辛伐他汀对骨髓基质干细胞成骨分化晚期骨钙素表达的影响

目的通过辛伐他汀体外干预成骨分化晚期的骨髓基质干细胞,观察骨钙素（osteocalcin,OCN）在mRNA和蛋白水平的表达,探讨辛伐他汀促进成骨分化作用及机制。方法取4周龄大鼠股骨和胫骨骨髓腔内的干细胞体外培养,传一代后并向成骨细胞诱导分化,取第五代细胞分别加入lOl7M浓度的辛伐他汀或等量溶剂干预,于加药后48h提取细胞RNA及蛋白,采用Realtime PCR和Westernblot法检测0CN的表达,同时收集细胞培养液上清,ELISA法检测0CN浓度;1周后采用yonKossa染色观察细胞外基质矿化能力。结果①RealtimePCR：实验组0CN的mRNA表达水平显著高于对照组（P〈0．05）;②Westernblot：实验组OcN的蛋白表达水平显著高于对照组（P〈0．05）;③ELISA：实验组细胞培养上清中0CN浓度显著高于对照组（P〈0．05）;④VonKossa染色：实验组细胞外基质矿化能力强于对照组。结论辛伐他汀可以刺激大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化晚期0CN在rnRNA和蛋白水平的表达。     

胶原水凝胶与基质胶作为骨组织工程支架材料表面涂层修饰效果的比较研究

目的对比研究胶原水凝胶和基质胶作为骨组织工程支架表面涂层材料的效果。方法本实验借助原代成骨细胞,通过对碱性磷酸酶(ALP)活性、组织学染色及成骨特异性mRNA水平的分析,研究胶原水凝胶和基质胶对成骨分化的影响。结果胶原组与基质胶组细胞活力以及增殖能力均增强,并上调成骨相关基因及蛋白,包括碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1),尤其是胶原水凝胶涂层对细胞生长和成骨分化的促进作用明显大于基质胶涂层。结论胶原水凝胶涂层比基质胶涂层更有利于成骨分化,更适合作为细胞支架,推荐其作为骨组织工程支架材料的常用表面涂层材料。     

辛伐他汀对人骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程的影响

目的：观察辛伐他汀（SIM）对体外人骨髓基质干细胞（hBMSCs）向成骨分化的影响,探讨其刺激成骨的作用机制.方法：取健康成人骨髓进行体外成骨诱导培养,实验分为对照组（G1）：不给予药物干预;实验组（G2）：传代后加入SIM1×10-7mol/L.于传代后7,14,21d采用RealtimeRT-PCR检测mRNA水平和BMP-2,Smad1,β-catenin,Frizzled2的表达,并用免疫组织化学检测蛋白水平β-catenin的表达.传代后7d行细胞碱性磷酸酶（ALP）染色和比活性检测;传代后21d行vonKossa染色,检测细胞外基质矿化.结果：SIM作用后7,14,21d3个不同时间点,BMP-2表达均显著高于对照组;Smad1在成骨诱导14,21d时表达高于G1,其余组间差异均不显著;β-catenin免疫组织化学染色2组差异不显著;G2组ALP表达和矿化能力均显著高于G1组.结论：SIM1×10^-7mol/L可促进体外成骨诱导培养的hBMSCs向成骨细胞分化,上调TGF-β/BMPs信号通路部分信号分子表达,但未能显著改变Wnt/β-catenin信号通路部分相关因子的表达.     

转化生长因子-?茁1促进骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化

目的：探讨转化生长因子?茁1（transforming growth factor-?茁1,TGF-?茁1）在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）成骨分化过程中的作用。方法：应用鼠MSC C3H10T1/2,以重组腺病毒法将BMP9导入,施加TGF-?茁1处理,建立BMP9联合TGF-β1诱导MSC成骨分化模型。改良SEAP化学发光法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性;茜素红S染色进行钙盐沉积检测;实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Ⅰa2型胶原（collagenⅠa2,COLⅠa2）、骨桥素（osteopotin,OPN）、骨钙素（osteocalcin,OCN）的mRNA转录表达水平,免疫细胞化学法检测细胞内OPN、OCN表达变化。荧光素酶报告基因法检测信号通路的Smad水平。结果：TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理能更早更多地提高ALP活性和引起钙盐沉积（F处理=18 782.10,P=0.000）,持续处理达17 d后不再显示明显差异,TGF-?茁1单独处理与对照组间无明显差异（F=1.03,P=0.318）。TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理可使COLⅠa2、OPN、OCN mRNA转录水平明显增高（COLⅠa2的F处理=250.30,P=0.000;OPN 的F处理=795.64,P=0.000;OCN的F处理=206.55,P=0.000）,COLⅠa2增高发生较早和显著（F=250.30,P=0.000）;细胞内OPN、OCN蛋白阳性表达显著增强。TGF-β1联合BMP9处理能刺激信号通路相应的Smad荧光素报告活性（?字2=32.84,P=0.000）。结论：在BMP9诱导MSC成骨分化中,联合应用TGF-?茁1具有促进成骨作用,BMP9与TGF-?茁1在成骨分化中可能存在互补效应。     

龟板提取物上调维生素D受体表达促骨髓间充质干细胞向成骨分化

目的 探讨龟板提取物诱导大鼠骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 向成骨分化和对维生素D受体 (VDR) 表达的影响。方法 从大鼠骨髓中分离 MSCs,体外培养,利用流式细胞术检测 MSCs 表面抗原 CD44 细胞标志,体外培养 MSCs 分成不同的组观察其向成骨分化,在培养基中不加任何处理的作为对照组,培养基中加成骨诱导液诱导 MSCs 向成骨分化作为阳性对照组,龟板提取物组在培养基中加龟板提取物,诱导 7 d 后,通过免疫化学染色、Western blotting、原位杂交、RT-PCR 等方法观察龟板提取物对原代培养的 MSCs 向成骨分化的成骨分化标记分子碱性磷酸酶 (ALP)、骨桥蛋白 (OPN) 及 VDR 阳性表达及 VDR mRNA 的表达情况。结果 免疫组化染色显示,龟板提取物组成骨分化标记分子 ALP、OPN 和VDR 的阳性百分比明显高于对照组,Western blotting 结果也显示龟板提取物组的 ALP、OPN和 VDR 的蛋白表达水平高于对照组;同时原位杂交、RT-PCR 结果表明,龟板提取物诱导MSCs 向成骨分化过程可明显促进 VDR mRNA 的表达。结论 龟板提取物可促 MSCs 向成骨分化,其机制可能与 VDR 的上调有关。     

补肾活血汤含药血清对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

【目的】探讨补肾活血汤促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成骨细胞分化的能力。【方法】用不同浓度的补肾活血汤含药血清干预BMSCs,7 d后应用4-硝基苯基磷酸二钠盐(PNPP)偶氮法测定碱性磷酸酶(ALP)活性,21 d后行茜素红染色(ARS)观察钙盐沉积情况判定成骨能力,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测Runx相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)的基因表达以评估成骨能力。【结果】与空白血清组比较,补肾活血汤低、中、高剂量血清组BMSCs的ALP活性、茜素红染色面积及Runx2、OCN、OPN基因表达水平均升高(P 0.05或P 0.01)。【结论】补肾活血汤可促进BMSCs向成骨细胞分化,其机制可能与上调Runx-2、 OCN、OPN表达有关。     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

塞来昔布对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化的影响

目的 观察不同浓度的塞来昔布对rBMSCs的增殖、成骨诱导分化的影响,探讨塞来昔布影响rBMSCs成骨诱导分化的可能机制。方法 采用全骨髓贴壁法获得rBMSCs;使用不同浓度的塞来昔布（0、12.5、25、50、100μmol/L）干预培养rBMSCs,检测不同浓度的塞来昔布对rBMSCs增殖的影响;采用较高浓度的塞来昔布（100μmol/l）诱导rBMSCs 成骨分化,进行ALP、茜素红染色,应用real-time PCR扩增ALP、OCN。结果 细胞增殖抑制实验表明100μmol/L塞来昔布对rBMSCs增殖抑制明显（P<0.05）;12.5、25以及50μmol/L塞来昔布对rBMSCs增殖抑制无影响。ALP染色结果表明,成骨诱导3天对照组以及实验组ALP染色均为阴性;诱导7天对照组ALP染色为阳性,而实验组染色为阴性;诱导14天对照组ALP染色为阳性,实验组染色阴性。茜素红染色结果表明,成骨诱导3天、7天对照组以及实验组染色均为阴性;诱导至14天对照组染色阳性,实验组染色呈阴性。荧光定量PCR结果表明,成骨诱导3天对照组以及实验组ALP mRNA、OCN mRNA表达均较低;成骨诱导7天对照组ALP mRNA表达明显升高,实验组ALP mRNA表达升高趋势较弱,对照组OCN mRNA表达与第3天相比基本无差异,实验组OCN mRNA表达下降明显;诱导14天对照组ALP mRNA表达出现明显下降,实验组ALP mRNA 表达与第7天相比无明显差异,对照组OCN mRNA表达进一步升高,实验组OCN mRNA表达与第7天相比基本无变化。结论 本实验发现,高浓度的塞来昔布（100μmol/L）对rBMSCs增殖具有显著抑制效应。高浓度的塞来昔布（100μmol/L）能够抑制rBMSCs成骨诱导分化过程。高浓度的塞来昔布（100μmol/L）能够抑制rBMSCs成骨诱导分化过程中ALP以及OCN mRNA表达,表明较高浓度塞来昔布抑制rBMSCs成骨诱导分化的效应可能通过抑制ALP以及OCN的基因表达实现,提示在应用NSAIDs时应注意剂量等问题,尤其是应避免使用高剂量甚至是超高生理剂量进行药物镇痛治疗。     

miR-30a-5p在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的生物学功能及验证

目的：探讨并验证重组miRNA-30a-5p体外转染对人骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化的生物学作用。方法：人工重组合成从人骨髓MSCs定向成骨分化差异性表达miRNA基因芯片结果中筛选成骨性表达量显著增高的miRNA-30a-5p。从人体骨髓中分离培养MSCs,成骨诱导分化过程中于体外转染重组miRNA-30a-5p,并通过茜素红S法染色检测钙盐沉积、碱性磷酸酶（ALP）钙钴法染色及ALP比色法定量检测成骨细胞ALP活性,对比观察研究重组miRNA-30a-5p在人骨髓MSCs定向成骨诱导分化过程中的生物学功能。结果：成功分离培养人骨髓MSCs并诱导其成骨定向分化。经体外向MSCs转染miRNA-30a-5p并诱导其成骨定向分化,转染效率为（37.32±2.43）%。分别于诱导培养第14、21天行ALP染色观察、ALP活性测定、茜素红钙盐结节染色检测各组细胞成骨活性,结果显示miRNA-30a-5p mimics转染组MSCs成骨分化特性显著性增强（P〈0.05）。结论：miRNA-30a-5p在MSCs定向成骨分化的过程中具有一定的促进增强作用,被转染的MSCs向成骨细胞定向分化表达有所增加,为进一步阐明人骨髓MSCs定向成骨分化的分子生化机制,细胞移植修复治疗骨缺损奠定了理论基础。     

miR-21诱导犬BMSCs骨向分化的体外实验研究

目的 体外研究检测miR-21诱导拉布拉多犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用.方法 构建LentimiR-21-Luciferase与Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒载体,分别转染犬BMSCs,将研究分为miR-21组与LacZ组.利用体外细胞划痕实验来比较转染后BMSCs的爬行迁移能力.在转染后的第0、1、4、7、14天分别提取miR-21组与LacZ组BM-SCs的mRNAs和蛋白.通过Real time-PCR技术和Westernblot检测成骨分化关键因子骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达.结果 Lenti-miR-21-Luciferase与Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒载体成功转入BMSCs后,miR-21组的BMSCs细胞爬行迁移能力显著增强(P＜0.001);Real time-PCR和Western blot结果显示,miR-21可以显著上调BMSCs成骨分化关键因子OCN和OPN的表达(P＜0.05).结论 miR-21可以显著促进BMSCs的成骨分化,为进一步的体内实验奠定基础.     

BICC1对骨髓基质细胞定向分化的调控作用研究

目的:探讨BICC1在骨髓基质细胞向成骨细胞及脂肪细胞分化过程中的作用。方法:构建Bicc1过表达质粒Bicc1-pcDNA3.1,以pcDNA3.1为对照,分别转染小鼠骨髓基质细胞ST2。对两组细胞进行成脂和成骨诱导,在成骨诱导14 d时碱性磷酸酶染色检测成骨分化情况,在成脂诱导5 d时利用油红O染色检测脂滴形成情况;采用qRT-PCR及Western blot技术检测细胞Bicc1过表达对成骨及成脂相关因子的影响。结果:酶切及测序结果显示Bicc1过表达质粒构建成功,将其转染到ST2细胞后,Bicc1 mRNA表达水平较对照组升高15.23倍（P＜0.05）。成骨诱导条件下,Bicc1过表达组ST2细胞碱性磷酸酶染色增强,成骨相关因子Osterix、碱性磷酸酶、Osteopontin、Runt相关转录因子2（Runx2）和骨钙素的mRNA和/或蛋白表达水平显著上升（均P＜0.05）。成脂诱导条件下, Bicc1过表达组ST2细胞中脂滴形成减少,油红OD520较对照组明显降低（P＜0.01）,成脂相关因子过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、脂肪酸结合蛋白（FABP4/aP2）和adipsin的mRNA及蛋白表达水平显著下降（均P＜0.05）。结论:BICC1可促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化,抑制其向脂肪细胞分化。     

miR-186靶向调控骨桥蛋白基因表达对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨miR-186对骨髓间充质干细胞(bMSCs)成骨向诱导分化过程中骨桥蛋白(OPN)基因的靶向作用及其对bMSCs成骨分化的影响.方法:分离培养bMSCs,应用骨形成蛋白2成骨向诱导分化并采用碱性磷酸酶染色和Von-kossa染色鉴定;运用生物信息学方法对miR-186和OPN基因的靶向配对关系进行预测,采用荧光素酶报告系统鉴定;脂质体2000转染miR-186模拟物以及干扰OPN基因的siRNA后,Real-time PCR检测miR-186和OPN mRNA的表达,Western blot检测OPN蛋白的表达.结果:光镜下可见bMSCs均匀分布,诱导分化后的细胞碱性磷酸酶染色呈蓝色.生物信息学软件TargetScan和miRanda显示miR-186和OPN基因二者靶向配对良好,荧光素酶报告系统进一步验证发现,miR-186能够抑制OPN mRNA表达.Real-time PCR和Western blot检测结果表明过表达miR-186能够降低OPN mRNA和蛋白的表达.结论:miR-186通过下调bMSCs成骨向诱导分化过程中OPN基因表达进而抑制bMSCs的成骨分化.     

特种肽支架材料对骨髓基质干细胞黏附、增殖及成骨分化的影响

目的 探讨新型含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽K16RGDSPC修饰聚丙交酯-CO-乙交酯（PLGA）-[ASP-PEG]支架材料对骨髓基质干细胞（BMSCs）在其表面黏附、增殖及成骨分化的影响。方法 固相合成法合成K16GRGDSPC并通过质谱仪和高压液相色谱进行鉴定。用交联剂Sulfo-LC-SPDP将K16GRGDSPC接枝到PLGA-[ASP-PEG]支架材料上,通过XPS图谱检测接枝反应的发生。将改性后的PLGA-[ASP-PEG]支架材料与兔BMSCs在成骨诱导培养基中复合培养,以未改性的支架材料作对照。通过沉淀法、微管吮吸法、MTT法和考马斯亮蓝法分别检测BMSCs的黏附和增殖性能的变化;应用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测BMSCs的ALP表达水平并通过RT-PCR检测细胞ALP、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）和Ⅰ型胶原的表达,通过免疫荧光染色检测核心结合因子a1（Cbfal）表达,观察BMSCs向成骨细胞方向分化的情况。结果 XPS图谱证实含RGD肽K16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面。复合BMSCs培养结果表明,改性后的PLGA-[ASP-PEG]表面BMSCs的黏附性能和增殖能力明显提高,而且其成骨标志物（ALP、OCN、OPN、Ⅰ型胶原和Cfba1）的表达均显著高于对照组（P〈0．05）。结论 含RGD肽K16GRGDSPC能促进BMSCs在骨基质材料表面的黏附、增殖并诱导其向成骨方向分化。     

放线共生放线杆菌培养上清对成骨细胞分化及间隙连接通讯的影响

目的探讨放线共生放线杆菌(actinobacillus actinomycetemcom itans,A.a)培养上清对成骨细胞分化以及细胞间隙连接通讯的影响。方法在A.a培养上清中体外培养成骨细胞,中性红检测成骨细胞活性,RT-PCR检测成骨细胞分化标记,免疫组化观察Ⅰ型胶原蛋白表达,利用划痕标记荧光染料示踪(SLDT)法与Westernblot检测Connexin43的表达,研究成骨细胞间隙连接通讯的变化。结果20%以下浓度的A.a培养上清对成骨细胞无明显致死性。RT-PCR结果显示A.a培养上清中成骨细胞分化标记的表达降低。免疫组化结果显示A.a培养上清中成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白表达降低。SLDT法结果显示A.a培养上清中成骨细胞荧光染料扩散低于对照组。Western blot检测结果显示A.a培养上清中成骨细胞Connexin43表达降低。结论A.a培养上清对成骨细胞分化及细胞间隙连接通讯有抑制作用。     

颌骨骨髓基质细胞对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的观察间接共培养犬颌骨骨髓基质细胞(canine maxillary bone marrow stromal cells, cM-BMSCs)对犬牙周膜细胞(canine periodontal ligament cells, cPDLCs)生物学特性的影响。方法 原代培养犬颌骨骨髓基质细胞和犬牙周膜细胞。MTT法检测犬牙周膜细胞增殖速率;利用Transwell结构建立犬颌骨骨髓基质细胞与犬牙周膜细胞共培养体系;qPCR法检测犬牙周膜细胞矿化相关基因核心结合因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的变化;Western印迹法检测Runx2和OCN蛋白的表达变化。构建牙片/细胞膜片复合体植入裸鼠皮下。结果 两种细胞体外均贴壁生长,呈纺锤状外形;颌骨骨髓基质细胞间接共培养下对牙周膜细胞增殖有抑制作用;共培养组牙周膜细胞ALP活性高于对照组;qPCR和Western印迹法均能检测到牙周膜细胞Runx2、OCN的表达,共培养组牙周膜细胞的Runx2和OCN的表达均高于对照组。经过颌骨骨髓基质细胞条件培养液诱导后的牙周膜细胞与牙本质片复合形成了排列更加有序的牙周膜/牙骨质样结构,单纯的牙周膜细胞膜片不能新生类似的牙周组织复合结构。结论犬颌骨骨髓基质细胞间接共培养情况下可能会限制牙周膜细胞的增殖,促进牙周膜细胞向成骨样细胞分化。     

腺病毒介导的NELL1基因对小鼠成骨细胞增殖分化的影响

目的探讨重组腺病毒(Ad-GFP-NELL1)介导的NELL1因子对小鼠成骨细胞(MC3T3E1)增殖、分化及OCN(骨钙素)和OPN(骨桥蛋白)基因表达的影响。方法免疫荧光染色鉴定重组腺病毒(Ad-GFP-NELL1)转染细胞后绿色荧光蛋白(GFP)及NELL1的表达;不同转染滴度Ad-GFP-NELL1转染MC3T3E1细胞,荧光显微镜下观察转染效果;将MC3T3E1细胞分为对照组,NELL1组(Ad-GFP-NELL1转染)和GFP组(Ad-GFP转染),利用CCK-8试剂盒检测并绘制生长曲线;观察和计量茜素红染色后钙结节数目;定量PCR检测成骨相关基因OCN,OPN表达的改变。结果免疫荧光显示Ad-GFP-NELL1转染大鼠骨髓基质干细胞72h后能同时表达NELL1和GFP;在最佳转染滴度200pfu/cell转染条件下,Ad-GFP-NELL1及Ad-GFP对MC3T3E1细胞增殖没有明显影响(P>0.05)。NELL1组细胞钙结节数目(7±2)比空白对照组(2±1)及Ad-GFP组(2±1)明显增多(P<0.05),OCN(3.7倍),OPN(5.1倍)的表达也明显上升。结论 Ad-GFP-NELL1转染MC3T3E1细胞后能有效促进细胞的成骨分化作用,且对其增殖无明显毒性作用。     

成骨生长肽对大鼠骨髓基质细胞增殖分化的影响

目的 研究成骨生长肽(osteogenic growth peptide, OGP)在体外对骨髓基质细胞增殖和成骨向分化的影响.方法 在体外培养的大鼠骨髓基质细胞中加入不同浓度的OGP(10-11～10-7 mol/L),用MTT法检测细胞增殖,酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)的表达,RT-PCR法检测细胞内核心结合因子1(Cbfa1) mRNA的表达.结果 OGP对骨髓基质细胞增殖有促进作用(P《0.05),最大效应浓度为10-9 mol/L;能增加细胞内ALP活性(P《0.05),最大效应浓度为10-8 mol/L;可诱导Cbfa1 mRNA的表达(P《0.05).结论 OGP可促进骨髓基质细胞的增殖,并通过诱导其内Cbfa1 mRNA的表达促进其成骨向的分化.