柯萨奇病毒B组3型VP1和IL-15双表达基因疫苗对小鼠的免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B3(CoxsackievirusB3,CVB3)VP1与白细胞介素 15 (interleukin 15 ,IL 15 )双表达基因疫苗 ,并观察其对小鼠的免疫效果。方法从CVB3VP1基因的重组质粒 pcDNA3/VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因 ,克隆至IL 15基因重组质粒 pcDNA3/IL 15 ,构建成双表达重组质粒 pcDNA3/VP1 IL 15 ,转化DH5a大肠杆菌 ,大量扩增后 ,肌内注射Balb/c小鼠 ,1次 /周 ,共 3次 ,每次免疫后第 6天取血清 ,用微量中和试验方法检测血清中和抗体。第 3次免疫后的第 7天 ,用 80 0TCID5 0CVB3感染小鼠 ,观察各组小鼠的生存情况。结果构建的 pcDNA3/VP1 IL 15重组质粒目的基因与CVB3 VP1和IL 15的序列相同 ;免疫小鼠后 pcDNA3/VP1 IL 15重组质粒能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加而提高 ;病毒攻击后 pcDNA3/VP1 IL 15和 pcDNA3/VP1 pcDNA3/IL 15组较其他组生存时间明显延长 (P <0 .0 5 )。结论本研究成功构建了 pcDNA3/VP1 IL 15真核双表达重组质粒 ;该质粒能诱导机体产生中和抗体 ,对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用。     

CVB3VP1与IL-2基因双表达重组质粒的构建及免疫效果

目的 探讨白细胞介素-2(intefleukin-2，IL-2)基因佐剂对柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法 从CVB3VP1基因的重组质粒peDNA3／VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因，克隆至pcDNA3／IL-2，构建成CVB3VP1基因和IL-2基因双表达质粒pcDNA3／VP1-IL-2，转化DH5a大肠杆菌。将peDNA3／VP1-IL-2、peDNA3／IL-2 peDNA3／VP1、pcD．NA3／VP1、peDNA3／IL-2、空白质粒peDNA3和生理盐水分别肌肉注射BALB／C小鼠，每周注射1次，共注射3次，每次注射后的第6天，断尾取血，用微量中和试验方法检测血清中和抗体；第3次注射后的第7天，用800TCID50CVB3感染小鼠，观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1-IL-2、pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1和pcDNA3／VP1组小鼠能产生中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高，pcDNA3／VP1-IL-2和pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1组抗体水平高于同期pcDNA3／VP1组抗体水平，但各组小鼠的生存率无明显差异。结论IL-2基因单独或与VP1基因共表达对pcDNA3／VP1诱导抗体产生均有一定免疫增强作用。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 ,但免疫小鼠对致死量的CVB3感染无明显保护作用     

柯萨奇病毒B组3型VP1和IL-15双表达基因疫苗对小鼠的免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)VP1与白细胞介素-15(interleukin-15,IL-15)双表达基因疫苗,并观察其对小鼠的免疫效果.方法从CVB3 VP1基因的重组质粒pcDNA3/VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因,克隆至IL-15基因重组质粒pcDNA3/IL-15,构建成双表达重组质粒pcDNA3/VP1-IL-15,转化DH5a大肠杆菌,大量扩增后,肌内注射Balb/c小鼠, 1次/周,共3次,每次免疫后第6天取血清,用微量中和试验方法检测血清中和抗体.第3次免疫后的第7天,用800TCID50 CVB3 感染小鼠,观察各组小鼠的生存情况.结果构建的pcDNA3/VP1-IL-15重组质粒目的基因与CVB3-VP1和IL-15的序列相同;免疫小鼠后pcDNA3/VP1-IL-15重组质粒能诱导机体产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数增加而提高;病毒攻击后pcDNA3/VP1-IL-15和pcDNA3/VP1+pcDNA3/ IL-15组较其他组生存时间明显延长(P<0.05).结论本研究成功构建了pcDNA3/VP1-IL-15真核双表达重组质粒;该质粒能诱导机体产生中和抗体,对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用.     

小鼠IFN-γ基因佐剂对分泌型柯萨奇病毒B3 VP1核酸疫苗免疫作用的影响

目的: 构建小鼠IFN-γ真核表达质粒,观察其对分泌型柯萨奇病毒B3(CVB3)核酸疫苗的影响. 方法: 以RT-PCR扩增小鼠IFN-γ基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3/mIFN-γ,检测其在cos-7细胞内的表达;将分泌型pcDNA3/sVP1, pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ肌注免疫小鼠,每2 wk注射1次,共3次,每次免疫后13 d取血测血清抗体水平. 末次免疫后2 wk,以500 TCID50的CVB3腹腔内感染,观察小鼠的存活情况. 结果: 成功构建了pcDNA3/mIFN-γ并能有效表达;pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数的增加而提高,但两组小鼠抗体滴度和生存率无显著性差异;混合质粒注射组血清的病毒滴度明显低于pcDNA3/sVP1组,且心肌病理损伤明显减轻. 结论: IFN-γ作为基因佐剂,在一定程度上增强了分泌型 CVB3 VP1基因疫苗的免疫保护作用.     

MDC、STxB与CVB3 VP1融合DNA疫苗的免疫效果比较

目的比较小鼠巨噬细胞源趋化因子（macrophage-derived chemokine,MDC）和志贺毒素B亚单位（Shiga toxin B subunit,STxB）与柯萨奇病毒B组3型（coxsackievirus B3,CVB3）VP1融合DNA疫苗的免疫效果。方法将120只雄性BALB／c小鼠分为6组,每组20只,分别肌内注射pcDNA3、pcDNA3／MDC、pcDNA3／STxB、pcDNA3／VP1、pcDNA3／MDC-VP1和pcDNA3／STxB-VP1,每3周1次,共3次,每次免疫后20d取血清,用微量中和试验检测CVB3中和抗体,第3次免疫后3周,每组取3只小鼠,取脾脏制备脾细胞,用CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性,其余小鼠用10LD50的CVB3攻击,观察小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1、pcDNA3／STxB-VP1和pcDNA3／MDC-VP1组均能诱导小鼠产生中和抗体;除pcDNA3／STxB-VP1组外,另两组抗体滴度随免疫次数增加而提高;第3次免疫后,pcDNA3／MDC-VP1组平均抗体滴度和脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性高于pcDNA3／VP1（P〈0．05）。病毒攻击后,pcDNA3／MDC-VP1组21d生存率高于其他各组（P〈0．05）。pcDNA3／STxB-VP1组抗体滴度和生存情况与pcDNA3／VP1组无明显差异。结论融合基因疫苗pcDNA3／MDC-VP1能诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫,提高了小鼠生存率,免疫效果优于pcDNA3／STxB-VP1。     

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗的免疫效应

目的探讨汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗（pcDNA3．1／HisB-IL-2-G1）的免疫效应。方法将pcDNA3.1／HisB-IL-2-G1融合基因疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB／c小鼠，每隔3周免疫1次，共免疫3次；酶联免疫法（ELISA）检测抗汉坦病毒（HTNV）抗体；空斑减少中和试验检测免疫血清中和抗体效价；淋巴细胞增殖试验（MTT法）检测免疫小鼠的细胞免疫反应；动物保护试验以BALB／c小鼠为感染动物模型，在第3次免疫后2周，腹腔内注射100TCID50（半数感染量）HTNV，然后以免疫荧光法观察鼠肾切片，评价其保护力。结果pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗免疫后可刺激机体产生特异性抗体和中和抗体，中和效价为1：20～1：80。MTT法结果表明，免疫小鼠的脾淋巴细胞有特异性增殖反应。动物试验表明pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗能保护小鼠免受HTNV感染。结论pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗可诱导特异性体液免疫应答和较强的细胞免疫应答。     

基因疫苗干预对感染小鼠心肌组织病理及超微结构的影响

目的 探讨基因疫苗干预对柯萨奇病毒B组3型(coxsackie virus group B type 3,CVB3)感染后,小鼠心肌组织病理及细胞超微结构的变化及意义.方法 将BALB/C小鼠随机分为3组,每组11只,用空质粒pcDNA3、基因疫苗pcDNA3/VP1和融合基因疫苗pcDNA3/MDC-L19-VP1分别免疫,共3次,每次间隔4周.末次免疫后第3周,每组随机取3只小鼠,腹腔注射含3倍半数致死量(3 half lethal dose,3LD50) 的CVB3病毒液,感染后第7天将小鼠处死,用于检测血中病毒滴度,并取心脏组织进行病理观察和细胞超微结构观察.每组剩余8只小鼠,腹腔注射致死量病毒液,观察并记录动物存活情况.结果 预防性接种重组基因疫苗后,CVB3感染的小鼠生存率pcDNA3/MDC-L19-VP1组为37.5%,pcDNA3/VP1组12.5%,pcDNA3组11 d内全部死亡,3组生存率比较差异有统计学意义(P<0.01);3组小鼠血中的病毒滴度依次降低,且差异有统计学意义(P<0.01);光镜观察显示pcDNA3/MDC-L19-VP1 组小鼠心肌组织细胞未出现严重的水肿和炎细胞浸润,电镜显示心肌细胞未出现核周水肿,肌原纤维未见断裂溶解,线粒体、肌浆网等细胞器未见明显异常,仅有少量炎性细胞浸润.结论 融合基因重组疫苗可以有效的预防CVB3感染对心肌的损伤.     

GM-CSF表达质粒对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗的增强作用

目的:观察粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对pcDNA3/MDC-VP1DNA疫苗免疫作用的影响,为柯萨奇病毒B组3型(CVB3)疫苗的研制提供理论和实验依据。方法:4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3组、pcDNA3/MDC-VP1组、pcDNA3/mGM-CSF组、pcDNA3/MDC-VP1与pcDNA3/mGM-CSF混合注射组,每组10只。每3周接种1次,共3次。每次接种的第20天眼眶采血,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中和抗体效价。第3次免疫后3周,每组取3只小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,检测淋巴细胞增殖活性与特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。结果:pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的血清中和抗体滴度明显提高,小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性均有增强。结论:GM-CSF可以增强pcDNA3/MDC-VP1DNA疫苗的特异性免疫应答。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒诱导小鼠中和抗体反应

以构建的柯萨奇病毒Ｂ 组３ 型（ＣＶＢ３）ＶＰ１ 基因的真核表达重组质粒ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ 作为候选的基因疫苗,评价其诱导小鼠产生的中和抗体反应。大量制备并提纯ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ ＤＮＡ,用其接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清进行病毒中和试验。结果证明其可诱导小鼠机体产生特异性中和抗体,并能中和ＣＶＢ３ 毒力,起到基因疫苗的预防作用。     

Stable Expression of Hantavirus H8205 Strain G1/IL-2 Gene and Immune Protection of the Fusion Gene

To explore the feasibility of stable expression of Hantavirus H8205 strain G1 segment and human IL-2 fusion gene in Vero cells, and to examine the immune protection effects on mice vaccinated with this recombinant eukaryotic expression vector containing Hantavirus G1 gene and IL-2 gene. With the help of lipofectamine, the Vero cells were transfected with pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1 and the positive cells were selected by G418. IFAT and SDS-PAGE elec- trophoresis were used to determine the stable transfection and expression of recombinant protein. Each mouse was inoculated with plasmids intramuscularly (i.m.) three times, 2 boosts were given at 2-week intervals, serum anti-hantavirus antibodies were detected by ELISA and neutralizing antibod- ies (NAb) were detected by Plaque Reduction Neutralization Test. The fusion protein expressed in Vero cells was 78 kD, corresponding to the estimated molecular size. The neutralizing antibody titers of mice with pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1 were 1:20-1:80. IL-2/G1 fusion gene could be transferred in Vero cells and stably express the fusion protein. Specific humeral immune responses in mice can be induced with the recombinant eukaryotic expression vector containing the fusion gene, which lays the foundation for further development of therapeutic HTNV vaccine.     

柯萨奇病毒B1/B3型二价VP1基因疫苗的构建及其免疫试验

目的 构建柯萨病毒（CV）B1／B3型二价VP1免疫质粒,并探讨其免疫原性。方法 通过逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术扩增CVB1的主要中和抗原VP1基因,将分别由CMV和SV40启动子控制的 CVB1和CVB 3的VP1基因反向串联插入到真核表达载体pCR3-Uni中。将该质料一转染鼠NIH3T3细胞,于转染后24、48、96h进行免疫荧光及RT－PCR检测,应用重组质粒免疫BALB／c小鼠,于免疫前、免疫后2 、4、6周分别断尾采血,用ELISA方法检测CVB特异性抗体。结果 获得了含有CVB1和CVB3的VP1南粒,RT－PCR及免疫荧光检测结果表明该质粒在NIH3T3细胞获得瞬时表达,小鼠免疫后4、6周均有特异性抗体产生。结论 本研究构建的CVB1／B3型二价VP1基因疫苗能诱导小鼠产生CVB特异性抗体,可以作为候选基因疫苗。     

C3d对分泌型柯萨奇病毒B组3型VP1 DNA疫苗的免疫增强作用

目的 构建分泌型柯萨奇病毒B组3型（CVB3）衣壳蛋白1（sVPl）与三拷贝补体3片段（C3d3）融合基因疫苗,并观察其免疫效果。方法 将C3d3 cDNA与带有白细胞介素2（IL-2）信号肽的CVB3VPl基因拼接,构建真核表达质粒pcDNA3／sVP1-C3d3。BALB／c小鼠随机分为3组,分别肌肉注射pcDNA3／sVP1-C3d3、pcDNA3／sVP1和pcDNA3质粒,于不同时间检测小鼠血清中和抗体滴度、特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性、血中病毒滴度,并观察疫苗的免疫保护作用。结果 小鼠的中和抗体滴度随免疫次数增加而提高,第3次免疫后pcDNA3／sVP1-C3d3组中和抗体滴度（33．6±1．7）和特异性CTL杀伤率（66．1％±2．9％）均明显高于pcDNA3／sVP1组（28．3±1．7,52．8％±3．3％,均P〈0．05）;以致死量CVB3感染小鼠后,经融合基因免疫的小鼠血中病毒滴度显著降低,生存率达50％,而pcDNA3／sVP1组仅为25％,pcDNA3组无存活。结论 C3d可以显著增强sVPI基因免疫诱导的特异性免疫应答。     

CVB3-VP1基因与IL-15双表达质粒的构建

目的构建IL-15/CVB3-VP1的基因双表达重组质粒。方法从人胚肺二倍体细胞中提取IL-15的mR-NA,逆转录后将产物与pGEM-Teasy载体连接,转化DH5a大肠杆菌,筛选重组子并提取质粒进行酶切鉴定和测序。取双酶切的目的基因片断,与经过同样两种酶切的pcDNA3载体连接,经过转化、筛选和酶切鉴定后,构建成真核表达重组质粒PcDNA3-IL-15。用自行设计的引物从PcDNA3-VP1质粒上扩增出带有启动子的VP1基因,插入到PcDNA3-IL-15质粒上,构建成真核重组质粒PcDNA3-IL-15/CVB3-VP1。结果构建的PcDNA3-VP1/IL-15重组质粒目的基因与CVB3-VP1和IL-15的标准序列相同。结论成功构建了柯萨奇病毒VP1基因和人白细胞介素15基因双表达质粒PcDNA3-IL-15/CVB3-VP1。     

分子佐剂C3d增强人绒毛膜促性腺激素β基因避孕疫苗的免疫效应及转变免疫应答模式的研究

目的　研究分子佐剂C3d能否增强人绒毛膜促性腺激素 (hCG) βDNA疫苗的免疫原性 ,并转变Th1/Th2型免疫应答模式。方法　抽提纯化pcDNA3、pcDNA3 hCGβ、pcDNA3 hCGβ C3d3、pCMV4 hCGβ C3d34种质粒。将 12只 6周龄BALB/c雌性小鼠分为 12组 ,A1～ 3组各 6只以pcDNA3免疫 ,作为空白对照组 ;B1～ 3组各 6只以pcDNA3hCGβ免疫 ,作为阴性对照组 ;C1～ 3组各 6只以pcDNA3 hCGβ C3d3免疫 ,作为实验 1组 ;D1～ 3组各 5只以pCMV4 hCGβ C3d3免疫 ,作为实验 2组。免疫前 1周 ,于小鼠左后腿肌肉注射 0 2 5 %普鲁卡因 0 1ml。 1周后 ,在相同部位分别肌注前述 4种质粒 ,剂量分别为 :5pmol(A1～D1组 )、10pmol(A2～D2组 )、2 0pmol(A3～D3组 )。 3周后 ,再次给予相同剂量质粒加强免疫。于第 2次免疫后 3周 ,处死小鼠。用ELISA法测定外周血抗hCGβ抗体效价和经hCG抗原体外刺激脾细胞培养上清中Th1型 (IL 2、INF γ、TNF α) /Th2型 (IL 4、IL 10 )细胞因子分泌水平。结果　C3d分子佐剂能明显提高抗hCGβ抗体滴度。当免疫剂量为 2 0pmol时 ,与B3组比较 ,C3组抗hCG抗体最大效价达到 1∶4 5 0 ,提高了 9倍。D3组抗hCG抗体最大效价达到 1∶12 15 0 ,提高了 2 4 3倍。D3组与C3组相比较 ,抗hCG抗体水平提高了 2 7倍。受