1%O2)培养箱培养,采用蛋白质印迹分析及PCR方法检测细胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达。对获取的ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子片段测序,并使用JASPAR数据库分析其中是否存在HIF-1α的结合位点。将HIF-1α过表达质粒、PGL3-ADAMTS-4质粒和PGL3-ADAMTS-5质粒转染至大鼠髓核细胞中,用双荧光素酶报告基因检测系统检测髓核细胞中HIF-1α对ADAMTS-4和ADAMTS-5基因启动子的调控作用。结果蛋白质印迹分析和PCR结果显示,低氧分别在蛋白质水平和m RNA水平抑制髓核细胞中ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达。使用JASPAR软件分析后,发现ADAMTS-4启动子中可能包含1个HIF-1α的结合位点,而ADAMTS-5启动子中可能包含2个HIF-1α的结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示,HIF-1α的过表达能够显著抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5启动子活性。结论低氧可能通过HIF-1α抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达,保持椎间盘内环境的稳态,延缓椎间盘退变的发生。     

B淋巴细胞瘤-2蛋白多位点磷酸化在大鼠脊髓损伤后细胞自噬中的表达研究

目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后细胞自噬的变化及其与B淋巴细胞瘤-2(Bcell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白多位点磷酸化的关系。方法取40只8周龄雄性SD大鼠,采用改良Allen法制备SCI模型;将造模成功的36只大鼠随机分为SCI组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组,每组12只。另取12只大鼠仅切除椎板、不损伤脊髓,作为假手术组。造模结束后,自噬抑制剂组及自噬促进剂组分别于脊髓鞘内注射20μL600 nmol/L 3-甲基腺嘌呤、25 nmol/L雷帕霉素,假手术组及SCI组仅注射20μL生理盐水;每天1次,连续4周。造模后1 d及1、2、4周,采用BBB评分法评价各组大鼠后肢运动功能。末次注射后24 h处死各组大鼠并取脊髓组织,ELISA法检测脊髓组织中过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性及TNF-α、IL-1β水平;HE染色观察脊髓组织形态学变化;透射电镜观察脊髓组织中线粒体超微结构变化;免疫荧光染色检测自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)蛋白表达;TUNEL染色观察脊髓组织神经细胞凋亡;免疫荧光双染检测LC3/TUNEL阳性细胞表达;Western blot检测细胞Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Bcl-2及p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达。结果与假手术组相比,SCI组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;神经细胞周围间隙增大,细胞肿胀、出现空泡,线粒体中出现自噬小体;Beclin1及LC3蛋白阳性率、神经细胞凋亡率显著升高;LC3、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低;以上指标比较差异均有统计学意义(P0.05)。与SCI组相比,自噬抑制剂组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;线粒体中出现少量自噬囊泡;Beclin1及LC3蛋白阳性率降低,神经细胞凋亡率显著升高;LC3阳性细胞减少、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低。而自噬促进剂组结果与自噬抑制剂组相反;以上指标组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论大鼠SCI后通过诱导细胞自噬可降低神经细胞凋亡,保护脊髓功能,其机制可能与抑制Bcl-2蛋白多位点磷酸化有关。     

大鼠增龄过程中髓核组织Beclin-1和微管相关蛋白轻链3的表达及其意义

目的 探讨在增龄过程中SD大鼠髓核组织中Beclin-1和微管相关蛋白轻链3(MAPLC3)的表达及其意义.方法 3个月龄、12个月龄、24个月龄SD大鼠各8只,建立青年组、中年组和老龄组大鼠模型,苏木素-伊红(HE)染色检测椎间盘组织的退变;透射电镜检测髓核细胞中自噬体的表达;免疫组织化学染色和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定髓核组织中Beclin-1和MAPLC3的表达.结果 大鼠增龄过程可较好地体现椎间盘的退变变化;不同年龄组大鼠髓核细胞中均有自噬体的表达;Beclin-1和MAPLC3在不同年龄组SD大鼠髓核细胞中均有表达(0.42±0.05,0.47±0.06,0.52±0.05;0.34±0.06,0.39±0.05,0.46±0.09),且老龄组表达均较青年组高(P<0.01).Beclin-1和MAPLC3 mRNA在不同年龄组SD大鼠髓核组织中均有表达(0.86±0.12,0.93±0.14,1.01±0.13;1.09±0.06,1.15±0.07,1.33±0.11),且老龄组表达较青年组表达明显增高(分别为P<0.05和P<0.01).结论 自噬存在于椎间盘退变过程中,且MAPLC3与Beclin-1在椎间盘退变过程中的表达增加,提示自噬活性的增加可能与椎间盘退变的发展进程有关.     

缺氧及沉默缺氧诱导因子-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因表达的影响

目的 观察缺氧及应用小干扰RNA (siRNA)沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因对胰腺癌细胞株BxPC-3中RUNX3基因表达的影响.方法 构建人RUNX3基因真核表达载体质粒pEGFP-RUNX3,CoC12化学模拟肿瘤缺氧环境,检测缺氧以及siRNA沉默HIF-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因在mRNA和蛋白水平的影响.结果 缺氧能使BxPC-3细胞中RUNX3基因的表达较常氧时显著升高[表达为(9.13±1.55),P＜0.05],siRNA转染BxPC-3细胞后能显著下调HIF-1α蛋白表达(抑制率90％),并导致RUNX3基因的表达也受到明显抑制.结论 缺氧促使BxPC-3细胞中HIF-1α在蛋白水平表达升高,缺氧时HIF-1α能上调RUNX3基因的表达水平.     

低氧环境下共培养的骨膜细胞和髓核细胞骨向分化能力的研究

[目的]探讨低氧环境对体外共培养的骨膜细胞、髓核细胞骨向分化能力的影响。[方法]采用组织块法分离兔骨膜细胞,胰酶、胶原酶消化法获取髓核细胞,传至3代进行共培养实验,实验分为2组:正常氧组(20%O2)、低氧组(5%O2),共培养后用CCK-8检测细胞增殖情况,用AKP试剂盒、BCA试剂盒检测碱性磷酸酶活性,RT-PCR检测骨钙素、Ⅰ型胶原、RUNX2以及HIF-1a mRNA的表达,免疫组化试剂盒检测Ι型胶原的表达,茜素红染色检测钙盐沉积或钙结节。[结果]骨膜细胞和髓核细胞在体外成功分离和培养,共培养后保持了较高的增殖率,经过成骨诱导培养后成功诱导为成骨细胞,细胞增殖曲线为"S"型,两组在1、3、5、7、9 d的光吸收值(OD)比较差异有统计学意义(P0.05);低氧组的骨钙素、Ⅰ型胶原、RUNX2以及HIF-1a mRNA表达水平高于常氧组(P0.05),碱性磷酸酶(ALP)活性高于常氧组(P0.05),细胞成骨染色(茜素红染色、免疫组化)结果显示低氧组较常氧组表达增多。[结论]低氧条件下体外共培养的骨膜细胞和髓核细胞经成骨诱导后向成骨细胞分化的能力更强。     

异丙酚预先给药对缺氧诱导胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响

目的 评价异丙酚预先给经对缺氧诱导胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响.方法 体外分离、培养SD胎鼠的肺泡Ⅱ型上皮细胞,接种于96孔培养板,细胞浓度为1×106/L,每孔180μl,随机分为3组(n=72),正常对照组(C组)常氧培养,缺氧组(H组)和异丙酚-缺氧组(P-H组)缺氧(5%O2)培养,P-H组于缺氧前1 h加入异丙酚(终浓度为5μmol/L).分别于缺氧3、12、24或48 h时测定细胞凋亡率、缺氧诱导因子-1α(HIF-lα)mRNA、Bnip3L mRNA、HIF-lα蛋白和Bnip3L蛋白的表达水平.结果 与C组比较,H组细胞凋亡率升高,HIF-lα mRNA、Bnip3L mRNA及其蛋白表达水平上调(P＜0.05).异丙酚预先给药可抑制缺氧诱导的上述改变(P＜0.05).结论 异丙酚预先给药可抑制缺氧诱导胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡,其机制与抑制HIF-1的激活,从而下调Bnip3L蛋白表达有关.     

六味地黄丸含药血清通过诱导自噬对氧化应激状态下成骨细胞增殖的影响

目的 观察六味地黄丸含药血清对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞增殖、活性氧及自噬水平的影响。方法 用过氧化氢(H₂O₂)模拟氧化应激状态后采用不同浓度的六味地黄丸含药血清干预MC3T3-E1细胞，CCK-8法检测细胞增殖情况；通过细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测细胞ROS水平；qRT-PCR检测自噬相关基因Beclin 1、LC3B mRNA表达情况；蛋白印迹法检测自噬相关蛋白Beclin 1、LC3B表达情况。结果 (1)CCK-8结果显示，H₂O₂会抑制成骨细胞的增殖，当其浓度为0.10 mmol/L时具有相对较小程度的抑制增殖效果；六味地黄丸含药血清可以促进氧化应激状态下成骨细胞的增殖，且当体积浓度为20%时促进增殖的效果最好。(2)细胞活性氧检测结果显示，六味地黄丸含药血清组ROS水平降低(P<0.05)。(3)qRT-PCR结果显示，六味地黄丸组Beclin 1、LC3B mRNA表达上调(P<0.05),且该作用会被自噬抑制剂所抑制...     

仙茅苷调节lncRNA MEG3/miR-181a-5p通路对骨质疏松大鼠成骨细胞自噬的影响

目的 探讨仙茅苷（Curculigoside，CUR）对骨质疏松症（osteoporosis，OP）大鼠成骨细胞自噬的影响以及对lncRNA MEG3/miR-181a-5p信号轴的调节作用。方法 体外培养骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）诱导成骨细胞分化，CCK-8法筛选CUR浓度；数据库预测lncRNA MEG3与miR-181a-5p结合位点；利用转染技术将BM-MSCs细胞分为NC组、CUR组、CUR+3-MA组、CUR+pc-NC组和CUR+pc-LncRNA MEG3组，qRT-PCR检测lncRNA MEG3、miR-181a-5p的表达水平，碱性磷酸酶（ALP）染色法检测细胞ALP活性，MDC法检测细胞自噬体数量，免疫荧光检测细胞微管相关蛋白1-轻链3（LC3）、自噬效应蛋白（Beclin1）的表达。肌肉注射地塞米松磷酸钠建立OP大鼠，大鼠分为对照组（CT组）、模型组（OP组）、OP+CUR组（灌胃15 mg/kg CUR），CT检测大鼠胫骨骨形态学，Western blot和qRT-PCR分别检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1与lncRNA MEG3、miR-181a-5的表达。结果 25 μg/mL以上浓度的CUR显著提高BM-MSCs细胞增殖活力（P＜0.05）；lncRNA MEG3与miR-181a-5p具有靶向结合位点；与NC组相比，CUR组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达增加（P＜0.05）；与CUR组相比，CUR+3-MA组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达减少（P＜0.05）；与CUR+pc-NC组相比，CUR+pc-LncRNA MEG3组细胞ALP活性、自噬体数量以及LC3、Beclin1表达减少（P＜0.05）。OP组大鼠骨形态学评价以及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、miR-181a-5p表达较CT组下降，lncRNA MEG3表达增加（P < 0.05）；OP+ CUR组大鼠骨形态学评价以及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、miR-181a-5p表达较OP组增加，lncRNA MEG3表达降低（P＜0.05）。结论 CUR可能通过调节LncRNA MEG3/miR-181a-5p信号轴促进OP大鼠成骨细胞自噬活性。