介绍两种应用于基因工程的PCR技术

自1985年利用多聚酶链反应(PCR)进行DNA体外扩增以来,PCR技术已有了迅速的发展。1988年开始用来自嗜热细菌的耐热DNA多聚酶代替了来自大肠杆菌DNA多聚酶的Klenow片段,使PCR的若干次循环只须一次加酶便能完成。这一改进使PCR技术真正走上了实用道路。此后。PCR技术便在生命科学和医学的各个领域中得到广泛应用。     

原位PCR技术及其应用

多聚酶链反应(PER)已广泛应用于扩增特定的DNA序列,从而能对许多疾病进行分子水平的分析。PCR虽然能扩增包括经福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA,但扩增的DNA产物不能在组织细胞中定位,因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系,这是该技术的一个局限性。原位杂交     

生物医学检测的PCR技术及其应用

聚合酶链反应或多聚酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)检测技术,又称体外基因扩增技术,最早由美国Cetus公司的Kary Mullis及其同事于1985年发现并研究成功.它是通过聚合酶促寡核苷酸引物的延长,反复循环,使目的DNA成指数扩增,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法,也是体外酶促合成特异DNA片段的新方法.经过PCR过程,可在数小时内使几个拷贝的DNA序列扩增107-109倍.它已广泛应用于基因分离、基因克隆、核酸序列分析和测序,应用于研究基因表达和调控、基因多态性分析以及探讨基因与疾病等生物医学体外检测的各个领域.     

应用DNA PCR法扩增检测苯丙酮尿症基因突变

DNA体外扩增是近年来分子遗传学与分子生物学发展起来的高效DNA分析技术．多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是在一个简单的试管体系中，利用人工合成的与特异突变点两侧DNA序列互补的两寡核苷酸引物，通过DNA变性、退火、引物延冲反应这样数十个循环后，目的区域的DNA可扩增百万倍，从而提高了DNA分析的灵敏度，     

特异DNA的扩增技术

多聚酶链反应可在短时间内在试管中合成数百万特异DNA序列的拷贝,来源于Thermus aquaticus的热稳定DNA多聚酶使这一技术得到了改进。近年来,在遗传性疾病与传染性疾病的临床诊断中,特异的核苷酸序列分祈的重要性日益增加。多聚酶链反应(PCR)是一种由引物介导的特异     

应用PCR法从血凝块和干血样品中检测基因突变

为适应流行病学调查,探讨从血凝块或干血样中提取DNA样品,应用PCR扩增DNA片段的方法技术极其必要。本文详细叙述了用人血凝块和干血样品提取DNA模板,通过固定、煮沸等步骤,可以应用多聚酶链反应体系得到目的基因的扩增片段,经电泳分离可以检测载脂蛋白的基因变异。本方法简便、省时、快速。     

石蜡包埋乳腺癌组织中用荧光差别多聚酸链反应检测erbB2基因扩增

作者基于差别多聚酶键反应（D－PCR）和荧光DNA技术已发展了一种迅速的非放射性方法，为了在人类肿瘤标本库中定量检测ERBβ2基因扩增。来自ERBβ2基因和来自单拷贝参照基因序列同时用PCR扩增，其中每对引物中有一个用荧光标记。PCR产物在自动荧光DNA测序仪上，在激光激活发光后用适当的软件扫描直接定量。这种荧光差别多聚酶链反应（FD－PCR）法被用来定量检测195列甲醛固定、石腊包理乳腺癌组织中的ERBβ2基因扩增，其中52例（26％）发现有ERBβ2基因扩增，并与肿瘤大小、缺乏雌激素受体（ER）和PS2表达有显著相关，但与孕…     

cDNA选择性扩增及直接定序的简易方法

多聚酶链反应(PCR)为基因组DNA或mRNA的表达突变或序列改变提供了一种快速简便的方法。为研究鼠体细胞在cAMP依赖的蛋白激酶中亚单位的调节,作者建立了特异性扩增mRNA序列和对所扩增DNA进行定序的简易方法。鼠淋巴瘤细胞(S49)mRNA以进一步分离:     

锚定PCR技术

Saiki等于1985年首创的多聚酶链反应(PCRpolymerase chain reaction)能够将微量DNA在体外迅速进行扩增。与目的基因片段侧翼顺序(flan-king sequence)互补的引物在Taq酶及4种脱氧核苷三磷酸的作用下延伸;新合成的片段又可作为模板。如此反复进行,使目的基因迅速得的扩增。PCR技术一经问世,迅速得到广泛应用。但在用于     

Bloom综合征细胞中DNA连接酶Ⅰ的活性变化

DNA连接酶Ⅰ和DNA多聚酶α在DNA复制中起作用,DNA连接酶Ⅱ和DNA多聚酶β在DNA修复中起作用。已报     

应用PCR技术对β地贫症进行基因诊断

本文应用DNA体外多聚酶链反应基因扩增新技术,结合斑点杂交,检测基因点突变的直接、快速、简便方法,对4例受试者进行了β地中海贫血症的基因分析和产前基因诊断。     

人白细胞介素10重组腺病毒载体的构建

目的构建人白细胞介素 10重组腺病毒载体 ,为真核表达及其临床研究提供实验基础。方法自行设计一对引物 ,应用逆转录多聚酶链式反应 ( RT- PCR )技术 ,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出 h IL - 10 c DNA,并将h IL - 10 c DNA克隆到腺病毒载体 p Ad CMV - L ink1中 ,构建 p Ad CMV/ h IL - 10表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒p JM17共转染 2 93细胞 ,通过同源重组产生 h IL - 10重组腺病毒。结果扩增到的 c DNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序最终确定为 h IL- 10 c DNA;所得人白细胞介素 10重组腺病毒滴度为 1.9× 10 9pfu/ m L。结论本实验为今后研究 h IL- 10的生物学活性及炎症性疾病的基因治疗提供了基础     

应用多聚酶链反应技术检测疟原虫的初步研究

根据编码恶性疟原虫(P．f)红细胞结合抗原(EBA-175)的部分DNA片段和间日疟原虫(P．v．)小亚基核糖体RNA基因序列设计合成恶性疟原虫和间日疟原虫的特异性引物各一对并进行多聚酶链反应(PCR)检测恶性疟和间日疟病人标本。扩增产物经琼脂糖电泳分析，可见在P．f.样本中扩增出特异的492bp大小的DNA片段，P．v．样本中扩增出特异的714bp大小的DNA片段。而在健康人血的白细胞、伯氏疟原虫样本和食触猴疟原虫样本中均不能扩增出以上片段。其结果与镜检符合率分别达95％和93.3％以上，表明该方法是一种特异、敏感的检测方法。     

应用抗DNA多聚酶αMcAb鉴定结肠癌增殖细胞

近年来,对消化器官癌也采用了各种免疫组化方法检测其细胞增殖能力,其中DNA 多聚酶α是参与DNA 复制的酶,在增殖期细胞的核内出现,Masaki氏(1982)制成了抗DNA 多聚酶αMcAb,并利用此抗体鉴定子宫癌等的增殖细胞。本文应用抗此酶α鼠McAb 鉴定大肠癌的增殖细胞。作者采取大肠正常粘膜、大肠腺癌6例及结肠癌38例病变组织,用OCT 混合物冷冻包埋,制成6μm 的切片,再以PFA(para-     

PCR技术检测活检组织中结核杆菌DNA

ＰＣＲ技术检测活检组织中结核杆菌ＤＮＡ赵跃武银平章刘正国郝远瑞徐纪跃党伟一作者单位：河南省人民医院病理科，郑州４５０００３多聚酶链反应（ＰＣＲ）是一项有效的体外ＤＮＡ扩增技术，尤在病原体检测方面。在一些可疑的活检石蜡切片中，有时也需要借助于该技术来协...     

周期素/增殖细胞核抗原在DNA修复合成中分布的变化

现已证明增殖细胞核抗原(PCNA)和周期素完全相同,此蛋白质存在于正常增殖细胞和转化细胞中,周期素/PCNA的合成受细胞周期的调节, DNA复制期它的浓度迅速增高,而静息期细胞仅表达很少量的周期素/PCNA。最近有报告发现周期素/PCNA为SV_(40)DNA体外复制所必需而且周期素/PCNA本身就是一种DNA多聚酶δ的铺助蛋白。该辅助蛋白能增强DNA多聚酶δ利用模板的能力,间接说明周期素/PCNA在DNA合成中起重要作用。     

一种鉴别差异表达基因的新方法——cDNA示差分析技术

cDNA示差分析技术是继mRNA差显示技术之后又一种鉴别差异表达基因的方法。该技术利用双链DNA模板在PCR时呈指数扩增,而单链DNA模板为线性扩增的原理,先用常见的限制性内切酶将实验组与对照组消化成平均长度为256bp的cDNA片段。再用PCR技术使两组的cDNA片段富集,随后进行3次差减杂交去除共有基因,最后扩增实验组中的特异表达的基因。本文概述了该技术的原理、基本方法及其应用前景。     

人类因子IX基因缺陷的研究

本实验对同一家系3例血友病乙男患者进行因子IXI基因缺陷的研究,应用多聚酶链反应扩增因子IX基因外显子2的338bp DNA片段,扩增产物行单链构型多态性(SSCP)检查,发现三例均出现多态性变化.纯化该三例PCP扩增产物DNA,并行双链DNA直接荧光自动测序,发现三例都在6364位发生碱基替换,C(CGG)→T(TGG),该基因点突变改变了正常FIX的结构和凝血功能,因而导致血友病乙.该研究对揭示血友病乙分子缺陷的发生机制有重要意义,并有助于血友病.乙携带者的检查和产前基因诊断,而且对血友病己患者的基因治疗有直接指导意义.     

免疫PCR:通过特异性抗体-DNA缀合物高敏感性检测抗原

多聚酶链反应(PCR)技术已成为一种分子生物学和基因工程的有力工具,将PCR技术应用于抗原检测,建立了一种称为免疫PCR的抗原检测系统,该系统采用一种特异性抗体-DNA缀合物来检测抗原.免疫PCR方法的原理是通过应用一个对DNA和抗体具有双重结合活性的连接分     

DNA Ladder的制备

背景：目前,制备DNA分子量标准的方法主要有2种,一种是用限制性内切酶消化某种DNA,另一种是利用PCR扩增,2种方法各有优缺点。在前期采用PCR技术在前期扩增100~500 bp片段的基础上,实验室又成功扩增出600~1 000 bp片段,PCR产物经过纯化,混匀,制备的DNA Ladder,结果制备DNA Ladder的条带清晰,易于识别,可完全与公司商品化的DNA Ladder 相比,完全可用于分子生物学实验。 目的：利用PCR扩增技术制备DNA分子量标准参照物。 方法：自行构建了一种特殊适宜扩增的质粒pUC-DNA,根据pUC-DNA的基因序列,利用primer5.0设计能特异扩增100~ 1 000 bp 的PCR引物。PCR扩增出100~1 000 bp大小的DNA片段,在2%琼脂糖凝胶中电泳观察结果。用凝胶回收试剂盒回收目的PCR 产物,测序结果与pUC-DNA上基因序列进行序列比对,Blast进行同源性分析。将PCR产物用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,按比例混匀,即可使用。 结果与结论：利用PCR技术能够成功扩增出100~1 000 bp 条带,片段大小与预期结果相符,片段序列与GenBank序列完全一致,利用回收片段制备的DNA Ladder 条带清晰,可与同类产品相比。