日本血吸虫组织蛋白酶L2基因扩增及克隆

目的　体外扩增日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L2 (SjCL2 )的编码区基因序列 ,将其克隆到真核表达质粒pcDNA3中 ,为进一步对其进行功能研究奠定基础。方法　用TRIZOL分离日本血吸虫成虫RNA ,RT -PCR扩增目的基因 ,将扩增产物定向克隆到真核表达载体 pcDNA3中。 结果　RT -PCR特异性扩增出SjCL2编码区基因序列 ,其片段大小为1kb左右 ,经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pcDNA -SjCL2中含有所扩增的基因序列。 结论　RT -PCR扩增的SjCL2编码区基因序列与预期长度相符合 ,成功构建了含SjCL2编码区基因的真核表达质粒pcDNA -SjCL2。     

日本血吸虫大陆株脂肪酸结合蛋白SjFABPc编码区基因的体外扩增及克隆

目的体外扩增日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白（SjFABPc）抗原的编码区基因序列,将其克隆到真核表达质位pcDNA3中,为进一步对其进行核酸疫苗研究奠定基础。方法特定寡核苷酸引物的设计与合成;异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离日本血吸虫成虫RNA,RT－PCR扩增目的基因;分子克隆常规操作将扩增产物亚克隆至中间载体pUC18中,然后走向克隆到真核表达载体pcDNA3中。结果RT－PCR特异性扩增出SjFABPc编码区基因序列,其片段大小为440hp;经酶切、PCR鉴定表明所构建的质粒pUC－SjFABPc和pCD－SjFABPc中含有所扩增的基因序列。结论RT－PCR扩增的SjFABPc抗原编码区基因序列与预期长度相村合;成功地构建了含目的基因的真核表达质粒pCD－SjFABPc。从而,为进一步对其进行DNA免疫系列研究工作奠定了基础。     

日本血吸虫钙磷蛋白基因的克隆、表达及其进化分析

目的 克隆和表达日本血吸虫钙磷蛋白基因，纯化表达产物。 方法 从日本血吸虫cDNA文库中挑出钙磷蛋白基因进行体外扩增，将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-28a中进行表达，组氨酸标签亲和柱层析法纯化表达产物，并用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫原性。然后用生物信息学方法对其结构域和功能作用位点进行分析和预测，并绘制该蛋白的进化树。 结果 构建了重组原核表达载体，并在大肠埃希菌中获得了表达。纯化的重组蛋白可以被日本血吸虫感染的兔血清识别。经生物信息学分析发现该基因的编码蛋白含有4个EF手型（exchange factor hand，EF-hand）功能结构域，另外具有3种潜在的功能作用位点，即2个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪蛋白激酶II磷酸化位点和1个N-肉豆蔻酰化位点，属于II型（type-II）钙磷蛋白。 结论 日本血吸虫钙磷蛋白基因编码蛋白为钙结合蛋白，有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

日本血吸虫卵壳蛋白前体基因Sj423的克隆表达及分析

据日本血吸虫菲律宾株编码卵壳前体蛋白的一段230bp的序列设计PCR引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出日本血吸虫中国大陆株相应的基因片段、然后根据测序结果设计一系列引物,用5’RACE和3’RACE法扩增出该基因cDNA的5’和3’端,再根据测序结果设计全长引物,用RT-PCR方法扩增出大小为423bp的片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株卵壳前体蛋白基因的完整阅读框,对相应基因组区段测序证实该基因没有内含子(GenBank登录号:AF519182)。将其克隆到表达载体pET28c(+)中,在大肠杆菌中获得表达,融合表达产物分子量约为20.9 kD。Real-ti me PCR结果显示该蛋白在尾蚴感染宿主后第23d即卵壳形成时高表达。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和表达

目的　克隆和表达日本血吸虫大陆株原肌球蛋白 (tropomyosin ,TM)编码基因。方法　应用RT PCR方法体外扩增日本血吸虫原肌球蛋白编码基因 ,并采用T载体对该PCR产物直接进行克隆并用于核苷酸序列的测定。将目的基因亚克隆入原核表达载体pQE30 ,以IPTG诱导重组原肌球蛋白的表达。结果　PCR扩增产物约 82 3bp ,符合预计大小 ,并成功地克隆入T载体 ,对其中一克隆pGSjcTM12的插入片段的核苷酸序列分析表明 ,该序列和推测的氨基酸序列与曼氏血吸虫原肌球蛋白基因分别有 91 1%和 98 1%的同源性。该编码基因亚克隆入原核表达载体pQE30获得高效表达 ,分子量约 32kDa,并能被日本血吸虫天然原肌球蛋白免疫血清特异识别。结论　日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和原核表达成功。     

日本血吸虫潜在药物靶点β-碳酸酐酶的表达与鉴定

目的原核表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)潜在的药物靶点β-碳酸酐酶(β-CA)并测定其催化活性。方法根据β-CA保守序列,在日本血吸虫基因组中鉴定β-CA序列,核酸序列全合成后将其导入原核表达系统进行融合表达。SDS-PAGE及Western blotting鉴定表达蛋白后,采用Ni亲和层析方法纯化目的蛋白,并测定碳酸酐酶活性。结果c DNA序列Sjp_0056790.1具有β-CAs的保守序列;成功将该核酸序列导入重组表达载体p ET-32a(+)-Sja CA中;SDSPAGE和Western blotting检测结果显示融合蛋白分子量大小约为38 k Da;碳酸酐酶活性测定结果显示该蛋白具有碳酸酐酶活性,且该活性受乙酰唑胺抑制。结论 Sjp_0056790.1编码日本血吸虫β-CA,本研究成功表达了具有催化活性的日本血吸虫的β-CA,为后续的药物筛选奠定了基础。     

日本血吸虫10.6 kDa膜蛋白基因的克隆及表达

目的　寻找新的预防日本血吸虫感染疫苗候选分子。　方法　用具保护性的抗血吸虫膜单抗及免疫血清筛选日本血吸虫 c DNA文库 ,PCR扩增 c DNA插入片段 ,A - T连接法将筛选获得的 3个基因片段克隆到p GEM- T载体上 ,自动测序仪测序 ,序列送 BL AST基因服务站进行同源性分析。重新设计引物扩增编号为 B8克隆的开放阅读框碱基序列 ,先将其克隆入 p GEM- T载体质粒 ,再定向亚克隆入 p BK- CMV表达质粒 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE和 Western blotting分析表达产物。　结果　经双酶切及 PCR法均证实基因重组成功。其特异性表达产物约为 10 .6 k Da蛋白抗原。表达产物可被免疫血清及单抗识别。　结论　构建了编码日本血吸虫 10 .6k Da蛋白基因表达克隆。     

日本血吸虫大陆株粘蛋白样蛋白部分基因的克隆

目的构建日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白(SjMLP)核酸疫苗。方法分子克隆常规操作将扩增产物 SjMLP 编码区基因序列克隆至载体 pUCm-T 中,然后亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1( )中。结果经酶切、PCR 及测序鉴定表明所构建的质粒 pUCm-T/SjMLP 和 pcDNA3.1( )/SjMLP 中含有所扩增的基因序列。结论成功地构建了含目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1( )/SjMLP,从而,为进一步对其进行 DNA 免疫系列研究工作奠定了基础。     

日本血吸虫潜在药物靶点β?碳酸酐酶的表达与鉴定 张聪慧，朱淮民*

目的 目的 原核表达日本血吸虫 （Schistosoma japonicum） 潜在的药物靶点β?碳酸酐酶 （β?CA） 并测定其催化活性。 方法 方法 根据β?CA保守序列, 在日本血吸虫基因组中鉴定β?CA序列, 核酸序列全合成后将其导入原核表达系统进行融合 表达。SDS?PAGE及Western blotting鉴定表达蛋白后, 采用Ni亲和层析方法纯化目的蛋白, 并测定碳酸酐酶活性。 结 结 果 果 cDNA序列Sjp_0056790.1具有β?CAs的保守序列; 成功将该核酸序列导入重组表达载体pET?32a （+） ?SjaCA中; SDS? PAGE和Western blotting检测结果显示融合蛋白分子量大小约为38 kDa; 碳酸酐酶活性测定结果显示该蛋白具有碳酸酐 酶活性, 且该活性受乙酰唑胺抑制。 结论 结论 Sjp_0056790.1编码日本血吸虫β?CA, 本研究成功表达了具有催化活性的日 本血吸虫的β?CA, 为后续的药物筛选奠定了基础。     

日本血吸虫四跨膜蛋白6编码基因的克隆、表达与鉴定

目的 为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Tsp6样融合蛋白。 方法 设计特异性引物,PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Tsp6样蛋白基因编码基因序列,T载体连接,再将其亚克隆入pET28a(+)表达载体,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21中,并用IPTG对该重组菌诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。 结果 PCR法扩增出一条大小约为702bp大小的Sj-Tsp6样蛋白的DNA片断,将目的基因转入表达质粒pET28a(+),经SDS-PAGE可见一条约28kDa大小的带有HIS标签的融合蛋白条带,此蛋白可被血吸虫病兔血清所识别。 结论 本实验成功克隆日本血吸虫Sj-Tsp6 样抗原的编码基因,并在原核细胞中进行表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素基因表达及溶血活性检测

目的为了进一步研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)α-溶血素(Hla)的分子致病机理及其抗原性,对S.aureusHla进行了表达纯化。方法用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureuswood46株中扩增出hla基因,将该基因经BamHI和SalI双酶切后克隆到表达载体PET-32a中,获得重组质粒pET-32a(+)/hla,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,然后进行纯化和用溶血试验检测其活性。结果扩增的hla基因序列与已发表的hla基因序列同源性为100%,构建的重组表达质粒pET-32a(+)/hla在E.coliBL21(DE3)中得到表达,重组α-溶血素蛋白为53kDa,纯化后的溶血活性为5000HU。结论成功表达并获得了有活性的重组Hla蛋白。     

Sj28GST基因克隆和高效表达产物的纯化

目的　从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中克隆 2 8kDa谷胱甘肽 -S -转移酶 (Sj2 8GST)基因 ,获得用于疫苗和T细胞表位研究的高纯度重组融合蛋白 2 8GST -TRX。方法　应用引物特异性PCR技术 ,从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中扩增Sj2 8GST基因 ,经琼脂糖凝胶电泳结合碱基序列分析鉴定后 ,采用定向克隆技术构建Sj2 8GST -TRX融合蛋白重组表达载体并诱导其在大肠杆菌BL2 1(DE3)的表达 ,用Western -blotting测定以融合蛋白方式表达的Sj2 8GST的免疫原性 ,通过包涵体纯化结合Ni+柱亲和层析获得高纯度重组融合蛋白。结果　Sj2 8GSTPCR产物为约 6 4 0bp ,其碱基序列 (6 33bp)和推导的氨基酸序列 (2 11aa)与GenBank报道一致 ;获得了Sj2 8GST -TRX重组质粒 ;2 8GST -TRX融合蛋白在大肠杆菌以包涵体形式高效表达 ;在分子量为约 4 3kDa处有一能与羊抗Sj2 8GST抗体产生特异性反应的含 2 8GST融合蛋白条带 ;包涵体纯化法结合Ni+ 亲和层析可获得高纯度的重组融合蛋白。结论　获得到了日本血吸虫中国大陆株 2 8GST分子的全长基因和高纯度重组 2 8GST -TRX融合蛋白 ,该融合蛋白具有天然Sj2 8GST免疫原性。     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达质粒的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌glcB基因原核表达工程株,并进行表达、纯化。方法用PCR 扩增结核分枝杆菌glcB基因, 并克隆入pTA2质粒。测序正确后, 再亚克隆入pET30a(+)质粒, 构建pET30a(+):glcB重组体,转化宿主菌大肠埃希菌BL21 (DE3)。结果结核分枝杆菌glcB基因工程株经0.4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,表达出相对分子质量为92kD重组蛋白。SDS-PAGE 分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中, 表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA 柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌glcB基因工程表达株,并获得GlcB重组蛋白, 为研究新型血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白基因的克隆 表达与功能分析

目的 目的 克隆、 表达日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白 （SjHMGB1）, 并研究其功能特性。方法 方法 利用逆转录PCR （RT?PCR） 技术从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增出编码SjHMGB1的完整开放阅读框DNA片段, 然后将其亚克隆至 原核表达载体质粒pET28a （+） 中, 构建重组表达质粒SjHMGB1?pET28a。将重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21 （DE3）, 含 重组质粒的转化子细菌经异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导以表达重组SjHMGB1蛋白。通过镍螯合琼脂糖亲和胶亲和层 析法制备纯化的重组SjHMGB1蛋白。通过DNA迟滞实验和动物免疫鉴定重组SjHMGB1的DNA结合和免疫学特性。通 过免疫印迹试验 （Western blotting） 和RT?PCR确定SjHMGB1分子在日本血吸虫不同发育阶段的表达情况。以重组SjH? MGB1为抗原免疫小鼠, 3次免疫后每只小鼠感染45±2条血吸虫尾蚴, 42 d后剖杀, 计算减虫率与减卵率, 观察其诱导抗血 吸虫感染的免疫保护性作用。 结果 结果 采用RT?PCR法从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增到长度约为530 bp的特异性 DNA条带, 序列分析证实为编码SjHMGB1蛋白的开放阅读框序列。将此片段亚克隆至表达质粒pET28a （+） 中, 成功构建 了重组表达质粒SjHMGB1?pET28a。含重组表达质粒SjHMGB1?pET28a的转化子细菌经IPTG诱导能表达分子量约28 kDa 的可溶性SjHMGB1蛋白。采用镍螯合亲和层法制备了纯化的重组SjHMGB1蛋白。DNA迟滞试验显示纯化的Sj HMGB1 蛋白可同超螺旋及线性DNA结合, 重组SjHMGB1免疫小鼠能产生高效价的抗体IgG, Western blotting分析证实重组SjH? MGB1蛋白能被重感染小鼠血清所识别, 表明重组表达的SjHMGB1分子具有天然蛋白的功能活性与免疫学特性。RT?PCR 和Western blotting分析显示SjHMGB1分子在血吸虫成虫和虫卵期大量表达, 而在尾蚴阶段表达量极低。免疫保护性试验 结果表明, 重组SjHMGB1分子免疫不能诱导有效的抗血吸虫感染免疫保护性作用。结论 结论 获得了编码SjHMGB1基因和 纯化的具有天然功能活性的重组SjHMGB1蛋白; 重组SjHMGB1蛋白具有强烈的免疫原性, 但不能诱导有效的抗血吸虫感 染免疫保护性作用。     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶重组质粒的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)重组质粒pET32α-Sj26GST,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建pET32α-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot 对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET32α(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为49×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了pET32α-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

日本血吸虫泛素活化酶E1基因的克隆、表达及鉴定

目的扩增并表达日本血吸虫泛素活化酶E1蛋白。方法利用PCR技术得到E1基因序列,并将其克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21株,IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹(Western blot-ting)分析表达产物与鉴定其免疫反应性。结果SjE1基因开放阅读框长651bp,编码217个氨基酸残基,Western blotting分析结果表明,纯化的SjE1蛋白能被疫区居民血吸虫抗体阳性者血清、急性及慢性及晚期血吸虫病患者血清识别,与健康人血清无反应。结论日本血吸虫蛋白基因SjE1在体外获得表达,其表达蛋白具有一定的抗原性。     

日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶的重组表达及其在血吸虫生活史各阶段的表达分析

目的 目的 在大肠杆菌中原核表达、 纯化日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶 （rSjFBPA）, 观察其在血吸虫生活史各阶段 的表达。方法 方法 以日本血吸虫成虫cDNA为模板扩增rSjFBPA基因, 克隆至pET28a （+） 质粒后, 再转化入E. coli BL21。 含重组质粒的菌株经IPTG诱导后, 采用SDS?PAGE和Western blotting分析鉴定重组蛋白rSjFBPA是否表达, 用层析法纯 化rSjFBPA并用SDS?PAGE鉴定其纯度。同时, 用RT?PCR方法分析SjFBPA在血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段的表 达情况。结果 结果 经PCR扩增出目的基因, 含目的基因的TA克隆质粒经双酶切和测序鉴定, 证明插入片段与预期目的基 因序列相符。Western blotting结果显示, 表达后的重组蛋白可与His?tag单克隆抗体发生特异性反应。经镍亲和层析法 制备了纯化的重组SjFBPA蛋白, 纯化重组蛋白浓度达4 mg/ml。RT?PCR结果显示, SjFBPA在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成 虫和虫卵阶段均有表达。 结论 结论 SjFBPA基因被成功克隆和表达, 其在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段均有表 达。     

日本血吸虫TβRII样基因胞外段的克隆、表达及初步鉴定

目的获得日本血吸虫TGF-β受体II(TβRII)样基因的cDNA完整序列,克隆、原核表达其胞外段蛋白序列,并进行初步免疫学分析。方法应用RACE方法获得SjTβRII样基因cDNA全长序列,构建其胞外段(即N端)原核表达载体,在大肠埃希菌中IPTG诱导表达,表达产物行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。纯化重组蛋白并免疫大鼠制备抗血清,应用Western Blotting方法初步鉴定重组蛋白。结果获得日本血吸虫SjTβRII样基因的cDNA全长序列,为2283bp,编码760个氨基酸,其中胞外段长531bp,编码177个氨基酸。构建的重组质粒在大肠埃希菌中成功表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性和抗原性。结论首次获得日本血吸虫TβRII样基因的cDNA全长序列,其胞外段可在原核表达系统中获得具有免疫原性和抗原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫VCP基因的克隆表达及其在不同生活史期的mRNA表达水平

目的 目的 从原核表达日本血吸虫含缬酪肽蛋白 （VCP） 基因, 并分析其在不同生活史期的mRNA表达水平。方法 方法 提取日本血吸虫虫卵RNA, 逆转录为cDNA, PCR扩增日本血吸虫VCP基因, 亚克隆至原核表达载体pET15b; 重组质粒转 化入E. coli BL21, 异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导目的基因表达, 并采用包涵体纯化方法获取重组蛋白, 产物行十二烷基 硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS?PAGE） 进行分析鉴定。提取日本血吸虫尾蚴、 童虫、 雌虫、 雄虫、 虫卵RNA, DNase消化, 纯化后逆转录为cDNA, 采用荧光实时定量PCR分析VCP基因在上述生活史期的表达水平。结果 结果 PCR扩增获得日本血 吸虫VCP基因, 经重组质粒表达和包涵体纯化成功获得重组蛋白。荧光实时定量PCR检测发现, 日本血吸虫VCP基因在 尾蚴中的mRNA表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。结论 结论 获得日本血吸虫VCP基因编码的重组 蛋白; 日本血吸虫VCP基因mRNA在尾蚴阶段表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。。