组织贴块法人的支气管上皮细胞的原代培养

目的 通过组织贴块法建立人的支气管上皮细胞原代培养的方法.方法 采用无血清支气管上皮培养基,对经手术切除获得的支气管进行组织贴块法培养获得的细胞进行原代培养和传代,通过倒置显微镜以及细胞免疫化学观察和鉴定细胞.结果 此方法获得的细胞成活率高、纯度高,细胞呈扁平、多边形,象铺路的鹅卵石样分布.细胞角蛋白表达阳性.结论 组织贴块法是一种简便、有效的培养人的支气管上皮细胞的方法,无血清培养基可提供满意的生长条件,提高上皮细胞的纯度,为进一步研究不同的呼吸系统疾病提供了良好的模型.     

胰腺癌MUC1 mRNA转染树突细胞疫苗诱导特异性抗肿瘤的免疫反应

目的 研究人胰腺癌MUC1 mRNA转染树突细胞(DC)诱导的特异性抗肿瘤免疫反应,为DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据.方法 从外周血中分离单核细胞(PBMC)并培养成DC,从细胞形态和表面标志进行鉴定.通过RT-PCR扩增胰腺癌MiaPaCa-2细胞的MUC1 mRNA后用电穿孔法将其转染DC.采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测培养不同时间点DC的MUC1的表达.用四甲基偶氮唑蓝法检测DC存活率.采用51Cr标准细胞毒实验观察转染MUC1 mRNA的DC诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应;应用ELASA法检测CTL的IFN-γ释放量.结果 培养获得的细胞呈现典型的DC形态特征和表面标志(CD40+、HLA-DR+、CD83+、CD86+).MUC1 mRNA转染DC48 h后,细胞MUC1 mRNA表达水平最高,为38.43(36.89 ～48.06),蛋白表达亦最强.转染后DC的存活率稳定在80％左右.转染MUC1 mRNA的DC可有效诱导HLA-A2 +/MUC+特异性CTL免疫反应;胰腺癌Capan-2细胞与转染MUC1的DC刺激MUC1特异性CTL的24 h IFN-γ释放量分别为(28.44±4.96)和(16.31 ±2.54) U/ml,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 人胰腺癌MUC1 mRNA体外转染DC后可诱导CTL产生特异性抗肿瘤免疫反应.     

老年白内障晶状体上皮细胞培养与表皮生长因子受体表达

目的观察老年白内障(≥60岁)晶状体上皮细胞培养与表皮生长因子受体(EGFR)表达。方法用消化分离法及组织块贴片法培养老年白内障、先天性白内障、胎儿晶状体及正常成人晶状体上皮细胞;应用免疫组织化学方法检测老年白内障晶状体上皮细胞、正常成人的晶状体上皮细胞及培养的晶状体上皮细胞EGFR蛋白表达,RT-PCR方法检测EGFRmRNA表达。结果老年白内障晶状体上皮细胞传代培养基本不能增殖,先天性白内障、胎儿可传6~7代,成人晶状体上皮细胞可传4~5代;老年白内障、培养的晶状体上皮细胞及正常成人晶状体上皮细胞EGFRmR-NA及蛋白均呈阳性表达。结论晶状体上皮细胞的培养对年龄有较高的敏感性,年龄愈大,细胞越易老化,老年白内障晶状体上皮细胞传代培养基本不能增殖;人眼的晶状体上皮细胞EGFR呈阳性表达。     

辛伐他汀对脂多糖诱导的细胞黏液高分泌的抑制

目的 观察具有抗炎活性的辛伐他汀对脂多糖 (LPS) 诱导的肺泡上皮细胞A549黏蛋白表达的影响并探讨其机制.方法 用不同浓度的辛伐他汀作用于培养的A549细胞,采用定量RT-PCR、ELISA和明胶酶谱法分别检测细胞的黏蛋白MUC5AC mRNA表达水平、MUC5AC蛋白含量及细胞上清基质金属蛋白酶 (MMP)-9活性.结果 辛伐他汀组细胞中MUC5AC蛋白含量及MUC5AC mRNA水平较脂多糖组均明显下降(P<0.05), 且浓度越高,作用越强.在正常情况下A549细胞培养上清液中几乎检测不到MMP-9活性,而LPS作用后上清中MMP-9活性明显增强(P<0.01),预先给予不同浓度辛伐他汀孵育细胞培养上清液MMP-9活性显著下降(P<0.05).结论 LPS诱导的A549细胞黏蛋白MUC5AC在mRNA和蛋白水平的升高与MMP-9活性增强有关,而辛伐他汀可减少LPS诱导的MUC5AC mRNA及蛋白表达,且呈浓度依赖性,提示其作用可能与抑制MMP-9活性有关.     

干眼患者泪液、正常人眼角膜和结膜黏蛋白5AC的表达及意义

采用免疫组化法检测非干燥综合征干眼（NSS组）、干燥综合征（SS组）及正常人（对照组）泪液中黏蛋白5AC（MUCSAC）的表达,同时检测对照组角膜和结膜组织中的MUC5AC。三组泪液中均检测到MUC5AC,其光密度值对照组为0.5787±0.2357、NSS组为0.56.50±0.1736、SS组为0.2936±0.1132,SS组与对照组、NSS组相比,P均〈0.05;对照组结膜中有MUC5AC的表达,角膜中则无表达。认为人类结膜中有MUC5AC的表达,角膜无表达;干眼患者泪液中MUC5AC减少。     

白细胞介素-13对人支气管上皮细胞SPDEF表达的影响及SPDEF在哮喘气道黏液高分泌中的作用

目的探讨白细胞介素(IL)-13对人支气管上皮细胞SPDEF表达的影响及SPDEF在哮喘气道黏液高分泌中的作用。方法将人原代支气管上皮细胞(NHBE细胞)分为对照组、IL-13组及IL-13+SPDEF siRNA组。培养28天后,收集NHBE细胞并提取总RNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测NHBE细胞SPDEF、粘蛋白MUC5AC及MUC5B mRNA的表达水平,流式细胞术检测MUC5AC阳性细胞数量和免疫荧光强度,免疫荧光染色检测粘蛋白MUC5AC和MUC5B的表达水平。结果IL-13组NHBE细胞SPDEF和MUC5AC mRNA的表达水平、MUC5AC阳性细胞数量和免疫荧光强度均明显高于对照组(P<0.001),而MUC5B mRNA的表达水平明显低于对照组(P<0.05);IL-13+SPDEF siRNA组NHBE细胞SPDEF和MUC5AC mRNA的表达水平、MUC5AC阳性细胞数量和免疫荧光强度均明显低于IL-13组(P<0.001);IL-13+SPDEF siRNA组MUC5B mRNA的表达水平明显低于对照组(P<0.05)。IL-13组NHBE细胞MUC5AC的表达水平明显高于对照组和IL-13+SPDEF siRNA组,而MUC5B的表达水平低于对照组。结论IL-13可能通过诱导人支气管上皮细胞SPDEF上调,促进气道粘蛋白MUC5AC的高表达,引起哮喘气道黏液高分泌。     

三种培养原代支气管成纤维细胞方法的比较

目的 探讨建立适用于SD大鼠支气管成纤维细胞原代培养的方法.方法 取重量为150~180 g的SD雄性大鼠的支气管组织,采用Ⅰ型胶原酶、木瓜蛋白酶联合消化+组织块黏附法、胰酶+胶原酶联合消化(双酶消化法)+组织块黏附法、组织块黏附法进行原代支气管成纤维细胞的培养.利用镜下观察细胞的生长特点;免疫荧光染色法鉴定细胞的类型及纯度;细胞的增殖活性用CCK-8检测并绘制生长曲线.结果 酶消化+组织块黏附法培养使细胞游出速度更快、细胞数量产生更多.组织块黏附法培养的细胞爬出相对缓慢、培养周期更长、获得的细胞数量相对较少.CCK8增殖曲线呈S形.培养48 h,经酶消化法分离得到的成纤维细胞已经游出,约有60%以上细胞已经贴壁,培养6~7 d可传代.组织块贴壁法培养5 d时,细胞开始从组织块边缘缓慢爬出,随后从组织块周围延伸长,14 d左右可传代.使用酶消化法培养的支气管成纤维细胞中可混有杂细胞团,为提高成纤维细胞的纯度可通过差速贴壁法纯化.结论 双酶消化法+组织块黏附法可以更高效、快速的分离和获取支气管成纤维细胞,为研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重塑提供了充足的种子细胞.     

胃复春对肿瘤坏死因子诱导人胃上皮GES-1细胞炎症和肠化的影响

[目的]研究胃复春散剂对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导人胃上皮GES-1细胞炎症及肠化的影响,进而探讨胃复春治疗慢性胃炎的可能机制。[方法]体外培养人胃上皮细胞GES-1,用ELISA法检测白细胞介素(IL)-6、IL-4的表达,用RT-PCR法检测细胞表面肠黏膜标志物黏蛋白2(MUC2)及胃黏膜标志物性别决定区Y框蛋白2(SOX2)mRNA的表达。[结果]胃复春可上调细胞表面IL-4的表达,抑制IL-6的表达,下调细胞中MUC2mRNA的表达,上调SOX2mRNA的表达,且药物治疗组与模型组相比均P<0.05。[结论]胃复春可能通过上调IL-4的表达及抑制IL-6的表达来实现抑制TNF-α诱导GES-1细胞炎症;通过下调MUC2和上调SOX2的表达来实现抑制肠化的过程,这为中药胃复春对慢性胃炎的防治作用提供了新的证据。     

粘蛋白1的物理屏障作用与其抑制呼吸道合胞病毒诱导呼吸道炎症无关

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染呼吸道上皮细胞后表达上调的粘蛋白1(MUC1)是否可以通过物理屏障作用阻止RSV接近并感染呼吸道上皮细胞,进而抑制炎症反应。方法我们通过向两种呼吸道上皮细胞系(A549和HEp-2)中转染MUC1真核表达载体pcDNA3.1-MUC1的方法过表达MUC1,再应用相同感染复数的RSV分别感染过表达MUC1和转染对照质粒pcDNA3.1的呼吸道上皮细胞,最后比较感染两种细胞内RSV的滴度。结果 RSV成功感染体外培养的两种呼吸道上皮细胞,且RSV在HEp-2细胞内形成的空斑较A549细胞内形成的空斑易于计数。过表达MUC1和转染对照质粒pcDNA3.1的呼吸道上皮细胞内病毒滴度无显著差异。结论呼吸道上皮细胞过表达的MUC1不能抑制RSV接近并感染呼吸道上皮细胞,即MUC1不是通过物理屏障作用抑制RSV诱导炎症反应。     

Mucin4在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的研究胰腺癌组织中Mucin 4(MUC4)的表达及其与临床病理参数间的关系.方法 (1)采用ABC免疫组织化学方法检测35例胰腺癌、12例胰腺良性肿瘤及5例慢性胰腺炎组织MUC4的表达.(2)通过RT-PCR方法检测12例胰腺癌组织、癌旁胰腺组织以及2株胰腺癌细胞株MUC4 mRNA的表达.结果 (1)35例胰腺癌组织中MUC4蛋白阳性表达24例,12例胰腺良性肿瘤中MUC4蛋白阳性表达2例,5例慢性胰腺炎组织中MUC4蛋白均为阴性.MUC4蛋白胰腺癌组织中阳性表达率显著高于胰腺良性肿瘤及慢性胰腺炎组织(P ＜ 0.05).MUC 4在胰腺癌组织中阳性表达率与肿瘤的部位、淋巴结转移、临床分期无关(P ＞ 0.05).(2)12例胰腺癌组织中MUC4 mRNA表达阳性有6例,癌旁组织中无阳性表达,2株胰腺癌细胞株均呈阳性表达.MUC4 mRNA在胰腺癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织(P ＜ 0.05).结论 MUC4在胰腺癌中有较高的表达率,检测其表达可能有助于胰腺癌的诊断,并可作为鉴别胰腺癌和慢性胰腺炎一个重要参考指标.     

HIF-1α在磷酸二酯酶-4抑制剂罗氟司特调节人气道黏蛋白MUCSAC表达中的作用研究

目的探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在磷酸二酯酶4抑制剂罗氟司特调节人气管上皮细胞黏蛋白MUCSAC表达中的作用。方法制备香烟烟雾提取物,分别用罗氟司特或香烟烟雾提取物或二者同时干预支气管上皮细胞16HBE。采用RT—PCR法检测细胞中MUC5AC及HIF-1αmRNA表达量。Western blot检测MUC5AC及HIF-1α蛋白的表达情况。结果与对照组相比,香烟烟雾提取物能够从转录和蛋白水平显著促进支气管上皮细胞16HBE中MUC5AC及HIF-1α的表达,而罗氟司特干预可以明显抑制香烟烟雾提取物诱导的HIF-1α,并降低MUC5AC的表达。结论磷酸二酯酶4抑制剂罗氟司特可以通过降低HIF-1α而抑制香烟烟雾提取物所诱导的支气管上皮细胞MUC5AC的表达。     

慢性烟曲霉暴露对支气管哮喘大鼠气道黏蛋白MUC5AC表达的影响

[目的]探讨慢性烟曲霉暴露对支气管哮喘(简称哮喘)大鼠气道黏蛋白MUC5AC表达的影响.[方法]将56只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为7组(每组8只):慢性哮喘(A)组、慢性哮喘+烟曲霉孢子吸入1周(B)、3周(C)和5周(D)组、慢性哮喘+生理盐水吸入(E)组、卵清白蛋白(OVA)致敏生理盐水激发(F)组和OVA致敏生理盐水激发+烟曲霉孢子吸入(G)组.测定各组大鼠基础气道阻力和应用乙酰胆碱后气道阻力变化率,RT-PCR测定肺组织MUC5AC mRNA的表达,免疫组织化学染色测定各组大鼠气道上皮细胞MUC5AC的表达,酶联免疫吸附(ELISA)法测定BALF中IL-13水平,肺组织切片过碘酸雪夫染色(PAS)观察气道上皮杯状细胞增生程度.[结果]B、C和D组大鼠肺组织MUC5AC mRNA(MUC5AC mRNA/β-actin mRNA)(分别为1.9±0.4、2.3±0.6、2.9±0.8)、气道上皮细胞MUC5AC表达(A值)(分别为278±58、566±64、891±80)、BALF上清液IL-13[分别为(96±16)、(136±22)、(197±34)μg/L]及杯状细胞/上皮细胞面积(分别为16％±5％、23％±7％、36％±9％)均高于A、E、F及G组(均P＜0.05);C和D组大鼠气道阻力变化率(分别为61.91％±5.26％、84.69％±6.38％)均高于A、E、F及G组(均P＜0.05).B、C和D组哮喘大鼠MUC5AC的A值及MUC5AC Mma/β-actin mRNA与气道上皮杯状细胞增生程度(PAS染色区面积/上皮细胞面积)呈正相关(r值分别为0.578和0.614,均P＜0.05),与气道反应性(Raw变化率)呈正相关(r值分别为0.638和0.564,均P＜0.05).[结论]慢性烟曲霉暴露可上调哮喘大鼠气道上皮黏蛋白MUC5AC的表达,促进杯状细胞增生,加重气道高反应.     

大鼠结膜杯状细胞的体外培养及鉴定

目的体外分离、培养大鼠结膜杯状细胞,观察其形态、结构等生物学特征。方法取大鼠穹隆部结膜,加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中行组织块培养,5~7 d后酶消化法传代。观察原代及传代细胞的形态及生长情况,并应用特殊免疫组化染色方法分别对原代、传代培养的杯状细胞进行鉴定,用Image J软件计算细胞纯度。结果倒置相差显微镜下可见杯状细胞呈鹅卵石样,5~7 d在组织块周围形成环状结节。免疫组化结果显示,培养的原代细胞角蛋白(CK)4染色阴性,CK7染色阳性,且CK7阳性细胞数占(97.3±2.0)%。传代杯状细胞中,绝大多数凝集素UEA-I染色为阳性,阳性细胞占(91.2±2.7)%。结论大鼠穹窿部结膜可以成功培养出杯状细胞,传代细胞仍保持原代细胞特性,且纯度较高。     

人肾透明细胞癌组织MUC3的表达及意义

目的：探讨人肾透明细胞癌组织中黏蛋白3(MUC3)的表达及其临床意义。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)法检测人肾透明细胞癌和癌旁肾组织中MUC3的表达，分析癌组织中MUC3的表达与肿瘤病理分级、临床分期之间的关系。结果：肾透明细胞癌组织中MUC3的阳性表达率明显高于癌旁肾组织。MUC3的阳性表达率随肿瘤病理分级上升而上升，而与肿瘤的临床分期无相关性。结论：MUC3在人肾透明细胞癌中表达增强．并与肿瘤的恶性程度相关，MUC3可能在人肾透明细胞癌的发生发展中起重要作用。     

胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性抗肿瘤免疫反应的体外研究

目的 观察人胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染的树突细胞（DCs）所诱导的抗肿瘤免疫反应.方法 从6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DCs.使用电穿孔法将Capan-2细胞总RNA及MUC4 mRNA分别转染DCs.应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染后DCs的存活率.采用蛋白质印迹法检测DCs中MUC4 mRNA的表达.使用IFN-γ酶联免疫法检测DCs诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTLs）的活化反应.采用51Cr标准细胞毒实验检测DCs诱导的抗原特异性CTLs对体外胰腺癌细胞的杀伤效应.结果 Capan-2细胞总RNA转染的DCs（DC-Capan-2-total RNA）的存活率呈时间依赖性下降,转染后96 h的存活率降低至60.8％,而转染MUC4 mRNA的DCs（DC-MUC4 mRNA）的存活率稳定在80.0％左右,两转染组DCs的差异具有统计学意义（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA的MUC4蛋白表达量亦显著低于DC-MUC4 mRNA（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA诱导的CTLs 24 h IFN-γ释放量为（89.34±3.85） U/ml,DC-MUC4 mRNA为（21.77±2.14） U/ml,两转染组的差异有统计学意义（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA诱导的特异性CTLs能够有效识别和杀伤HLA-A2 ＋/MUC4＋的Capan-2细胞及HLA-A2 ＋/MUC4-的PANC1细胞,而不能有效识别和杀伤HLA-A2-/MUC4-的MiaPaCa-2细胞和HLA-A2-/MUC4＋的AsPC-1细胞.结论 胰腺癌细胞总RNA转染的DCs较单个胰腺癌相关抗原转染的DCs能诱导出更加显著的CTLs抗肿瘤免疫反应,但受到MHC Ⅰ类抗原递呈的限制.     

熏烟对小鼠肺内Muc1表达的影响及机制

目的 观察熏烟对小鼠肺组织中Muc1表达的影响,并初步探讨其表达水平的改变与烟雾刺激的关系.方法 C57雄性小鼠随机分为熏烟组(8只)和对照组(8只),熏烟处理或正常饲养相同时间后处死小鼠,对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数、染色和分类,同时测定BALF中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;通过酶联免疫吸附测定法及蛋白质免疫印迹法对BALF及肺组织中Muc1蛋白水平进行检测.同时对香烟烟雾提取物刺激肺上皮来源的A549细胞后MUC1的表达水平进行了验证.结果 与对照组比较,熏烟组小鼠肺组织中出现明显炎症细胞浸润,BALF中的细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数均增高.同时,熏烟组小鼠的肺组织及BALF中的Muc1表达水平以及BALF中TNF-α的水平均高于对照组(P＜0.05或P＜0.01).此外,香烟烟雾提取物刺激A549细胞后,可诱导黏蛋白MUC1表达上升.结论 熏烟可以导致小鼠肺组织炎症反应并伴随Muc1的表达水平升高和TNF-α 分泌的增加,MUC1表达水平的增加可能与香烟烟雾直接作用于肺上皮细胞有关.     

Mucin4在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的研究胰腺癌组织中Mucin 4(MUC4)的表达及其与临床病理参数间的关系。方法(1)采用ABC免疫组织化学方法检测35例胰腺癌、12例胰腺良性肿瘤及5例慢性胰腺炎组织MUC4的表达。(2)通过RT-PCR方法检测12例胰腺癌组织、癌旁胰腺组织以及2株胰腺癌细胞株MUC4 mRNA的表达。结果 (1)35例胰腺癌组织中MUC4蛋白阳性表达24例,12例胰腺良性肿瘤中MUC4蛋白阳性表达2例,5例慢性胰腺炎组织中MUC4蛋白均为阴性。MUC4蛋白胰腺癌组织中阳性表达率显著高于胰腺良性肿瘤及慢性胰腺炎组织(P<0．05)。MUC4在胰腺癌组织中阳性表达率与肿瘤的部位、淋巴结转移、临床分期无关(P>0．05)。(2)12例胰腺癌组织中MUC4 mRNA表达阳性有6例,癌旁组织中无阳性表达,2株胰腺癌细胞株均呈阳性表达。MUC4 mRNA在胰腺癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0．05)。结论 MUC4在胰腺癌中有较高的表达率,检测其表达可能有助于胰腺癌的诊断,并可作为鉴别胰腺癌和慢性胰腺炎一个重要参考指标。     

应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞

目的探讨应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞的方法.方法应用结合组织块法和Ⅳ胶原酶消化法的改良的组织块酶消化法体外原代培养人大肠癌细胞,通过对培养条件、促进贴壁、控制污染、细胞纯化等方面的探索得到了大肠癌细胞,并最终用形态学方法(瑞姬氏染色)、和免疫学方法(免疫细胞化学)鉴定所得细胞.结果经改良的组织块酶消化法体外培养的人大肠癌原代细胞,瑞姬氏染色进行细胞形态学鉴定,结果显示胞核呈紫红色,核质比明显增大,符合肿瘤细胞特征;细胞胃肠癌相关糖链抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,C A19-9)进行细胞免疫学鉴定,结果显示胞浆呈棕色,细胞CA19-9阳性.结论改良的组织块酶消化法在培养方法改良、促进贴壁、控制污染和去除杂细胞四方面进行了改进,既可快速获得游离细胞,又充分利用了未彻底消化的组织块.采用该改良的组织块酶消化法原代培养细胞成功率高,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.     

miR-145-3p在肝癌中的表达及其对肝癌细胞生长的调控作用

背景miR-145-3p在头颈癌、肺癌和胃癌等肿瘤可发挥抑癌的作用,而其在肝癌中的表达和作用并不清楚.目的探讨miR-145-3p在肝癌中的表达及其对肝癌细胞的增殖与凋亡的调控作用.方法用RT-q PCR法检测肝癌组织、癌旁组织、肝细胞株(Hep3B、Huh-7、Hep G2和SMMC-7721)与正常肝细胞株L-02中miR-145-3p的表达水平;将miR-145-3pmimic或miR-145-3pinhibitor转入Hep3B细胞,用CCK-8法、流式细胞术、TUNEL法和Westernblot法分别检测细胞活力、细胞周期、细胞凋亡和4型黏蛋白(mucin4, MUC4)表达.用荧光素酶报告基因实验鉴定miR-145-3p的靶基因.将pc DNA-MUC4转入已转染miR-145-3p mimic的细胞,用CCK-8法和TUNEL法分别检测细胞活力与细胞凋亡.结果miR-145-3p在肝癌组织和细胞中呈低表达.过表达miR-145-3p能抑制细胞增值和G0/G1期到S期转换,促进凋亡和降低MUC4表达;而敲减miR-145-3p则作用相反. MUC4是miR-145-3p的靶基因.过表达MUC4能逆转miR-145-3p mimic对细胞存活的抑制作用.结论miR-145-3p在肝癌低表达,且其表达与T分期呈负相关.过表达miR-145-3p可抑制肝癌细胞存活与生长,而敲减miR-145-3p能促进肝癌细胞存活与生长.     

乙型肝炎病毒x基因转染肾小管上皮细胞导致细胞凋亡的机制探讨

目的:探讨乙型肝炎病毒x基因(HBx)转染人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)后对其凋亡及细胞因子分泌的影响及可能机制. 方法:体外培养HK-2细胞,用分子克隆法构建pcDNA3.1/myc-HBX质粒,采用脂质体转染法瞬时转染HK-2细胞,实时荧光定量PCR (RT-PCR)及蛋白印迹法验证HBx在HK-2细胞中的表达.以未转染质粒组和转染空载质粒pcDNA3.1/myc组作为对照,显微镜观察转染HBx基因后HK-2细胞形态,RT-PCR检测各组细胞Toll样受体4(TLR4) mRNA水平,蛋白印迹法检测各组细胞TLR4的表达,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,ELISA检测细胞培养上清中白细胞介素4(IL-4)、干扰素γ(IFN-γ)水平. 结果:转染pcDNA3.1/myc-HBx质粒后的HK-2细胞中HBx mRNA和蛋白表达水平明显增加,证实转染成功;转染HBx基因组细胞形态不规则,细胞状态受损;与对照组相比,转染HBx基因组TLR4的表达水平明显上调(P＜0.05),凋亡细胞数量明显增多(P＜0.05),细胞上清液中IFN-γ水平增加,但IL-4水平降低. 结论:经构建pcDNA/myc-HBx质粒并转染肾小管上皮细胞可成功制备乙肝病毒细胞感染模型,由此导致的肾小管上皮细胞凋亡可能与HBx引起肾小管上皮细胞TLR4的表达上调有关,HBx亦能导致细胞因子分泌紊乱.